CN109536607B

CN109536607B - Mt-2a基因snp位点在检测重金属中毒易感性中应用

Info

Publication number: CN109536607B
Application number: CN201910095446.XA
Authority: CN
Inventors: 叶秀峰; 刘文兰; 徐迹; 孙波; 张晓丽; 唐婕; 赵卫华
Original assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN109536607A

Abstract

本申请公开了MT‑2A基因SNP位点在检测重金属中毒易感性中应用。所述SNP位点为MT‑2A基因第178位核苷酸G＞A，所述MT‑2A基因的序列如SEQ ID No.7所示。所述SNP位点的G与A在病例组和对照组间的差异极显著，其中，G为镉中毒易感等位基因或镉中毒高风险等位基因，A为非镉中毒易感等位基因或镉中毒低风险等位基因。因此通过检测该位点的碱基类型、判断该位点的基因型可用于检测重金属(如镉)中毒易感性或重金属中毒风险、筛查重金属中毒患者、鉴定或辅助鉴定重金属中毒易感基因、检测与重金属中毒或代谢相关的单核苷酸多态性。本发明所提供的应用和产品在重金属中毒易感人群识别，从而合理预防重金属中毒方面具有重要价值。

Description

MT-2A基因SNP位点在检测重金属中毒易感性中应用

技术领域

本发明属于生物医学分子检测技术领域，具体涉及MT-2A基因SNP位点在检测重金属中毒易感性中应用。

背景技术

重金属原义是指比重大于5的金属(一般来讲密度大于4.5克每立方厘米的金属)，包括金、银、铜、铁、汞、铅、镉等，重金属在人体中累积达到一定程度，会造成慢性中毒。在环境污染方面所说的重金属主要是指汞(水银)、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重元素。重金属非常难以被生物降解，相反却能在食物链的生物放大作用下，成千百倍地富集，最后进入人体。重金属在人体内能和蛋白质及酶等发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中累积，造成慢性中毒。在相同的重金属暴露水平上，不同的人群表现出不同的生物学效应，这在很大程度上取决于人群的遗传易感性。寻找重金属中毒的遗传易感因素有助于早期识别易感人群，有助于制定相应的预防措施保护易感人群。

金属硫蛋白(MT)基因是重金属毒性反应中最重要的应答基因，它编码富含半胱氨酸的小分子蛋白质，起到维持金属离子内稳态、重金属的解毒、清除自由基及抗氧化损伤等重要作用。MT-2A基因是MT基因家族中表达最丰富的基因亚型，它是重金属污染中重要的应答基因。

目前，MT-2A基因多态性与重金属(如镉)中毒易感性相关研究较少。

发明内容

本发明的目的在于提供检测一种新SNP在检测重金属中毒易感性中的应用。

本申请发明人在研究中发现：人MT-2A基因(DNA序列如SEQ ID No.7所示)上存在1个新的SNP位点：g.178(G＞A)(SEQ ID No.7所示序列的第178位G突变为A)。随后通过病例-对照分析证明该SNP位点的多态性或基因型与重金属(镉)中毒易感性相关。

SEQ ID No.7所示的MT-2A基因的3个外显子分别为：SEQ ID No.7所示DNA的第124-151位，第460-525位，第731-822位。

因此，本发明保护一种与重金属中毒易感性相关的SNP位点，所述SNP位点为MT-2A基因第178位核苷酸G＞A。

进一步的，所述MT-2A基因的序列如SEQ ID No.7所示。

另外，一方面，本发明提供了检测受试者所述SNP位点的试剂在制备检测受试者重金属中毒易感性的产品中的应用；优选的，所述重金属为金、银、铜、铁、汞、铅和/或镉，更优选，镉。

所述产品还可以是如下1)-3)的产品：

1)检测与重金属中毒或代谢相关的单核苷酸多态性的产品；

2)筛查重金属中毒患者的产品；

3)鉴定或辅助鉴定重金属中毒易感基因的产品；

所述重金属为金、银、铜、铁、汞、铅和/或镉，优选镉。

另一方面，本发明还提供了含有受试者所述SNP位点的试剂的上述任一所述产品，即：

一种检测与重金属中毒相关的单核苷酸多态性的产品，所述产品中含有检测受试者所述SNP位点的试剂；

一种检测重金属中毒易感性或重金属中毒风险的产品，所述产品中含有检测受试者所述SNP位点的试剂；

一种筛查重金属中毒患者的产品，所述产品中含有检测受试者所述SNP位点的试剂；

一种鉴定或辅助鉴定重金属中毒易感基因的产品，所述产品中含有检测受试者所述SNP位点的试剂。

在上述应用或产品中，所述检测受试者所述SNP位点的试剂可为通过下述至少一种方法确定所述SNP位点多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、质谱、荧光定量PCR；所述产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂盒和仪器的组合产品，如由PCR引物、单碱基延伸引物、和质谱仪以及相关试剂组成的组合产品。

在一种具体的实施方式中，所述检测受试者所述SNP位点的试剂包括扩增所述SNP位点的PCR引物对，以便于增加所述SNP位点的拷贝数，并进行进一步的测序、杂交、或质谱分析等；

任选的，所述检测受试者所述SNP位点的试剂还含有扩增所述SNP位点的单碱基延伸引物，以便于对所述SNP位点进行扩增并对扩增的碱基进行分析。

在一种具体的实施方式中，所述PCR引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；

所述单碱基延伸引物如SEQ ID No.5或其互补序列所示；

在一种实施方式中，所述受试者所述SNP位点的试剂还包括PCR反应试剂，和/或碱性磷酸酶及其反应缓冲液，和/或单碱基延伸反应试剂，和/或脱盐用树脂；

所述PCR反应试剂包括：dNTP、Mg²⁺、PCR反应预混液、和DNA聚合酶；

所述单碱基延伸反应试剂包括：ddNTP、单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸酶。

在一种实施方式中，所述检测所述SNP位点的试剂还可以与其他检测受试者重金属中毒易感性的产品进行联用；

如，上述PCR引物对可以与特异扩增包含其它SNP位点的PCR引物对混合进行多重PCR使用，以便于同时分析多个SNP位点；也可以单独使用，以便于仅分析1个SNP位点时需要；

上述单碱基延伸引物也可以与特异扩增其它SNP位点的单碱基延伸引物混合使用，以便于同时分析多个SNP位点；也可以单独使用，以便于仅分析1个SNP位点时需要。

另一方面，本发明还提供了一种检测重金属中毒易感性的PCR引物，所述PCR引物的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2。

进一步的，所述PCR引物还包括单碱基延伸引物；优选的，所述单碱基延伸引物的序列如SEQ ID No.7所示或其互补序列。

另一方面，本发明还提供了一种非治疗目的的检测受试者重金属中毒易感性的方法，包括检测受试者MT-2A基因第178位核苷酸G＞A多态性的步骤，所述MT-2A基因如SEQ IDNo.7所示，所述易感性的判断条件如下：

受试者MT-2A基因第178位核苷酸G或与其碱基互补的核苷酸C为重金属中毒高风险受试者，受试者MT-2A基因第178位核苷酸A或与其碱基互补的核苷酸T为重金属中毒低风险受试者；

优选的，所述方法包括利用所述PCR引物进行扩增的步骤。

另外，本发明还提供了一种用于制备上述任一所述产品的PCR引物组合，包括如下引物对：

引物对1，用于特异扩增SNP位点MT-2A基因第178位核苷酸G＞A在内的人基因组DNA片段，所述引物对1的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；

可选的，还包括：引物对2(作为对照使用)，用于特异扩增SNP位点MT-2A基因第47位核苷酸A＞G(rs28366003)在内的人基因组DNA片段，所述引物对2的上游引物如SEQ IDNo.3所示，下游引物如SEQ ID No.4所示；

可选的，还包括：特异扩增所述SNP位点的单碱基延伸引物，或检测所述SNP位点的探针；

检测单碱基延伸引物的扩增产物可以得知相应SNP位点的基因型；

检测探针的标记信号也可以得知相应SNP位点的基因型；

优选的，所述特异扩增所述SNP位点的单碱基延伸引物如下：

特异扩增SNP位点MT-2A基因第178位核苷酸G＞A的单碱基延伸引物A，其序列为SEQ ID No.5或其互补序列；

特异扩增SNP位点MT-2A基因第47位核苷酸A＞G的单碱基延伸引物B，其序列为SEQID No.6或其互补序列。

本发明保护上述PCR引物组合在制备上述任一所述产品中的应用。

本发明提供的所述PCR引物组合在保留PCR扩增的高效性和灵敏性的同时，能够一管完成多个SNP位点产物扩增，兼顾了基因测序法检测的准确性；样本DNA提取后无需测定与稀释浓度，直接加样进行PCR扩增和后续SAP及iPLEX反应，避免了探针杂交等影响因素，节省时间，减少手工操作；更好地控制检测成本，提高经济和社会效益；本发明有助于将MassARRAY质谱技术用于重金属中毒易感性的检验或相关性分析，在对特定人群制定相应的预防措施前提供依据。

实验证明，SNP位点MT-2A基因第178位核苷酸(g.178)G＞A处的等位基因G与A在病例组和对照组间的差异极显著(P＜0.01)，说明在SNP位点g.178(G＞A)处的等位基因G和A与镉中毒易感相关(OR为1.32)，在病例组人群中在该等位基因处为G的人数明显高于对照组，即判定SNP位点g.178(G＞A)处的G为镉中毒易感等位基因或镉中毒高风险等位基因，A为非镉中毒易感等位基因或镉中毒低风险等位基因。因此通过检测该位点的碱基类型、判断该位点的基因型可用于检测重金属(如镉)中毒易感性或重金属中毒风险、筛查重金属中毒患者、鉴定或辅助鉴定重金属中毒易感基因、检测与重金属中毒或代谢相关的单核苷酸多态性。

本发明所提供的应用和产品在重金属中毒易感人群识别，从而合理预防重金属中毒方面具有重要价值。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本申请发明人在研究中发现了人MT-2A基因(DNA序列如SEQ ID No.7所示)上存在1个新的SNP位点：g.178(G＞A)(SEQ ID No.7所示序列的第178位G突变为A)。随后通过病例-对照分析证明上述SNP位点的多态性或基因型与重金属(镉)中毒易感性相关。

SEQ ID No.7所示的人MT-2A基因的3个外显子分别为：SEQ ID No.7所示DNA的第124-151位，第460-525位，第731-822位。

实施例1、MT-2A基因上新发现的SNP位点与重金属(镉)中毒易感性相关(病例-对照分析)

1、以暴露于镉污染工作环境下1年以上的中国汉族作业工人为研究对象，根据国家职业性慢性镉中毒诊断标准GBZ3-2006，将诊断为慢性镉中毒轻度及以上的人群作为病例组(即镉中毒易感组)，将无任何镉中毒症状的人群作为对照组。经统计学分析两组人的年龄、性别、工龄等情况无统计学差异(P＞0.05)。

2、对上述病例组(即镉中毒易感组)和对照组人群的SNP位点g.178(G＞A)的基因型进行检测，以已知与镉中毒易感相关的SNP位点g.47(A＞G)(SEQ ID No.7所示DNA的第47位A突变为G，NCBI中的编号为rs28366003)为阳性对照。

3、统计步骤1和2的结果，使用卡方检验各SNP位点的等位基因/基因型与病例-对照分组是否相关，结果如表1所示。

表1、基因分型检测结果

注：经分析上述两个SNPs基因型频率在总人群中均符合遗传学哈迪温伯格平衡(P＞0.05)，认为研究对象具有良好的代表性。

表1中的n表示数目；OR(95％CI)表示优势比(95％的置信区间)，对于疾病发病率而言，不同基因型的OR值即为该基因导致疾病发生相对危险度的估计值，当OR值＝1时，表示该因素对疾病的发生不起作用，当OR值大于1时，表示该因素是一个危险因素，当OR值小于1时，表示该因素是一个保护因素；P值表示统计学意义，当P＜0.05表示比较的样本有显著差异；当P＜0.01表示比较的样本有极显著差异。

表1的结果表明，在SNP位点g.178(G＞A)处的等位基因G与A的不同在病例和对照组间的差异极显著(P＜0.01)，说明该SNP位点g.178(G＞A)处的等位基因G与A与镉中毒易感相关(OR为1.32)，在病例组(即镉中毒易感组)人群中在该等位基因处为G的人数明显高于对照组，即判定SNP位点g.178(G＞A)处的G为镉中毒易感等位基因或镉中毒高风险等位基因，A为非镉中毒易感等位基因或镉中毒低风险等位基因；

对照SNP位点g.47(A＞G)处的等位基因G与A的不同在病例与对照组间差异极显著(P＜0.01)，说明该SNP位点g.47(A＞G)处的等位基因G与A与镉中毒易感相关(OR为1.36)，在病例组(即镉中毒易感组)人群中在该等位基因处为G的人数明显高于对照组，即判定SNP位点g.47(A＞G)处的G为镉中毒易感等位基因或镉中毒高风险等位基因，A为非镉中毒易感等位基因或镉中毒低风险等位基因。

上述步骤2中的检测具体如下：

检测仪器：MassARRAY Genetic Analysis System DNA质谱基因分析系统(SEQUENOM Inc.西格诺公司，美国)；AB-Vii A7荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司(ABI))；离心机(TL-5.0W，上海)；旋转振荡仪(上海)。

检测方法：

1)引物设计

从NCBI检索SNP位点g.178(G＞A)和g.47(A＞G)(阳性对照，已知与镉中毒易感相关)所在基因组的序列信息，经过生物信息学比对分析，各找到一段分别包含上述两个SNP位点之一的高度保守的区域，分别设计引物，及对应SNP位点的单碱基延伸引物，并通过分析软件和实际扩增摸索，找到效果最佳的引物组合(多重PCR扩增灵敏度最高，单碱基延伸反应中引物的特异性好、且单碱基延伸产物之间的分子量相差20Da以上)，其序列如表2和表3所示。

表2、多重PCR引物设计

表3、单碱基延伸引物设计

2)取-20℃离体保存的上述人群的EDTA抗凝的血液，使用血液基因组提取试剂盒分别纯化血液样本中的基因组DNA。

3)多重PCR扩增：同时使用表2所示的2个引物对，分别以步骤2)获得的基因组DNA为模板，同时设以水为模板的阴性对照，进行多重PCR扩增，反应体系如下：

试剂组分	用量
		MgCl<sub>2</sub>(25mM)	1.5μL
PCR缓冲液(10×)	2.5μL
		dNTP混合物(2.5mM)	2.0μL
1μM引物混合物(各条引物摩尔浓度相同)	5.0μL
		Taq HS DNA聚合酶	2U
模板(基因组DNA溶液)	2.0μL
		H<sub>2</sub>O	补足至25μL

多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；然后进行如下循环45次：95℃变性20s、60℃退火30s、和72℃延伸20s；最后72℃延伸3min。

4)SAP反应

分别取上述步骤3)中PCR扩增后液体5μL，加入2μL SAP反应液进行SAP反应，其中，SAP反应液配方如下：

SAP反应条件如下：37℃40分钟，85℃5分钟，4℃保存。

5)单碱基延伸反应

向经过步骤4)反应的液体中分别加入2μL的延伸反应液，进行单碱基延伸反应，其中，延伸反应体系如下：

组分	用量
		去离子H<sub>2</sub>O	0.619μL
iPLEX缓冲液	0.2μL
		iPLEX终止mix	0.2μL
各单碱基延伸引物等浓度的混合物(0.5μM)	0.94μL
		iPLEX酶	0.041μL
合计	2μL

延伸反应的条件如下：

6)树脂脱盐

在每一个有样本的延伸反应液孔里加入41μL水后离心。加入15mg洁净树脂(Resin)：轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的dimple plate上，然后将dimple plate连样本板一起反转(过程中两快板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。用膜把板封好，放在旋转器上振荡摇匀15分钟。以3200g(标准板离心机的4000rpm)将板离心5分钟。

7)SpectroCHIP芯片上样

用MassARRAY^TMRS 1000自动点样仪进行体积测试以找出合适的点样速度。点样的合适体积是8-12nL±25％。以板上的样本进行体积测试，然后用MassARRAY^TMRS 1000自动点样仪将反应后的样本点到96点SpectroCHIP(芯片)上。

8)质谱检测

使用MassARRAY Genetic Analysis System DNA质谱基因分析系统进行质谱检测和分析，根据质谱检测峰的分子量与相应的单碱基扩增引物的分子量之差确定多重PCR产物中相应SNP位点的碱基种类。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

序列表

<110> 深圳市第二人民医院

<120> MT-2A基因SNP位点在检测重金属中毒易感性中应用

<130> JH-CNP190064F

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 1

tcttcagctc gccatggatc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 2

ggagcaactc ctgtcctgaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 3

actcgtcccg gctctttcta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 4

gatccatggc gagctgaaga 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 5

gaggctgggg atgcccagtg ta 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Aritificial sequence

<400> 6

taaacactgc ttgccgcgct gc 22

<210> 7

<211> 965

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

actcgtcccg gctctttcta gctataaaca ctgcttgccg cgctgcactc caccacgcct 60

cctccaagtc ccagcgaacc cgcgtgcaac ctgtcccgac tctagccgcc tcttcagctc 120

gccatggatc ccaactgctc ctgcgccgcc ggtaagaggc tggggatgcc cagtgtagac 180

tgtagcgcta gagaagcaat ttctgacccc tctttctttc tctggtcact caatttcagg 240

acaggagttg ctccttccca aagagttttg gggtatcttt ctctccattc taggttattc 300

ggagccccct ttttaccgtt aaggagatct gagttaatgg cttgctcaag ttcccaggaa 360

tcggttgtgg actgaggaac tcggccccgg gctcttagta cgccgtccct tgttcaggta 420

tccagggacg gttctcacct ctgtcttttc tccttgcagg tgactcctgc acctgcgccg 480

gctcctgcaa atgcaaagag tgcaaatgca cctcctgcaa gaaaagtaag tgggatcctc 540

tctttcctct accccttccc tgtcctccag cctgtcccct ctccaccatc ctcaggggaa 600

ttaaagcagt ctggggatgc cccattgcgc ggaaattgtt gcctcctcag tgatccttat 660

cagggagagc aggaatcctt attcccggtg tcgctagtac tcatctctgc cgcctcctgt 720

ctgcccccag gctgctgctc ctgctgccct gtgggctgtg ccaagtgtgc ccagggctgc 780

atctgcaaag gggcgtcgga caagtgcagc tgctgcgcct gatgctggga cagccccgct 840

cccagatgta aagaacgcga cttccacaaa cctggatttt ttatgtacaa ccctgaccgt 900

gaccgtttgc tatattcctt tttctatgaa ataatgtgaa tgataataaa acagctttga 960

cttga 965

Claims

1.检测与重金属中毒易感性相关的SNP位点的试剂在制备检测受试者重金属中毒易感性的产品中的应用，其特征在于，

所述SNP位点为MT-2A基因第178位核苷酸G＞A，所述MT-2A基因的序列如SEQ ID No.7所示；

所述重金属为镉；

所述试剂包括扩增所述SNP位点的PCR引物对，还含有扩增所述SNP位点的单碱基延伸引物，所述PCR引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示，所述单碱基延伸引物如SEQ ID No.5所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括PCR反应试剂，和/或碱性磷酸酶及其反应缓冲液，和/或单碱基延伸反应试剂，和/或脱盐用树脂；

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测与重金属中毒易感性相关的SNP位点的试剂还可以与其他检测受试者重金属中毒易感性的产品进行联用。