CN106755593B - 一种hpv分型检测的核酸组合及其应用和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HPV分型检测的核酸组合及其应用和试剂盒，属于基因检测技术领域。本发明提供的HPV分型检测的核酸组合用于检测HPV 16亚型的第一核酸组合和用于检测HPV 18亚型的第二核酸组合。第一核酸组合包括SEQ ID NO.1‑2所示的第一引物对和SEQ ID NO.3所示的第一捕获探针。第二核酸组合包括SEQ ID NO.4‑5所示的第二引物对和SEQ ID NO.6所示的第二捕获探针。该核酸组合以PCR和EFIRM技术为基础，能够高灵敏地、高特异性地检测出样本中的HPV亚型类别，其具有检测耗时短、检测成本低等特点，可适用于大量的临床检测和大规模的流行病学筛查。

Description

一种HPV分型检测的核酸组合及其应用和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种HPV分型检测的核酸组合及其应用和试剂盒。

背景技术

宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一，已有研究表明，高危型人乳头瘤病毒(Human Papilloma virus，HPV)持续感染及多重感染是导致宫颈癌变的重要原因之一，全球范围的研究结果显示，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型HPV DNA的存在。

已经发现的HPV有200多种型别，主要包括低危型和高危型两大类。其中，HPV 16、HPV 18两种亚型是临床最常见的该两类型病毒在宫颈癌患者出现的概率最大。不同型别与不同疾病的相关性也不一样，低危型HPV感染可能会引起生殖道湿疣病变，高危型HPV感染则与宫颈癌、阴道癌相关。

目前，还缺乏针对HPV公认的有效治疗手段，因此宫颈HPV早发现、早预防是阻断癌变的关键，但是，现有的针对HPV分型检测的相关技术(包括传统的PCR检测技术、荧光定量检测技术、TCT技术、HC2检测技术等)存在操作方法繁琐，灵敏度或特异性低等缺点。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种HPV分型检测的核酸组合，该核酸组合能够常见的HPV 16和HPV 18两种亚型病毒进行检测，具有灵敏度高、特异性好、操作便捷、耗时短等特点。

本发明的第二目的在于提供上述的HPV分型检测的核酸组合在制备用于HPV分型检测的试剂盒中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种试剂盒，该试剂盒含有上述的HPV分型检测的核酸组合，其能够对常见的HPV 16和HPV 18两种亚型病毒进行检测，具有灵敏度高、特异性好、操作便捷、耗时短等特点。

本发明的第四目的在于提供上述的HPV分型检测的核酸组合在HPV分型检测中的应用。

本发明是这样实现的：

一种HPV分型检测的核酸组合，其包括用于检测HPV 16亚型的第一核酸组合和/或用于检测HPV 18亚型的第二核酸组合；

第一核酸组合包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO.3所示的第一捕获探针，第一引物对的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于结合第一催化酶的第一亲和物；

第二核酸组合包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物对和SEQ ID NO.6所示的第二捕获探针，第二引物对的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于结合第二催化酶的第二亲和物。

上述的的HPV分型检测的核酸组合在制备用于HPV分型检测的试剂盒中的应用。

一种试剂盒，其包括上述的HPV分型检测的核酸组合。

上述的HPV分型检测的核酸组合在HPV分型检测中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的HPV分型检测的核酸组合及其应用和试剂盒的有益效果是：

本发明的提供的HPV分型检测的核酸组合包括用于检测HPV 16亚型的第一核酸组合和/或用于检测HPV 18亚型的第二核酸组合。第一核酸组合包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对，用于进行PCR反应，将样本中的微量的靶核酸片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得大量的靶核酸片段，大大地增加了在后续EFIRM技术平台上的待测模板的数量，进而大大地提高了检测灵敏度。再将PCR扩增得到的PCR产物(含靶核酸片段)用到EFIRM技术平台上，通过第一捕获探针与靶核酸片段的杂交、进行特异性结合，实现检测HPV 16亚型目的。用于检测HPV 18亚型的第二引物对和第二捕获探针的检测原理和效果同第一引物对和第一捕获探针。

由于杂交效率受错配碱基的影响明显，只有靶核酸片段与两条引物、捕获探针同时准确配对后才能有检测信号，即需要两次特异性识别结合(而现有的检测技术通常只有一次特异性识别)，这大大提高了检测的特异性。所以，本发明的提供的HPV分型检测的核酸组合通过特异性的引物和捕获探针的设计，结合PCR技术的扩增优势和EFIRM技术的特异性捕获特点，提高了检测的灵敏度和特异性，且具有操作便捷、耗时短等特点，其为检测HPV基因分析检测和制备相关检测试剂盒提供了一种新的思路和策略，还具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例5中的16亚型质粒的结构图；

图2为本发明实施例5中的18亚型质粒的结构图；

图3为本发明实施例5中的检测三份样本的结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的HPV分型检测的核酸组合及其应用和试剂盒，进行具体说明。

一方面，本发明提供的HPV分型检测的核酸组合，其包括：用于检测HPV16亚型的第一核酸组合和用于检测HPV 18亚型的第二核酸组合。

其中，第一核酸组合包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对(SEQ ID NO.1为上游引物，SEQ ID NO.2为下游引物)和SEQ ID NO.3所示的第一捕获探针。第一引物对的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于结合第一催化酶的第一亲和物。

需要说明的是，第一引物对和第一捕获探针均根据HPV 16亚型基因的保守区域E7区(不同亚型的HPV的E7区差异较大)进行设计，第一捕获探针的碱基序列选自于第一引物对所扩增的区域，确保了第一捕获探针能够与第一引物对的扩增产物进行互补配对结合。第一引物对和第一捕获探针配套使用。

进一步地，另外，第二核酸组合包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物对(SEQ IDNO.4为上游引物，SEQ ID NO.5为下游引物)和SEQ ID NO.6所示的第二捕获探针。第二引物对的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于结合第二催化酶的第二亲和物。

需要说明的是，第二引物对和第二捕获探针均根据HPV 18亚型基因的保守区域E7区进行设计，第二捕获探针的碱基序列选自于第二引物对所扩增的区域，确保了第二捕获探针能够与第二引物对的扩增产物进行互补配对结合。第二引物对和第二捕获探针配套使用。

还需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的HPV分型检测的核酸组合可以仅包括第一核酸组合或第二核酸组合，可实现对HPV 16或HPV 18的分型检测。

进一步地，第一亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的一种；第二亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的一种。需要说明的是，第一亲和物和第二亲和物的类别可以相同，也可以不同。

生物素的作用在于与链霉亲和素标记的催化酶结合，地高辛可与地高辛抗体标记的催化酶结合，异硫氰酸荧光素可与异硫氰酸荧光素抗体标记的催化酶结合。在EFIRM技术平台上，再通过催化酶催化底物产生的电流释放检测信号，实现检测目的。

优选地，第一引物对的下游引物的5’端和第二引物对的下游引物的5’端均标记生物素。

本发明提供的HPV分型检测的核酸组合检测HPV基因型的原理如下。

使用EFRIM与PCR技术相结合的方法检测样本中的HPV16、HPV 18亚型病毒。根据HPV 16或HPV 18亚型基因(E7区)各设计一对特异性引物(第一引物对和第二引物对)和一条捕获探针(第一捕获探针和第二捕获探针)。其中，每个引物对中的一条引物的5’端使用生物素(用地高辛或异硫氰酸荧光素也可以)修饰，且生物素修饰的引物经PCR扩增后产生的扩增链即靶核酸片段上有部分区域与配套的捕获探针反向互补。通过结合EFIRM技术，靶核酸片段被捕获探针捕获，然后加入经亲和素(与引物5’端的修饰标记对应)修饰的催化酶，催化酶通过生物素-亲和素系统结合到靶核酸片段上，然后加入催化酶的底物，进行催化反应，产生电流信号，在EFIRM精准基因检测仪上检测出电流信号，根据电流信后的大小判断待测样本中的HPV的具体亚型即可。

其中，EFIRM的基本原理是利用超高灵敏度电化学检测方法特异捕获病毒基因片段，结合PCR扩增的样本前处理过程，可以以更高灵敏度检测样本中的病毒DNA信息。该检测方法使用的材料由核酸纯化试剂、PCR扩增试剂，96孔E-plate和杂交检测试剂组成，杂交检测试剂包括捕获探针反应试剂、样本杂交液、报告试剂、显色溶液、和洗涤溶液等试剂组成。检测时配合普通PCR仪和EFIRM精准基因检测仪完成。

再一方面，本发明提供了上述的HPV分型检测的核酸组合在制备用于HPV分型检测的试剂盒中的应用。该试剂盒包括上述的HPV分型检测的核酸组合。需要说明的是，核酸组合中的第一引物对、第二引物对、第一捕获探针和第二捕获探针可独立地以粉状形式存在，也可是以溶液的形式存在，或者其它形式存在，均可根据实际情况选择。

另一方面，本发明提供的一种试剂盒，其包括上述的HPV分型检测的核酸组合。需要说明的是，核酸组合中的第一引物对、第二引物对、第一捕获探针和第二捕获探针可独立地以粉状形式存在，也可是以溶液的形式存在，或者其它形式存在，均可根据实际情况选择。

进一步地，本发明提供的试剂盒还包括将上述的捕获探针(第一捕获探针或第二捕获探针)固定至检测孔板的固定物。固定物包括导电聚合物和离子化合物。导电聚合物选自吡咯、苯胺和噻吩中的一种，当然，导电聚合物也可以是其他的导电聚合物材料。离子化合物选自氯化钠和氯化钾中的任意一种。导电聚合物带正电，其在电场的作用下形成网状交联结构，被沉积在反应孔的底部，网状交联结构能够稳定地将捕获探针固定在底部，有助于提高捕获探针的稳定性和捕获能力。

进一步地，本发明提供的试剂盒还包括催化酶，催化酶是带有标记物的辣根过氧化物酶，优选地，催化酶是带有链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶。标记物用于与所述第一亲和物或所述第二亲和物结合。

当然，催化酶也可以是带有标记物的碱性磷酸酶，标记物为地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体或链霉亲和素中的任意一种，标记物与亲和物相对应，其可根据引物上的亲和物的类别进行选择。

当亲和物是生物素时，标记物为链霉亲和素；当亲和物是地高辛时，标记物为地高辛抗体；当亲和物是异硫氰酸荧光素时，标记物为异硫氰酸荧光素抗体。只要亲和物与标记物相对应，可相互结合即可。

进一步地，本发明提供的试剂盒还包括底物，底物的类别根据催化酶的类别选择。

当催化酶为辣根过氧化物酶时，底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基联苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)和OPD(o-Phenylenediamine、邻苯二胺)中的任意一种。TMB、ABTS和OPD均是辣根过氧化物酶的底物，在辣根过氧化物酶的催化作用下发生显色反应并伴随电流产生，有助于提高检测信号的释放。

当催化酶为碱性磷酸酶时，底物是对BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)和NBT(Nitrotetrazolium Blue chloride、四唑硝基蓝)的组合物、硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任意一种。

进一步地，本发明提供的试剂盒还包括清洗液，清洗液包括洗液A和洗液B，洗液A是含SDS的SSC缓冲液，洗液B是含Tween20的PBS缓冲液。

进一步地，本发明提供的试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg²⁺中的一种或多种。

进一步地，本发明提供的试剂盒还可包括检测孔板，检测孔板的反应孔内固定有上述捕获探针。需要说明的是，在其他的实施例中，捕获探针也可不用固定在检测孔板的反应孔内，在使用时采用相应方法将捕获探针固定至检测孔板也是可以的。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的HPV分型检测的核酸组合包括用于检测HPV 16亚型的第一核酸组合和用于检测HPV 18亚型的第二核酸组合。。

其中，第一核酸组合包括第一引物对和第一捕获探针。

第一引物对包括：

上游引物，其碱基序列为：5’-GAGCCCATTACAATATTGTA-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物，其5’端带有生物素标记，碱基序列为：Biotin-5’-GTCTTCCAAAGTACGAATGTCTACGTGTGTGCT-3’(SEQ ID NO.2)。

第一捕获探针的碱基序列为：

5’-CGCTTCGGTTGTGCGTACAA-3’(SEQ ID NO.3)

第一捕获探针与第一引物对所扩增出的第一靶核酸片段(SEQ ID NO.7)的互补链靶区域(5’-TTGTACGCACAACCGAAGCG-3’)反向互补。

另外，第二核酸组合包括第二引物对和第二捕获探针。

第二引物对包括：

上游引物，其碱基序列为：5’-AACATTTACCAGCCCGACGA-3’(SEQ ID NO.4)；

下游引物，其5’端带有生物素(Biotin)标记，其碱基序列为：

Biotin-5’-GGAACTGTCTGCTGAGCTTTCTACTACTAGCTCAATTCT-3’(SEQ ID NO.5)。

第二捕获探针的碱基序列为：

5’-TGTGTTGTAAGTGTGAAGCC-3’(SEQ ID NO.6)。

第二捕获探针与第二引物对所扩增出的第二靶核酸片段(SEQ ID NO.8)的靶区域(5’-GGCTTCACACTTACAACACA-3’)反向互补。

本实施例提供的HPV分型检测的核酸组合可用于检测出待测样本的HPV 16和HPV18两种亚型的病毒。其具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等特点。

实施例2

本实施例提供了试剂盒，该试剂盒包括上述实施例1提供的HPV分型检测的核酸组合。

本实施例提供的试剂盒可用于检测出待测样本的HPV 16和HPV 18两种亚型的病毒。其具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等特点。

实施例3

本实施例提供了试剂盒，该试剂盒包括上述实施例1提供的HPV分型检测的核酸组合，此外，还包括：PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg²⁺溶液。

本实施例提供的试剂盒可用于检测出待测样本的HPV 16和HPV 18两种亚型的病毒。其具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等特点。

实施例4

本实施例提供了试剂盒，该试剂盒包括上述实施例1提供的HPV分型检测的核酸组合，此外，还包括：PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺溶液、链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶、TMB、含SDS的2×SSC缓冲液以及含Tween20的PBS缓冲液、吡咯溶液、氯化钾溶液、杂交buffer。

本实施例提供的试剂盒可用于检测出待测样本的HPV 16和HPV 18两种亚型的病毒。其具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等特点。

实施例5

本实施例提供了采用实施例1提供的HPV分型检测的核酸组合检测待测样本中HPV亚型的具体方法，步骤如下。

1核酸提取：使用市售的病毒DNA提取试剂盒提取来自3个不同个体的HPV宫颈拭子样本，按说明书的步骤进行核酸提取，分别得到样本1、样本2和样本3的核酸模板。

2 PCR扩增

用实施例1提供的HPV分型检测的核酸组合中的第一引物对和第二引物对分别扩增样本1、样本2和样本3。

2.1 PCR反应体系(25μl)按表1中所列成分和用量进行配制，同时用含有第一靶核酸片段的16亚型质粒(质粒名称IG16100-2pGSI-16-500，大小3351bp,抗性为Amp，为高拷贝载体。其由含有第一靶核酸片段的基因片段正向克隆于pGSI载体的SmaI位点得到，如图1所示)和含有第二靶核酸片段的18亚型质粒(质粒名称IG16100-4pGSI-18-500，大小3351bp,抗性为Amp，为高拷贝载体。其由含有第二靶核酸片段的基因片段正向克隆于pGSI载体的SmaI位点得到，结构如图2所示)作为阳性对照。

表1.PCR反应体系的配制表

2.2将配制好的反应体系涡旋震荡混匀，离心，在PCR仪器(伯乐PCR仪T100)上扩增，扩增程序见表2。

表2.PCR反应的扩增程序

将得到的各样本对应第一引物对和第二引物对的PCR产物立即进行后续实验或4℃暂存。

3捕获探针(CP)固定

3.1配制吡咯(pyrrole)与捕获探针的混合液：取1个1.5mL离心管，依次加入超纯水885μl，100μl 3M KCl，涡旋震荡混匀，离心；加入5μl pyrrole，涡旋震荡混匀，离心；加入10μl 100μM CP(第一捕获探针或第二捕获探针)；涡旋震荡混匀后离心，分别得到第一捕获探针的混合液和第二捕获探针的混合液，备用。

3.2固定捕获探针

在6孔的检测孔板(E-plate，其结构和工作原理可见参考文献201620769829.2)上，实验设计：设置2个检测组，分别是16亚型组和18亚型组，每个检测组设置5个反应孔，其中一个反应孔作为阴性对照孔(重复4次)，一个作为阳性对照孔，另三个分别作为样本1、样本2和样本3的检测孔。根据实验设计，每个孔加入30μl的已配制好的pyrrole与捕获探针的混合液。16亚型组加入第一捕获探针的混合液，18亚型组加入第二捕获探针的混合液。

3.3 EFIRM电场处理

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：350mV，1s；电压B:950mV，1s；进行9个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗E-plate板。

3.4 E-plate板清洗

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，清洗液选择洗液A。清洗完毕，立刻进行下一步，样本上样操作。其中，洗液A为含0.05％(质量百分比)SDS的2×SSC缓冲液。

4 PCR产物杂交

4.1杂交buffer预处理

取杂交buffer(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，)平衡至室温。

4.2 PCR产物预处理

将由本实施例步骤2.2得到各PCR产物分别与杂交buffer按体积比1:10混合，涡旋振荡后离心，得到PCR产物预处理混合液。

4.3加样

根据实验设计，在E-plate上，在各检测组的反应孔里加入30μl的PCR产物预处理混合液。具体如下。

16亚型组：样本1、样本2和样本3的检测孔加入相应的由第一引物对扩增样本1、样本2和样本3得到的PCR产物预处理混合液，阳性对照孔中加入由第一引物对扩增16亚型质粒得到的PCR产物预处理混合液，阴性对照孔仅加入杂交buffer。

18亚型组：样本1、样本2和样本3的检测孔加入相应的由第二引物对扩增样本1、样本2和样本3得到的PCR产物预处理混合液，阳性对照孔中加入由第二引物对扩增18亚型质粒得到的PCR产物预处理混合液，阴性对照孔仅加入杂交buffer。

加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。

4.4 EFIRM电场处理

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：300mV，1s；电压B:500mV，1s；进行150个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗E-plate板。

4.5室温孵育

盖上E-plate盖子，实验台上室温孵育15min。

4.6 E-plate板清洗

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，清洗液选择洗液A。

5链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(Poly-HRP)与生物素结合

5.1 Poly-HRP溶液配制

从4℃冰箱取出稀释液(含酪蛋白的PBS缓冲液)，取1个1.5mL离心管，加入999μl的稀释液，加入1μl的酶液(含Poly-HRP，浓度为0.5mg/ml，购自thermo fisher,产品名称为Pierce^TM Streptavidin Poly-HRP，货号为21140，单位规格为0.5mL)，涡旋震荡混匀，离心，备用。

5.2加酶液

在对应的各孔加入上述稀释液和酶液混合后的混合液30μl，Poly-HRP通过其标记的链霉亲和素与PCR产物上的生物素识别并结合。

5.3室温孵育

盖上E-plate盖子，实验台上室温孵育15min。

5.4 E-plate板清洗

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(3bottom，3top)，清洗液选择洗液B。清洗完毕，立刻进行TMB加样操作。其中，洗液B为含0.1％(质量百分比)Tween20的PBS缓冲液。

6数据读取

6.1加底物

在对应的各孔加入底物60μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极。加完立刻到EFIRM上进行电场操作。其中，底物为含TMB的溶液(购自thermo fisher，产品货号为34028，名称为1-Step^TM Ultra TMB-ELISA)。加入酶的底物，发生氧化还原反应，产生电流，检测各孔内电流值即完成整个检测过程。

6.2 EFIRM电场读数

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：-200mV，60s；电压B:0mV，0s；进行1个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗E-plate板。

仪器将自动完成检测工作，检测数据自动上传到云计算平台。根据检测数据绘制柱状图，横坐标为检测组的类别，纵坐标为各检测组中各检测孔的电流值(Current)，单位为纳安(-nA)，“-”代表电流方向。本实施例的检测结果如表3和图3所示。

6.3结果说明

以阴性对照孔重复4次的电流平均值+3倍标准差的和作为阳性判定值，阳性判定值＝AVG+3×SD，其中AVG为阴性对照孔重复4次的电流平均值，SD为阴性对照孔重复4次的标准差。若加入有待测样本的检测孔的电流值大于或等于该阳性判定值，则判定位阳性结果，说明待测样本中含有相应的HPV亚型病毒。反之，则为阴性。

表3.采用实施例1提供的HPV分型检测的核酸组合检测三份样本的检测结果

根据表1中的数据可知，样本1的16亚型检测结果呈阳性，样本2和样本3均呈阴性，说明样本1含有HPV16亚型病毒(阴性对照电流值为33.29nA、其标准差为2.53，阳性对照电流值为619.30nA，样本1的电流值为546.55nA，样本2的电流值为34.03nA，样本2的电流值为29.16nA)；样本2的18亚型检测结果呈阳性，样本1和样本3的18亚型检测结果均呈阴性，说明样本2含有HPV18亚型病毒(阴性对照电流值为30.34nA、其标准差为2.85，阳性对照电流值为485.59nA，样本1的电流值为39.41nA，样本2的电流值为776.03nA，样本2的电流值为31.17nA)。

由此说明，实施例1提供的HPV分型检测的核酸组合能够实现对待测样本中的HPV的分型检测，能够检测出样本中的HPV 16亚型和HPV 18亚型两种亚型病毒。

综上，本发明提供的HPV分型检测的核酸组合具有以下优点：

(1)检测灵敏度高

PCR是一种体外DNA扩增技术，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得大量的特定目的基因片段。大大增加了EFIRM待测模板的数量，提高了检测灵敏度。

传统的探针固定方法是把探针的一端固定在平面支持物上，此方法由于探针表面的疏水性等原因会降低探针与待测靶标DNA的杂交效率。而本发明通过电荷吸附作用将捕获探针固定在聚吡咯孔内，可保证捕获探针具有超高活性；传统的核酸杂交过程通过控制杂交温度、盐离子、反应时间等提高杂交效率，本发明增加电场作为第四个控制条件，在电场的作用下提高了捕获探针对靶标DNA的捕获效率；本发明中通过测定HRP催化TMB氧化过程中产生的电子信号作为检测结果，由于酶的催化效率很高，间接地放大了杂交反应的结果，增加了测定方法的敏感度。瞬间靶标分子捕获、超高活性分子探针固定、捕获分子信号特异放大这三大核心技术保证了EFIRM方法具有超高的灵敏性。EFIRM与PCR技术相结合的检测技术，其灵敏度远高于巴氏涂片、TCT技术和HC2等技术，与聚合酶链反应和基因芯片等技术相当。

(2)检测特异性强

PCR反应的特异性决定因素为上下游引物与模板DNA特异正确的结合，而EFIRM技术则需要捕获探针与PCR扩增产物特异性结合，捕获探针长度在18-25bp之间，杂交效率受错配碱基的影响明显，只有待检测DNA与两条引物、捕获探针同时准确配对后才能有检测信号，大大提高了检测的特异性。

(3)操作简便、反应快速

PCR扩增过程仅需要普通的PCR仪即可完成，EFIRM技术中电场的引入降低了杂交过程中对反应时间的要求，加快了反应速率。

(4)成本低

首先，在检测设备方面，HPV较常用的检测技术是基于荧光定量方法，都采用荧光信号检测，检测设备需配备昂贵的荧光检测系统，荧光定量PCR仪市场售价都在数十万元左右。与之相比，PCR扩增过程仅需要普通的PCR仪即可完成，EFIRM平台采用独创的电场引导的释放与测量技术，检测过程利用电场作用，反应快速，最终结果以电信号的形式检测，因而设备的成本大幅降低。

其次，在检测试剂方面EFIRM技术基于核酸杂交的原理，采用独特设计的电化学技术。本发明中使用的核酸探针长度在20bp左右，选择于HPV亚型之间差异较大的E7区，采用人工合成寡核苷酸探针，引物中的一条采用较常见的Biotin修饰方法，另一条引物和捕获探针无需修饰，捕获探针的制备委托商业化的DNA化学合成公司完成，技术难度低，稳定性较好，成本低。以PCR为基础的荧光定量需要对探针进行两端修饰，且一端为荧光集团，合成成本较高；HC2使用的探针为全长的RNA探针，长度为7000-8000个碱基，制备工艺复杂，耗时多，成本很高，而且由于探针非常长，杂交效率受错配碱基的影响小，可能出现亚型间的交叉。因此检测试剂成本与其它技术相比大幅降低。

总之，本发明提供的以PCR和EFIRM技术为基础的HPV分型检测的核酸组合及其试剂盒具有灵敏度高、特异性强、检测耗时短、检测成本低等特点，适用于大量的临床检测和大规模的流行病学筛查。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京易活生物科技有限公司

<120> 一种HPV分型检测的核酸组合及其应用和试剂盒

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagcccatta caatattgta 20

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtcttccaaa gtacgaatgt ctacgtgtgt gct 33

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcttcggtt gtgcgtacaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacatttacc agcccgacga 20

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaactgtct gctgagcttt ctactactag ctcaattct 39

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtgttgtaa gtgtgaagcc 20

<210> 7

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gagcccatta caatattgta accttttgtt gcaagtgtga ctctacgctt cggttgtgcg 60

tacaaagcac acacgtagac attcgtactt tggaagac 98

<210> 8

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacatttacc agcccgacga gccgaaccac aacgtcacac aatgttgtgt atgtgttgta 60

agtgtgaagc cagaattgag ctagtagtag aaagctcagc agac 104

Claims (9)

1.一种HPV分型检测的核酸组合，其特征在于，其包括用于检测HPV 16亚型的第一核酸组合和用于检测HPV 18亚型的第二核酸组合；

所述第一核酸组合包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO.3所示的第一捕获探针，所述第一引物对的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于结合第一催化酶的第一亲和物；

所述第二核酸组合包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物对和SEQ ID NO.6所示的第二捕获探针，所述第二引物对的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于结合第二催化酶的第二亲和物。

2.根据权利要求1所述的HPV分型检测的核酸组合，其特征在于，所述第一亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的一种；所述第二亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的一种。

3.权利要求1或2所述的HPV分型检测的核酸组合在制备用于HPV分型检测的试剂盒中的应用。

4.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的HPV分型检测的核酸组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于将所述第一捕获探针或所述第二捕获探针固定至检测孔板的固定物，所述固定物包括导电聚合物和离子化合物；

所述导电聚合物为选自吡咯、苯胺和噻吩中的任意一种；

所述离子化合物为选自氯化钠和氯化钾中的任意一种。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括所述催化酶，所述催化酶是带有标记物的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，所述标记物用于与所述第一亲和物或所述第二亲和物结合，所述标记物为地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体以及链霉亲和素中的一种。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括所述催化酶的底物；

当所述催化酶为所述辣根过氧化物酶时，所述底物是TMB、ABTS和OPD中的任意一种；

当所述催化酶为所述碱性磷酸酶时，所述底物是BCIP和NBT的组合物、对硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐以及萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任意一种。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗液A和洗液B，所述洗液A是含SDS的SSC缓冲液，所述洗液B是含Tween20的PBS缓冲液。

9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg²⁺。

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