WO2016192252A1 - 系统性红斑狼疮生物标志物及其诊断试剂盒 - Google Patents

系统性红斑狼疮生物标志物及其诊断试剂盒 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a systemic lupus erythematosus peripheral blood DNA methylation marker and a diagnostic kit for systemic lupus erythematosus.
  • SLE Systemic lupus erythematosus
  • the clinical manifestations are damage to multiple organs such as the kidneys, nervous system, and blood system.
  • Early diagnosis before SLE patients with significant organ involvement is of great significance for the prevention and treatment of SLE, improving patients' quality of life, and improving patient survival.
  • most of the current biodiagnostic markers are biochemical and immunological changes that occur after organ damage, and cannot be diagnosed early in organ involvement in SLE patients.
  • Methylation of the CDlla and CD70 gene promoter regulatory sequences has been shown to be useful in the diagnosis of SL E.
  • this approach limits the level of CDla and CD70 gene methylation in the detection of peripheral blood CD4+ T cell genomes. This requires us to first collect more peripheral blood samples (about 20 ml), and then separate CD4 T cells from peripheral blood by density gradient centrifugation and immunomagnetic bead sorting. Because the patient's blood samples are taken more, the patient's medical ability is lower; and the experimental cost of CD4 + T ffl cell sorting is higher, and the experiment takes a long time, which increases the burden on the patient.
  • the object of the present invention is to overcome the deficiencies of the prior art methods and to provide a new highly sensitive and highly specific SLE patient, in view of the problem that the sensitivity or specificity of the traditional systemic lupus erythematosus laboratory test index is not high.
  • Peripheral blood DNA methylation markers and correspondingly provide a detection kit for the diagnosis of SLE with high sensitivity and specificity.
  • DNA methylation detection of 1500 bp upstream of the IFI44L gene transcription initiation site in peripheral blood cells of large sample SLE patients, healthy individuals, and rheumatoid arthritis patients confirmed the methylation of the two CG sites involved.
  • the level of chemotherapy was significantly lower in SLE patients than in healthy controls and rheumatoid arthritis patients.
  • the sensitivity and specificity of hypomethylation of these two CG sites for the diagnosis of SLE were high.
  • the DNA methylation marker of peripheral blood of a highly sensitive and highly specific SLE patient of the present invention is a DNA sequence within 1500 bp upstream of the transcription initiation site of the human IFI 44L gene, that is, located in the human genome No. 1 Chromosome 79, 085, 190-79, 085, 311 (Human genomic data hgl9 version), the DNA sequence of which is shown in SEQ ID NO.
  • the above DNA sequence contains two CG sites, and the methylation level thereof is significantly lower in peripheral blood cells of SLE patients than in healthy controls, and is also significantly lower than that in disease-controlled rheumatoid arthritis.
  • the invention also provides the use of a biomarker for a DNA sequence as defined in SEQ ID NO. 1 for the preparation of a SLE diagnostic reagent, the application comprising determining a DNA sequence as defined by SEQ ID NO. 1 in a peripheral blood cell of a subject. The methylation level of the two CG sites.
  • the target DNA fragment can be amplified by PCR and sequenced, and the sequencing result of the software can be used to determine the methyl group of the DNA sequence within 1500 bp upstream of the transcription start site of the IFI44L gene in the peripheral blood of the subject.
  • the level of chemistry includes the following steps: (1) extraction of peripheral genomic DNA from the subject; (2) determination of extracted genomic DNA concentration; (3) sulfite treatment of genomic DNA; (4) specific PCR primers Amplifying the DNA fragment to be tested; (5) detecting the PCR product by electrophoresis; (6) sequencing the PCR product; (7) analyzing the sequencing result to obtain the methylation level of the two CG sites contained in the sequence to be tested.
  • kits for SLE diagnosis comprising a set of PCR primers set forth in SEQ ID N0.2 and SEQ ID NO. 3 and as SEQ ID NO.
  • the sequencing probe shown in Figure 4 as well as any reagents or media required, such as peripheral blood cell genomic DNA extraction, DNA concentration determination, bisulfite treatment, PCR analysis, electrophoresis, pyrosequencing analysis.
  • the kit may further comprise one or more components selected from the group consisting of: deoxyribonucleoside triphosphates, buffers, stabilizers, thermostable DNA polymerases, and labels, including Fluorescent labels, chemiluminescent labels, and radioactive labels.
  • the detection of the methylation level of two CG sites of the sequence of SEQ ID NO. 1 by the present invention requires the design of a specific PCR primer to amplify the DNA fragment of SEQ ID NO. 1, which is based on the inclusion of the SEQ ID.
  • the DNA sequence of the target of NO.1 and the DNA sequence of the 200 bp nucleotide upstream and downstream of the sequence, the sequence of the bow is: upstream primer 5'-TGTGGATAGTGATAATTTGTTATAAAGTAA-3' (such as SEQ ID NO:
  • the downstream primer 5'-AACCTCATCCAATCTTAAAACACTTATA-3' (as shown in SEQ ID N0.3) and the 5' end of the downstream primer is labeled with biotin biotin.
  • the present invention is useful for the detection of the CG site methylation level in the DNA fragment of the pyrolysis acid sequencing target, and requires a special probe according to the SEQ ID of 1500 bp upstream of the transcription initiation site of the IFI44L gene.
  • the sequencing probe designed for the sequence of N0.1 has the sequence: 5'-AATGTTGTTATTTTATTTTAGATAG -3' (as shown in SEQ ID N0.4).
  • the present invention utilizes Illumina's DNA methylation chip (Illumina 450K) to screen for differential DNA methylation-modified genes in peripheral blood cells of SLE patients for the first time in the world.
  • Illumina 450K Illumina's DNA methylation chip
  • IFI44L is one of the most significant genes for DNA methylation changes in peripheral blood of SLE patients.
  • IFI44L belongs to the type I interferon pathway and is an interferon-inducing gene.
  • the type I interferon pathway plays an important role in the pathogenesis of SLE. Therefore, IFI44L can be used as a marker for SLE diagnosis.
  • the SLE diagnostic kit overcomes the shortcomings of the existing SLE detection technology method, and only needs to extract the peripheral blood of the patient not exceeding 1 ml, and finds the DNA methylation marker from the peripheral blood of the SLE patient, so Improve the patient's medical care.
  • the kit of the invention has high specificity and sensitivity, short inspection time, simple operation, small amount of specimens required, easy to be widely spread in clinical practice, and broad application prospect.
  • the use of a pyrophosphate sequencer with specific primers and probes can greatly shorten the inspection time of DNA methylation, greatly improving the efficiency of laboratory tests and the accuracy and specificity of the test results (all up to 90%). This new technology and product development and application will be of great significance for improving the diagnosis and treatment of SLE and improving the quality of life and survival of patients with SLE.
  • 1 is an electropherogram of a specific primer PCR amplification target DNA fragment (SEQ ID N0.1).
  • Figure 3 shows the difference in methylation of CG site 2 in SLE patients, healthy controls, and RA patients.
  • Figure 4 is a ROC plot of the methylation level of CG site 1 for SLE diagnosis (compared to healthy controls).
  • Figure 5 is a ROC plot of the methylation level of CG site 2 for SLE diagnosis (compared to healthy controls).
  • Figure 6 is a graph showing the methylation level of CG locus 1 for the ROC plot of SLE and RA differential diagnosis (compared to RA).
  • Figure 7 is a ROC plot of the methylation level of CG site 2 for differential diagnosis of SLE and RA (compared to RA)
  • the SLE diagnostic kit provided by the present invention is composed of the following components: (1) reagent for extracting whole blood DNA: proteinase K, cell lysate, washing buffer. elution buffer. adsorption column; (2) sulfurous acid Reagents required for salt treatment: dilution buffer, conversion buffer, binding buffer, washing buffer, desulfonation buffer, elution buffer; (3) reagents required for PCR: DNA polymerase, PCR reaction buffer, SEQ ID N0.2 and SEQ A set of PCR primers indicated by ID NO.3; (4) Reagents required for electrophoresis of PCR products: electrophoresis buffer and agarose; (5) reagents required for pyrosequencing: streptomycin-labeled agarose microspheres, denaturation Buffer, sequencing primer shown in SEQ ID N0.4, washcoat buffer; (6) Software for sequencing result analysis: PyroMark Q24 Application Software 2.0.
  • the SLE diagnostic kit is composed of the following components: (1) reagent for extracting whole blood DNA: proteinase K, cell lysate, washing buffer, elution buffer, adsorption column; (2) sulfurous acid Reagents required for salt treatment: dilution buffer, conversion buffer, binding buffer, washing buffer, desulfonation buffer, elution buffer; (3) reagents required for PCR: DNA polymerase, PCR reaction buffer, SEQ ID N0.2 and SEQ A set of PCR primers indicated by ID NO.3; (4) Reagents required for electrophoresis of PCR products: electrophoresis buffer and agarose; (5) reagents required for pyrosequencing: streptomycin-labeled agarose microspheres, denaturation Buffer, sequencing primers shown in SEQ ID N0.4, wash buffers; (6) Software for sequencing results analysis: PyroMark Q24 Application Software 2.0.
  • Example 2 Application of SLE diagnostic kit and detection of DNA methylation level in peripheral blood of patients with SLE
  • Step 1 SLE patient peripheral blood genomic DNA extraction
  • Step 2 Determination of extracted genomic DNA concentration
  • Step 4 Amplification of the DNA fragment of interest and sequencing
  • Primers were designed using PyroMark Assay Design 2.0 software.
  • a DNA sequence comprising the nucleotide sequence of interest shown in SEQ ID NO. 1 and a 200 bp nucleotide upstream and downstream of the sequence is introduced into the software.
  • a specific PCR primer was obtained, the upstream primer was 5'-TGTGGATAGTGATAATTTGTTATAAAGTAA-3' (as shown in SEQ ID N0.2), and the downstream primer was 5'-AACCTCATCCAATCTTAAAACACTTATA-3' (as shown in SEQ ID N0.3), downstream primer
  • the 5' end is labeled with biotin biotin, which amplifies a PCR product containing the DNA sequence of interest, 355 bp in length.
  • the designed sequencing probe sequence is: 5'-AATGTTGTTATTTTATTTTAGATAG-3' (as shown in SEQ ID N0.4).
  • the denaturing solution, the sequencing primer of ⁇ , the sequencing probe DNA sequence is 5'-AATGTTGTTATTTTATT TTAGATAG-3', as shown in SEQ ID N0.4. 50ml Wash Buffer (45ml H 2 0 + 5ml Wash Buffer
  • the specific steps of the vacuum workstation operation are: (1) Ensure the correct and firm assembly of the Q24 vacuum workstation, preheat the 24-well plate base (80 ° C), wash the trough, fill the trough (50 ml 70% ethanol, 40 ml denaturing solution, 50 ml of washing buffer, 50 ml and 70 ml of high purity water), the vacuum pump was turned on, the vacuum switch was turned on, and a vacuum was applied to the vacuum apparatus.
  • Sequencing primer annealing in the well plate Using a Pyromark Q24 well plate base and a padded block without padding the Pyromark Q24 plate containing the sample to 80° (:, for 2 min, from the well plate base Remove the well plate and allow the sample to cool at room temperature (15-25 ° C) for at least 5 minutes. The plate can then be processed in the Pyro mark Q24 instrument.
  • Pyromark Gold Q24
  • Sequencing reagent preparation Snoring the Pyromark Gold Q24 kit, taking out the vial containing the enzyme and substrate lyophilized powder, and the tube containing the nucleotide. Calculate the required reagent volume according to the manual provided with the reagent instrument, and fill the Pyromark Q24 reagent. warehouse.
  • Pyromark Q24 Put the reagent chamber and Pyromark Q24 plate into the instrument, and insert the U disk that has been running the program into the USB port. Select the run by the up and down keys, select ok, and the display prompts you to select U. In the program on the disk, press select to select the running program that needs mn. The instrument will prompt whether you want to run this program. After confirming the error, select ok and run. After the instrument is running, the result will be saved automatically to the USB flash drive. Select shutdown and then turn off the power. Then clean the reagent compartment and dry it.
  • Step 5 Analysis of the methylation level of the DNA sequence of interest by sequencing results
  • Example 3 Test for sensitivity and specificity of the SLE diagnostic kit of the present invention
  • the area under the ROC curve actually ranges from 0.5 to 1, and is generally considered to be :
  • the diagnostic value is lower when the area under the ROC curve is between 0.5 and 0.7, the diagnostic value is moderate between 0.7 and 0.9, and the diagnostic value is higher at 0.9 or higher.
  • the CG site 1 methylation level differentiates the specificity of SLE patients from healthy controls by 96.10895% and sensitivity by 91.67513% (as shown in Figure 4); CG site 2 methylation levels distinguish the specificity of SLE patients from healthy controls.
  • CG site 1 methylation level distinguishes the specificity of SLE patients from RA patients 83.7254 1 .
  • the sensitivity was 89.44162% (as shown in Figure 6); the CG site 2 methylation level differentiated the specificity of SLE patients from R ⁇ patients by 89.80392% » sensitivity 82.53807% (as shown in Figure 7).
  • the SLE diagnostic kit overcomes the deficiencies of the existing SLE detection technology method, and only needs to extract the peripheral blood of the patient not exceeding 1 ml, and finds the DNA methylation marker from the peripheral blood of the SLE patient, so Improve the patient's medical care.
  • the kit of the invention has high specificity and sensitivity, short inspection time, simple operation, small amount of specimens required, easy to be widely spread in clinical practice, and broad application prospect.
  • the use of pyrosequencing instruments combined with specific primers and probes can greatly shorten the inspection time of DNA methylation, greatly improving the efficiency of laboratory tests and the accuracy and specificity of the test results (all can reach more than 90%) ).
  • This new technology and product development and application will be of great significance for improving the diagnosis and treatment of SLE and improving the quality of life and survival of patients with SLE.

Abstract

本发明公开了一种系统性红斑狼疮生物标志物及其诊断试剂盒。本发明所述的系统性红斑狼疮生物标志物是人IFI44L基因转录起始位点上游1500bp内的一段，即chr1：79,085,190-79,085,311（hg19），其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的系统性红斑狼疮诊断试剂盒包含序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物，以及序列如SEQ ID NO.4所示的探针。

Description

说明书 发明名称：系统性红斑狼疮生物标志物及其诊断试剂盒 技术领域
[0001] 本发明涉及一种系统性红斑狼疮外周血 DNA甲基化标志物以及一种用于系统性 红斑狼疮的诊断试剂盒。
背景技术
[0002] 系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus , SLE) 是一种多器官、 多系统 受累的自身免疫性疾病。 临床表现为肾脏、 神经精神系统、 血液系统等多器官 受损。 如果能够在 SLE患者出现重要器官受累前进行早期诊断对于 SLE的防治、 改善患者的生活质量、 提高患者生存率具有重大意义。 然而， 目前的生物学诊 断标志物大多是在器官受损后出现的生化和免疫学改变， 无法对 SLE患者器官受 累进行早期诊断。
技术问题
[0003] 近年来， 表观遗传学标记物研究发展迅速， 许多表观遗传标志物如 DNA甲基化 标记物、 血清 microRNA标记物被筛选和鉴定， 这些标记物对于疾病的早期诊断 和预后判断具有重要价值。 已有大量文献证实 DNA低甲基化在 SLE患者 CD4 +T 细胞异常活化及 SLE发生发展中发挥重要的作用。 目前， 已经鉴定的在 SLE患者 CD4 +T细胞中发生低甲基化的基因包括 CDl la、 CD70、 CD40L和 Perforin等。 这 些基因的低甲基化导致其过度表达， 从而诱导 T细胞自身反应性活化， 导致 SLE 发生。 其中 CDlla和 CD70基因启动子调控序列的甲基化已经被证明可以用于 SL E的辅助诊断。 然而， 这种方法限制在检测外周血 CD4 +T细胞基因组中的 CDl la 和 CD70基因甲基化水平。 这就要求我们首先要收集较多的患者外周血样本 （约 2 0ml左右） ， 然后利用密度梯度离心法和免疫磁珠分选法分离外周血中的 CD4 T 细胞。 由于抽取患者血液样本较多， 患者的医从性较低； 而且 CD4 +T ffl胞分选 的实验成本较高、 实验耗时较长， 增加了患者的负担。 另外， 检测 CDlla和 CD7 0基因甲基化以往釆用克隆测序法、 自制芯片法， 耗时较长， 且无法给出一个糈 确的甲基化定量水平， 给临床上推广应用带来了困难。 [0004] 目前临床上尚无一种高敏感性高特异性的 SLE诊断指标， 即使是自身抗体如抗 ANA抗体， 其对 SLE的诊断敏感性为 95%， 但诊断特异性相对较低 65%。 为此， 患者必须检査许多实验室指标联合辅助诊断 SLE， 导致疾病的诊疗成本大大增加 , 加重了患者的负担。 因此， 开发新的 SLE诊断标志物十分必要， 对提高 SLE的 诊疗水平具有重要意义。
问题的解决方案
技术解决方案
[0005] 本发明的目的在于针对传统的系统性红斑狼疮实验室检査指标灵敏度或特异性 不高的问题， 克服现有技术方法的不足， 提供一种新的高灵敏高特异性的 SLE患 者外周血 DNA甲基化标志物， 并相应提供一种用于诊断 SLE的灵敏度和特异性均 较高的检测试剂盒。
[0006] 发明人经过长期研究发现， 发生于基因组上的表观遗传学修饰在 SLE的发生、 发展中发挥重要作用， 一些异常的 DNA甲基化修饰可能作为 SLE早期诊断的标志 物。 通过对大样本 SLE患者、 健康人、 类风湿性关节炎患者外周血细胞中 IFI44L 基因转录起始位点上游 1500bp内的序列进行 DNA甲基化检测， 证实其包含的两 个 CG位点的甲基化水平分别在 SLE患者中较健康对照、 类风湿性关节炎患者显 著降低， 这两个 CG位点低甲基化用于诊断 SLE的灵敏度和特异性均很高。
[0007] 本发明所述一种高灵敏、 高特异性的 SLE患者外周血 DNA甲基化标志物是人 IFI 44L基因转录起始位点上游 1500bp内的一段 DNA序列， 即位于人类基因组 1号染 色体 79,085, 190-79,085,311段 （人类基因组数据 hgl9版本） ， 其 DNA序歹 U如 SEQ ID NO.l所示。
[0008] 上述 DNA序列包含两个 CG位点， 其甲基化水平在 SLE患者外周血细胞中较健 康对照显著降低， 与疾病对照类风湿性关节炎相比亦明显降低。
[0009] 本发明还提出 SEQ ID NO.l所定义 DNA序列的生物标记物在制备 SLE诊断试剂 中的应用， 该应用包括测定受试者外周血细胞中 SEQ ID NO.l所定义 DNA序列包 含的两个 CG位点的甲基化水平。
[0010] 具体来说， 可以通过 PCR扩增目的 DNA片段并测序后通过软件分析测序结果来 判断受试者外周血中的 IFI44L基因转录起始位点上游 1500bp内 DNA序列的甲基 化水平， 包括下述步骤： （1) 抽提受试者外周血全基因组 DNA; (2) 测定抽 提的基因组 DNA浓度； (3) 亚硫酸盐处理基因组 DNA; (4) 特异性 PCR引物 扩增待测 DNA片段； （5) 电泳检测 PCR产物； (6) 对 PCR产物进行测序； （7 ) 分析测序结果， 获得待测序列中包含的两个 CG位点的甲基化水平。
[0011] 本发明的另一目的还在于提供一种用于 SLE诊断的试剂盒， 该试剂盒包含 SEQ ID N0.2和 SEQ ID NO.3所示的一组 PCR引物以及如 SEQ ID N0.4所示的测序探针 ， 以及任意需要的试剂或介质， 如外周血细胞基因组 DNA抽提、 DNA浓度测定 、 亚硫酸氢盐处理、 PCR分析、 电泳、 焦磷酸测序分析。 具体来说， 所述试剂 盒可以进一步包括一种或多种选自由以下所组成的组中的成分： 脱氧核糖核苷 三磷酸、 缓冲剂、 稳定剂、 热稳定 DNA聚合酶和标记物， 包括荧光标记物、 化 学发光标记物和放射性标记物。
[0012] 本发明检测 SEQ ID NO.1序列两个 CG位点的甲基化水平需要设计特异性 PCR引 物扩增 SEQ ID NO.1所述 DNA片段， 弓 |物设计是根据包含 SEQ ID
NO.1所述目的 DNA序列及该段序列上下游 200bp核苷酸的 DNA序列设计， 弓 |物 序列为： 上游引物 5'-TGTGGATAGTGATAATTTGTTATAAAGTAA-3' (如 SEQ ID
N0.2所示） ； 下游引物 5'-AACCTCATCCAATCTTAAAACACTTATA-3' (如 SEQ ID N0.3所示） ， 下游引物的 5'端用生物素 biotin标记。 本发明用于焦憐酸测序检 测目的 DNA片段中的 CG位点甲基化水平需要特殊的探针， 根据 IFI44L基因转录 起始位点上游 1500bp内的 SEQ ID
N0.1所述序列设计测序探针， 序列为： 5'-AATGTTGTTATTTTATTTTAGATAG -3' (如 SEQ ID N0.4所示） 。
发明的有益效果
有益效果
[0013] 本发明利用 Illumina公司的 DNA甲基化芯片 （Illumina 450K) 在国际上首次筛 选 SLE患者外周全血细胞中差异 DNA甲基化修饰基因。 通过大规模临床样本筛査 、 利用最新的遗传学和表观遗传学检测技术， 寻找到 SLE患者的早期诊断标记物 , 建立相应的检测方法， 从而开发出 SLE早期诊断试剂盒。 通过与正常人外周血 样本相比， 发明人发现 IFI44L是 SLE患者外周血中 DNA甲基化改变最显著的基因 之一。 发明人通过扩大样本也进一步证实 SLE患者外周血细胞中 IFI44L基因起始 位点上游 1500bp内的一段序列 DNA甲基化水平较正常人和类风湿性关节炎 （RA ) 患者显著降低。 IFI44L属于 I型干扰素通路， 是一种干扰素诱导基因。 I型干扰 素通路在 SLE发病过程中起十分重要的作用。 因此， IFI44L可以作为 SLE诊断的 标志。
[0014] 本发明所提供的 SLE诊断试剂盒克服了现有 SLE检测技术方法的不足， 仅需要 抽取不超过 lml的患者外周血， 从 SLE患者外周血中找到 DNA甲基化标志物， 因 此显著提高患者的医从性。 本发明的试剂盒特异性和灵敏度高， 检査耗时短， 操作简单， 需要的标本量少， 易于临床上广泛推广， 应用前景广阔。 利用焦磷 酸测序仪配合特异性引物和探针可以大大缩短 DNA甲基化的检查时间， 大大了 提高实验室检査的效率和检查结果的准确性和特异性 （均可达到 90%以上） 。 该 项新技术和产品开发与应用将对于提高 SLE的诊治水平， 提高 SLE患者的生存质 量和生存率具有十分重要的意义。
对附图的简要说明
附图说明
[0015] 图 1为特异性引物 PCR扩增目的 DNA片段 （SEQ ID N0.1) 的电泳图。
[0016] 图 2为 CG位点 1的甲基化在 SLE患者、 健康对照和 RA患者中的差异。
[0017] 图 3为 CG位点 2的甲基化在 SLE患者、 健康对照和 RA患者中的差异。
[0018] 图 4为 CG位点 1的甲基化水平用于 SLE诊断的 ROC曲线图 （与健康对照相比） 。
[0019] 图 5为 CG位点 2的甲基化水平用于 SLE诊断的 ROC曲线图 （与健康对照相比） 。
[0020] 图 6为 CG位点 1的甲基化水平用于 SLE与 RA鉴别诊断的 ROC曲线图 （与 RA相比 ) 。
[0021] 图 7为 CG位点 2的甲基化水平用于 SLE与 RA鉴别诊断的 ROC曲线图 （与 RA相比
) 。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0022] 实施例 L SLE诊断试剂盒的制备 [0023] 本发明所提供的 SLE诊断试剂盒由以下部分组成： （1 ) 抽提全血 DNA的试剂 ： 蛋白酶 K、 细胞裂解液、 洗涤 buffer. 洗脱 buffer. 吸附柱； （2) 亚硫酸盐处 理所需试剂： 稀释 buffer、 转化 buffer、 结合 buffer、 洗涤 buffer、 脱磺化 buffer、 洗脱 buffer; (3) PCR所需试剂： DNA聚合酶、 PCR反应 buffer、 SEQ ID N0.2和 SEQ ID NO.3所示的一组 PCR引物； （4) PCR产物电泳所需试剂： 电泳 缓冲液和琼脂糖； （5) 焦磷酸测序所需试剂： 链霉素标记的琼脂糖微球、 变性 buffer, SEQ ID N0.4所示的测序引物， 洗漆 buffer; (6) 测序结果分析的软件 ： PyroMark Q24 Application Software 2.0。
发明实施例
本发明的实施方式
[0024] 以下为本发明的具体实施方式的详细阐述， 本发明实施例的描述不应理解为对 本发明的任何限制， 本领域技术人员根据本发明的技术内容所做出的各种变通 均属于本发明所保护的内容。 除非另有说明， 本文使用的所有技术术语具有本 发明所属技术领域普通技术人员通常知晓的意思。
[0025] 实施例 1 : SLE诊断试剂盒的制备
[0026] 本发明所提供的 SLE诊断试剂盒由以下部分组成： （1 ) 抽提全血 DNA的试剂 ： 蛋白酶 K、 细胞裂解液、 洗涤 buffer、 洗脱 buffer、 吸附柱； （2) 亚硫酸盐处 理所需试剂： 稀释 buffer、 转化 buffer、 结合 buffer、 洗涤 buffer、 脱磺化 buffer、 洗脱 buffer; (3) PCR所需试剂： DNA聚合酶、 PCR反应 buffer、 SEQ ID N0.2和 SEQ ID NO.3所示的一组 PCR引物； （4) PCR产物电泳所需试剂： 电泳 缓冲液和琼脂糖； （5) 焦磷酸测序所需试剂： 链霉素标记的琼脂糖微球、 变性 buffer, SEQ ID N0.4所示的测序引物， 洗涤 buffer; (6) 测序结果分析的软件 ： PyroMark Q24 Application Software 2.0。
[0027] 实施例 2: SLE诊断试剂盒的应用及 SLE患者外周血 DNA甲基化水平检测
[0028] 步骤 1 : SLE患者外周血基因组 DNA抽提
[0029] ( 1) 取 0.5ml全血至 1.5ml离心管， 然后加入 lml冰蒸馏水， 上下充分颠倒混匀 数次； （2) 室温静置 5min, 800g (3000rpm) 离心 5min; (3) 取出后弃上清， 加入 lxPBS 150ul后涡旋、 重悬细胞沉淀； （4) 加入 20ul蛋白酶 K,涡旋； （5) 加入 350ul Lysis Solution , 涡旋或颠倒混匀； （6) 56°C水浴 10min， 期间将样本 颠倒混匀 3次； （7) 水浴取出加入 180ul无水乙醇， 颠倒混匀、 点离； （8) 将混 合液转移到新离心吸附柱中， 6000g (8000rpm) 离心 lmin; (9) 将吸附柱转移 到新废液管； (10) 力口 500ul wash Buffer 1， 8000g(1000rpm)离心 lmin、 弃废液 ； ( 11) 力口 500ul wash Buffer 2， ≥20000g(≥14000rpm)离心 3min、 弃废液； （12 ) ≥20000g(≥14000rpm)空离心 lmin , 将吸附柱转移到新的 1.5ml离心管； （13) 加 80ul Elution
Buffer, 37°C静置孵育 2min; ( 14) 8000g(1000rpm)离心 lmin; (15) 收集基因 组 DNA。
[0030] 步骤 2: 测定抽提的基因组 DNA浓度
[0031 ] 釆用 Thermo Scientific公司的 NanoDrop 2000检测 , 吸取 1 μΐ DNA样本， 点样到 检测板上， 从仪器上读取样本的浓度。
[0032] 步骤 3: 亚硫酸盐处理基因组 DNA
[0033] ( 1) 根据 DNA浓度， 计算亚硫酸盐处理所需 DNA量 200ng的取样体积； (2) 加入无酶水、 DNA体积和 5ul M-Dilution Buffer的混合液共 50μ1反应液， 用 tip头吸 打混匀、 点离； （3) 将溶液置 37°C温箱孵育 15min; (4) 避光配制 Conversion Reagent(CT): 750ul无酶水 +210μ1 M-Dilution Buffer颠倒混匀、 涡旋至充分溶解 ； (5) 避光条件下加入 ΙΟΟμΙ Conversion Reagent(CT) , 混匀、 点离； （6) 将以 上反应体系置于 50°C水浴锅避光水浴 12-16h; (7) 将水浴过夜产物取出后放 0-4 °C冰箱 lOmin; (8) 准备好吸附柱并加入 400μ1的 M-Binding Buffer湿润吸附柱 ； (9) 将放置在 0-4°C冰箱里冷却的样本加入到吸附柱内， 盖上盖子颠倒混匀； (10) ≥10000g离心 30s ; (11) 加入 lOOul的 M- Wash Buffer, ≥10000g离心 30s， 弃废液； （12) 力 []200ul的 M- Desulphonation
Buffer至 20- 30°C温箱放置 18min; ( 13) ≥10000g离心 30s; ( 14) 力口 200μ1 M- Wash
Buffer, ≥10000g离心 30s ; ( 15) 重复上一步骤一次， 弃废液； （16) >10000g 离心 30s， 弃废液管； （17) 将吸附柱转移到 1.5ml新离心管中收集产物； （18) 加 ΙΟμΙ的 M-Elution Buffer,≥10000g离心 30s ; (19)重复上一步骤一次， 弃吸附柱 , 离心管内收集的即为亚硫酸盐处理后的 DNA。
[0034] 步骤 4： 扩增目的 DNA片段并测序
[0035] 具体包括：
[0036] 1 . 设计扩增目的 DNA片段的特异性 PCR引物和测序引物
[0037] 应用 PyroMark Assay Design 2.0软件设计引物。 将包含 SEQ ID NO.1所示目的核 苷酸序列及该段序列上下游 200bp核苷酸的 DNA序列输入软件。 获得特异性 PCR 引物， 上游引物为 5'-TGTGGATAGTGATAATTTGTTATAAAGTAA-3' (如 SEQ ID N0.2所示） ， 下游引物为 5'- AACCTCATCCAATCTTAAAACACTTATA-3' ( 如 SEQ ID N0.3所示） ， 下游引物的 5'端用生物素 biotin标记， 该引物可扩增出包 含目的 DNA序列的一段 PCR产物， 长度为 355bp。 检测目的 DNA序列中的两个 C G位点， 设计的测序探针序列为： 5'-AATGTTGTTATTTTATTTTAGATAG-3' ( 如 SEQ ID N0.4所示） 。
[0038] 利用特异性 PCR弓 I物扩增待测 DNA片段
[0039] PCR的反应体系见表 1 ; PCR反应的条件见表 2。
[0040] 表 1： PCR反应体系
[0041] [数]
Figure imgf000008_0001
[0042]
[0043] 表 2: 甲基化特异性 PCR反应条件
[0044]
Figure imgf000009_0001
[0045]
[0046] 3. PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测
[0047] ( 1) 配制电泳缓冲液 （50XTAE) ， 每次使用前用去离子水稀释成 lxTAE; 称 取低熔点琼脂糖 0.5g， 加 lxTAE 50ml， 置于微波炉中加热； （2) 凝胶在室温中 冷却至 50°C左右后， 加入溴乙啶 2.5μ1， 摇匀， 将凝胶倒入成样器， 室温下冷却 至完全凝固 （>60 min) ； (3) 轻轻拔除梳子， 放入电泳槽中， 加入 lxTAE, 使 液面高于胶面 l〜2mm; (4) 上样： 取 6 l PCR产物， 分别加入各加样孔， 在每 排的第一个孔加入 DNA mark; (5) 电泳： 采用恒压方式， 电压为 135V , 颜色 指示剂电泳至凝胶的 2/3处时终止电泳， 一般约需 25分钟； （6) 电泳结束后， 将 凝胶置于凝胶成像系统观察是否有明显特异的电泳条带， 如附图 1所示。
[0048] 使用焦磷酸测序仪对 PCR产物进行测序
[0049] ( 1) 首先， 准备试剂和上及样本； 50ml70%乙醇 （15ml+35ml) ， 40ml Denaturation solution
变性溶液， ΙΟμηι的测序引物， 测序探针 DNA序列为 5'-AATGTTGTTATTTTATT TTAGATAG-3', 如 SEQ ID N0.4所示。 50ml洗涤缓冲液 （45ml H 20 + 5ml Wash Buffer
) ， 洗干净的试剂仓 （每个最多三十次） ， 5管高纯水； (2) 配制混合液 Mix① ： 总体积 80μ1/孔： 40ul结合缓冲液 +2μ1微球 +18μ1高纯水 +20μ1ΡΟΙ产物 （最后加 ) ； (3) 配制混合液 Mix②: 10μΜχΧ μ1=0.3μΜχ25μ1χη (η为需检测样本数， 另 每加 10个则多配一个 Mix②） ， 计算出 X (需 10μΜ的测序引物） 的体积， 而 25μ1 χη-Χ μΙ为所需退火缓冲液 (Annealing Buffer)的体积； （4) 微球固定 PCR产物 （ 配置 Mix①及分配过程） ， 即链霉素包被琼脂糖微球， 使用前轻摇匀微球， 直至 获得均质溶液； （5) 在 EP管中混合微球 （2ul/样本） 与结合缓冲液 （40ul/样本 ) 添加高纯水； （6) 至 80ul/孔的总体积 （包括 PCR产物于第四步再加入到联排 管） 水量取决于 PCR产物的量； （7) 将第二步中制备的溶液添加至 24孔板或联 排管中； （8) 根据孔板设置， 添加 5-20ul (—般是 20ul) 优化好的生物素标记的 PCR产物至 PCR孔板 （或联排管中） 的每个独立孔槽 （总体积 80ul) ； (9) 加 盖， 确保孔槽之间没有泄漏； （10) 使用震荡混合器 （1400rpm) 不断震荡 PCR 孔板 （或联排管） ， 至少 5- 10分钟琼脂糖微球沉淀快速， 一般加 2个孔需摇匀一 次再继续加固定过程中， 准备好真空工作站进行样本制备； （11) 使用退火缓 冲液稀释测序探针至 0.3μΜ.稀释后测序弓 I物添加 25μΙ , 即 Mix②， 稀释好的测序 引物至待使用的 Pyromark Q24孔板的每个反应孔中 （在制备和移动孔板吋， 使 用提供的 Pyromark Q24孔板， 板底座之一作为支撑物） 。
其中， 真空工作站的操作具体步骤为： （1) 确保 Q24真空工作站正确和牢固的 装配， 预热 24孔板底座 （80°C) ， 洗槽子， 填充槽子 （50ml 70%乙醇， 40ml变 性溶液， 50ml洗涤缓冲液， 50ml及 70ml高纯水） ， 打开真空泵， 打开真空开关 , 在真空装置中施加真空。 （2) 探头至高纯水中， 加真空， 清洗过程中滤探针 , 用 70ml高纯水中洗探针， 确保水被转移至废液容器， 关闭真空装置上的真空 幵关， 并将其置于静止位 （P位） ， (6) 用 70ml高纯水重新填充试剂槽 5。 （3 ) 在 11.4.8固定样本及 11.5准备好 Pyromark Q24孔板的 Mix②后， 立即将 PCR孔板
(或联排管） 和 Pyromark Q24孔板放置到工作台上， 确保孔板位置与装载样本 吋的一致。 （4) 打开真空开关， 在真空装置中施加真空。 小心降下过滤探针至 PCR孔板 （或联排管中） 以捕获含有固定模板的微球， 保持 15s， 小心取出真空 装置 （琼脂微球沉淀迅速， 如果孔板或联排管振荡后放置超过 lmm , 则捕获前 再次振荡一分钟） ， 确保所有孔槽中的液体吸出并且所有微球都已被捕获到过 滤探针顶端， 70%乙醇的试剂槽中 5s。 (5) 洗脱缓冲液中 10s。 抬高真空装置超 过 90°C垂直 5s , 以过滤探针中排液， 持真空装置到 Pyromark Q24孔板时， 应关 闭装置上的真空开关 （OFF) ， 通过左右轻摇真空装置， 释放珠子至含测序引物 即探针的孔板中， 关闭真空开关 （OFF) ， 将真空装置转移至含有高纯水的试剂 槽中， 并振荡 10s， 降下探针于第二个含高纯水的试剂槽中并加真空清洗探针， 用 70ml高纯水冲洗过滤探针， 抬高真空装置 90°C垂直 5s , 以过滤探针中排液， 并 关闭真空装置， 将其置于静止位， 如一次超过一块孔板， 重新填充试剂槽， 重 复， 关闭真空泵。
[0051 ] 使用 Pyromark Gold Q24
测序的具体步骤为： （1) 孔板中测序引物退火： 使用 Pyromark Q24孔板底座和 一个加垫块未加垫含有样本的 Pyromark Q24孔板至 80° (：， 持续 2min,从孔板底 座上取下孔板， 使样本在室温 （15-25°C) 下冷却至少 5分钟， 此时孔板可在 Pyro mark Q24仪器中进行处理。 （2) Pyromark Gold Q24
测序试剂准备： 打幵 Pyromark Gold Q24试剂盒， 取出含有酶和底物冻干粉的小 瓶， 及含有核苷酸的试管， 依照与试剂仪器提供手册， 计算所需的试剂体积， 填充 Pyromark Q24试剂仓。 (3) Pyromark Q24上机： 将试剂仓及 Pyromark Q24 孔板放入仪器中， 同时将已经有运行程序的 U盘插入 USB接口， 通过上下键选择 run, 选择 ok， 显示屏提示是否选择你 U盘中的程序， 按 select选择需要 mn的运行 程序， 仪器会提示是否要运行此程序， 确定无误后选择 ok， 运行即可。 仪器运 行完会自动保存好结果到 U盘中， 按提示选择 shutdown然后关闭电源即可， 之后 洗干净试剂仓晾干。
[0052] 步骤 5: 通过测序结果分析目的 DNA序列的甲基化水平
[0053] 根据测序结果图， 直接读取软件 PyroMark Q24 Application Software 2.0给出的 数值， 判断两个 CG位点的甲基化水平。
[0054] 实施例 3: 本发明 SLE诊断试剂盒敏感性和特异性的检验
[0055] 利用实施例 2所述的方法检测 1056例 SLE患者、 587例健康对照、 553例类风湿 性关节炎 （简称 RA) 患者外周血 IFI44L基因转录起始位点上游 -1500bp内的 DNA 序列即 SEQ ID N0.1所包含的两个 CG位点的甲基化水平， 检测结果显示： 健康 对照组这两个 CG位点均呈高甲基化， SLE患者组两个 CG位点甲基化水平与健康 对照和 RA患者相比均显著较低 （如附图 2和附图 3所示） 。
[0056] 利用 ROC曲线评价统计量计算两个 CG位点甲基化水平在诊断 SLE中的敏感性和 特异性， ROC曲线下面积 （AUC) 实际的取值范围为 0.5〜1 , 而一般认为： 对于 一个诊断试验， ROC曲线下面积在 0.5〜0.7之间时诊断价值较低， 在 0.7〜0.9之 间时诊断价值中等， 在 0.9以上时诊断价值较高。 CG位点 1甲基化水平区分 SLE患 者与健康对照的特异性 96.10895%、 敏感性 91.67513% (如附图 4所示） ； CG位 点 2甲基化水平区分 SLE患者与健康对照的特异性 95.91440%、 敏感性 93.50254% (如附图 5所示） ； CG位点 1甲基化水平区分 SLE患者与 RA患者的特异性 83.7254 1。、 敏感性 89.44162% (如附图 6所示） ； CG位点 2甲基化水平区分 SLE患者与 R Α患者的特异性 89.80392%»、 敏感性 82.53807% (如附图 7所示） 。
工业实用性
[0057] 本发明所提供的 SLE诊断试剂盒克服了现有 SLE检测技术方法的不足， 仅需要 抽取不超过 lml的患者外周血， 从 SLE患者外周血中找到 DNA甲基化标志物， 因 此显著提高患者的医从性。 本发明的试剂盒特异性和灵敏度高， 检査耗时短， 操作简单， 需要的标本量少， 易于临床上广泛推广， 应用前景广阔。 利用焦磷 酸测序仪配合特异性引物和探针可以大大缩短 DNA甲基化的检査时间， 大大了 提高实验室检査的效率和检査结果的准确性和特异性 （均可达到 90%以上） 。 该 项新技术和产品开发与应用将对于提高 SLE的诊治水平， 提高 SLE患者的生存质 量和生存率具有十分重要的意义。
序列表自由内容
[0058] SEQUENCE LISTING
[0059]
[0060] <110> 中南大学湘雅二医院
[0061]
[0062] <120> 系统性红斑狼疮生物标志物及其诊断试剂盒
[0063]
[0064] <130> 1
[0065]
[0066] <160> 4
[0067]
[0068] <170> Patentln version 3.3 [0069]
[0070] <210> 1
[0071] <211> 122
[0072] <212> DNA
[0073] <213> Homo sapiens
[0074]
[0075] <400> 1
[0076] aatccaatgc tgtcactcca ttccagacag accgaaatac ttggatggcc ctgatgacac 60 [0077]
[0078] cgtgttctcc tgacttcctt gctttcattt catgtctcag tttaaacttt gatttgctag 120 [0079]
[0080] ca 1 2
[0081]
[0082]
[0083] <210> 2
[0084] <211> 30
[0085] <212> DNA
[0086] <213> Homo sapiens
[0087]
[0088] <400> 2
[0089] tgtggatagt gataatttgt tataaagtaa 30
[0090]
[0091]
[0092] <210> 3
[0093] <211> 28
[0094] <212> DNA
[0095] <213> Homo sapiens
[0096] [0097] <400> 3
[0098] aacctcatcc aatcttaaaa cacttata 28
[0099]
[0100]
[0101] <210> 4
[0102] <211> 25
[0103] <212> DNA
[0104] <213> Homo sapiens
[0105]
[0106] <400> 4
[0107] aatgttgtta ttttatttta gatag 25 [0108]

Claims

权利要求书
种用于系统性红斑狼疮早期诊断的生物标记物， 其特征在于该生物标 记物为位于人 IFI44L基因转录起始位点上游 1500bp内的一段 DNA序列 ， 该段 DNA序列位于人类基因组 1号染色体 79,085,190-79,085,311段， 其序列如 SEQ ID NO.l所示。
SEQ ID NO.1所定义核酸序列的生物标记物在制备 SLE诊断试剂中的 应用， 该应用包括测定受试者血液中 IFI44L基因转录起始位点上游 15 OObp内 SEQ ID NO.l序列的甲基化水平。
如权利要求 2所述的 SEQ ID NO.l所定义核酸序列的生物标记物在制 备 SLE诊断试剂中的应用， 该应用包括下述步骤： （1) 抽提受试者 外周血全基因组 DNA; (2) 测定抽提的基因组 DNA浓度； （3) 亚 硫酸盐处理基因组 DNA; (4) 特异性 PCR引物扩增 SEQ ID N0.1所 示的待测 DNA片段； （5) 电泳检测 PCR产物； （6) 对 PCR产物进行 测序； （7) 分析测序结果， 获得待测序列中包含的两个 CG位点的甲 基化水平。
一组与 IFI44L基因转录起始位点上游 1500bp内包含 SEQ ID
NO.1的 DNA序列互补的寡核苷酸 PCR弓 |物， 其特征在于该组 PCR弓 | 物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2和 SEQ ID N0.3所示。
一种 SLE诊断试剂盒， 其特征在于： 该试剂盒包含上下游分别如 SEQ
ID N0.2和 SEQ ID N0.3所示的一组 PCR引物， 且下游引物的 5'端用生 物素 biotin标记。
如权利要求 5所述的 SLE诊断试剂盒， 其特征在于： 该试剂盒还包含 如 SEQ ID N0.4所示的探针。
用于检测 IFI44L基因转录起始位点上游 1500bp内如 SEQ ID
NO.l所述 DNA序列 CG位点甲基化水平的探针， 其特征在于该探针的 核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示。
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