CN110468192B

CN110468192B - 一种检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的飞行时间质谱核酸分析方法

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Publication number: CN110468192B
Application number: CN201910603082.1A
Authority: CN
Inventors: 杨学习; 周万军; 吴英松; 朱安娜; 李明; 徐惠玲; 李婕
Original assignee: Guangzhou Darui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Darui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-07-05
Filing date: 2019-07-05
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2039-07-05
Also published as: CN110468192A

Abstract

本发明公开了一种检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的飞行时间质谱核酸分析方法，利用一个包括扩增引物和质谱延伸探针引物的引物组合。此方法对SMN1、SMN2、NAIP、H4F5、GTF2H2基因相关序列拷贝数进行定量检测，分析是否有缺失、缺失数量和多拷贝，从而能够直接推断临床表型严重程度；具有良好的灵敏度、特异性、稳定性与准确性，有效解决假阴性及假阳性等技术瓶颈；操作简单、成本相对较低、结果稳定可靠；通量高成本低，具有普遍的代表性和通用性，易于实现自动化和规模化检测，适合大规模人群筛查；还能对部分常见的SMN1上点突变进行基因分型检测；满足当前SMA防治中大规模人群筛查、产前诊断和常规分子诊断的需要。

Description

一种检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的飞行时间质谱核酸分析方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体地，涉及一种检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的飞行时间质谱核酸分析方法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是一组常见的常染色体隐性遗传病，居致死性常染色体隐性遗传病的第二位，活产婴儿中患者发生率为1/6000～1/10000。临床上，SMA一般分为4种类型：Ⅰ型(又称Werding-Hoffm an病)是最严重的亚型(重型)，约占SMA患者的一半，发病急、进展快，一般在出生6个月之内发病，多于2岁之内死亡；SMAⅡ型为慢性婴儿型(中间型)，通常在7～18个月内发病，大多可以存活10～20岁；SMAⅢ型(又称Wohlfart-Ku gelberg-Welander病)为青少年型(轻型)，出生18个月后才发病，病情发展缓慢，一般可存活至成年，多因呼吸肌麻痹或全身功能衰竭死亡；SMA Ⅳ型则为成年型(极轻型)，一般于20～30岁以后发病，主要表现为缓慢逐渐发生的上下肢近端无力和肌肉萎缩，成年期都能够行走。总的来说，SMA为致死性疾病，神经肌肉疾病病情严重，目前临床上无有效治疗手段。

SMA的致病基因定位于5号染色体长臂1区3带2亚带(5q13.2)，存在重复序列及众多假基因簇而结构复杂且不稳定，易引起基因缺失、转换和点突变。该区域包含运动神经元生存(SMN)基因、神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)基因、基本转录因子IIH亚单位2号多肽(GTF2H2)基因和人类4F5(H4F5)基因，其中SMN基因为SMA致病基因，其余3种基因为修饰基因。。SMA的病因是源于S MA相关基因突变导致SMN等蛋白表达下降甚至消失而发病，因此通过检测S MN、NAIP、GTF2H2、H4F5等基因突变状况，是SMA的主要确诊方法。

其中SMN基因全长20kb，包括9个外显子和8个内含子，有两个非常相似的基因拷贝，即位于端粒端的SMN1(或称SMNt)和位于着丝粒端的SMN2(或称S MNc)。SMN1和SMN2为两个高度同源的倒位重复DNA序列，仅在3’端有5个碱基的差异，尤其是SMN2因第7外显子与SMN1的单个碱基差异(c.840C>T)，导致此两个基因拷贝所编码的蛋白产物不同，即SMN1编码完整而稳定的SMN功能蛋白，而SMN2编码功能缺陷的截短SMN蛋白。

NAIP基因全长70kb，包括16个外显子和15个内含子，编码的NAIP蛋白通过阻断细胞信号转导通路中的caspase-3和caspase-7的激活抑制神经细胞凋亡。

GTF2H2基因全长约4.3kb，包括16个外显子和15个内含子，有两个同源变异体拷贝，端粒变异体(T-GTF2H2)和着丝粒变异体(C-GTF2H2)，有研究发现T-GT F2H2的全基因纯合缺失会加重患者临床症状。H4F5基因全长约1.9kb，包括3个外显子和2个内含子，同样也有两个同源变异体拷贝，端粒变异体(T-H4F5)和着丝粒变异体(C-H4F5)，端粒变异体纯合缺失也会加重病情。

目前的研究已经表明，SMN1为SMA的决定基因，表达完整而稳定的SMN功能蛋白，SMN2作为SMA的修饰基因，所表达的具有生物活性SMN蛋白量虽然较少，但随着其拷贝数增加会有表达量的累积效应，从而使患者的临床症状有一定程度的减轻。有关NAIP、GTF2H2、H4F5基因，研究显示其缺失与SMA病情严重程度相关，涉及到这些基因缺失的SMA病人临床表型重，仅为单独的SMN基因突变而未涉及NAIP、GTF2H2、H4F5基因缺失的SMA病人则临床表型轻。据报道，SMN1缺失是引起SMA的主要原因，约占95％，另5％则为SMN1基因内的点突变。总言之，大片段缺失或点突变而导致SMN1基因功能丧失是SMA的基本分子机制，研究显示中国人群的SMA发病分子机制与世界上其它国家的情况相同。据此，SMN1基因纯合或双重杂合突变导致SMN蛋白功能丧失为SMA确诊指标，SMN2和NAIP、GTF2H2、H4F5基因功能状态影响疾病临床表型的严重程度。所以同时检测SMN1、SMN2、NAIP、GTF2H2、H4F5五个基因目的片段的缺失或多拷贝的数量不仅可以准确诊断SMA，并且对分析估测S MA的临床表型十分必要。

目前SMA的诊断策略主要是以SMN1基因缺失的分子机制，通过分析SMN1基因目的片段是否有缺失及缺失的数目而进行常规和产前基因诊断。随着分子生物学技术的发展，先后出现不同的SMA分子诊断技术。包括一些传统方法如PCR-单链构象多态性分析法，单碱基突变PCR技术和变性高效液相色谱技术分析SMN基因7、8号外显子突变情况。这些技术普遍存在准确率低，操作复杂而且耗时，检测试剂成本高等问题。此后出现了应用实时荧光定量PCR技术检测SMN1基因的缺失。由于SMN1与SMN2基因序列高度同源，只有5个碱基的差异，同时检测SMN1和SMN2基因的技术要求高、方法学研发难度大。一直以来，临床上对SMA的常规检测主要是采用荷兰MRC公司的多重连接探针扩增(Multi ple Ligation-dependentProbe Amplification,MLPA)检测试剂盒，该方法成本昂贵，检测耗时长，难以在临床上进行大规模人群筛查和技术推广。

社会的进步，科技的发展，尤其是“健康中国”已上升为国家战略，对诸如地中海贫血、脊髓性肌萎缩症(SMA)、遗传性耳聋等严重致死致残人类单基因遗传病的人群致病基因分子筛查和基因诊断，通过高风险夫妇孕期胎儿产前诊断而避免重症患儿出生的有效防控措施，是实现优生优育而提高人口质量和国民健康水平首要途径。就SMA的基础研究而言，通过检测更多的样本、更多的基因位点、更多的突变类型，可加深对疾病或表型性状的进一步认识；从SMA临床实践而言，通过对多个基因、多个位点、多个突变类型检测，可为明确诊断、风险评估、预防控制、个体化治疗等提供依据。据此，以基因检测为主题的理论策略与创新技术研究，其发展趋势必然为尽可能低的检测成本而实现“多”(位点更多)、“快”(速度更快)、“全”(通量更大)的检测目标。

随着以降低SMA患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施，以及S MA发病分子机制及分子流行病学的深入研究，研发准确可靠、简单实用、能够实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的高通量全突变热点SMA相关基因快速检测方法为当前迫切之需。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术尚无一种针对脊髓性肌萎缩症的多位点检测方法的不足，提供一种检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的飞行时间质谱核酸分析方法，以对人类5号染色体长臂1区3带第2亚带SMA相关基因缺失和常见点突变进行快速检测，从而实现脊髓性肌萎缩症的准确诊断，该方法灵活性与可扩展性兼备，操作简单且高通量自动化，符合大规模人群分子筛查和常规基因诊断的要求。

本发明的第一个目的是提供一个用检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的引物组合。

本发明的第二个目的是提供所述的引物组合在制备同时检测SMN1、SMN2、NAIP、GTF2H2和/或H4F5基因型及拷贝数的产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种人类脊髓性肌萎缩症基因检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型生物质谱，该技术采用“软电离”方式而产生稳定分子离子，在外加电场的作用下“飞”向探测器，飞行时间与样本分子的荷/质比(电荷/分子量)成一定比例关系，以此获得待测物质的精确分子量，因而是测定生物大分子分子量的有效方法。一个DNA片段有其特有的分子量，当此序列中增加或减少一个碱基，甚至其中某个碱基替换成另外一个碱基，其分子量即发生了变化，MALDI-TOF-MS即是检测这种差异最灵敏的技术，准确度高达0.1％～0.01％，一个质谱峰即对应某一特定分子量的DNA分子而实现定性鉴别，其峰高也与此DNA分子的量成比例而实现定量分析。据此，本发明是以待检的SMA相关基因及突变位点为基础，分别设计质谱分析延伸探针而获得不同分子量的代表性DNA分子，通过对这些DNA分子的质谱检测，即可获得待检基因的定性或定量分析结果。

目前在临床上提取DNA的方法主要包括离心柱式洗脱法和酚氯仿提取法。在DNA提取过程中，不同染色体断裂片段大小存在差异，在离心柱式洗脱时，中小片段容易被洗脱下来，大片段不容易被洗脱下来，导致位于不同染色体目的序列原始模板数存在差异，影响各目的基因拷贝数的有效参比；而在酚氯仿提取法中，离心洗脱时，大片段容易沉降底部，小片段漂浮顶部容易在弃上清时被移除，同样导致位于不同染色体目的序列之间原始模板数存在差异，影响结果的准确分析(见图1)。

因此在本发明中采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术平台，以目的基因临近序列为内参，单管同时检测人类5号染色体长臂1区3带第2亚带上的SMN1、SMN2、NAIP、GTF2H2、H4F5基因缺失及SMN1常见点突变。该检测方法的特征在于，参比序列与目的基因均位于5q13.2，在不同DNA提取方法过程中，参比序列与目的序列拷贝数均为1：1的关系，有效避免了由于DNA提取方法导致的原始拷贝数的差异(见图2)。

本方法中分别选取了SMN1、SMN2、NAIP、GTF2H2、H4F5基因两端的一段没有拷贝数变异的保守基因为参比序列(5号染色体长臂1区3带第2亚带上，见图3)。在本发明中，在一个反应管内使用扩增引物同时扩增所有目的基因和突变位点的靶序列模板，即多基因目的序列PCR扩增；然后加入各目的基因及突变位点的特异性单碱基延伸引物(质谱延伸探针引物)，经与目标序列的特异性杂交、单碱基延伸，生成大量与待检基因和突变位点相对应的、相互这间存在明显分子量差异的DNA小分子，即突变热点探针单碱基延伸；最后，将产物于MALDI-TOF质谱仪自动进样检测，根据样本检测分子量质谱图，采用自动分析软件或人工方式进行结果判读而获得基因分型结果(见图4)。

因此本发明要求保护一组用检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的引物，包括扩增引物和质谱延伸探针引物，其中扩增引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：1～22所示序列中的一条或多条，质谱延伸探针引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：23～35所示序列中的一条或多条。

其中，上游引物5’-TCTTGTGAAACAAAATGCTT-3’(SEQ ID NO.1)和下游引物5-ATAATGCTGGCAGACTTAC-3’(SEQ ID NO.2)为用于特异性扩增SMN1和SMN2基因外显子7片段的扩增引物；

上游引物5’-TGCAATGTGAAATATTTTACTGGACTC-3’(SEQ ID NO.3)和下游引物5’-ACTACAACACCCTTCTCACAGCTC-3’(SEQ ID NO.4)为用于特异性扩增SMN1和SMN2基因外显子8片段的扩增引物；

上游引物5’-AGTTTGATCACAATTTGCTG-3’(SEQ ID NO.5)和下游引物5’-CACTGCGCATTTGAGAGTTGT-3’(SEQ ID NO.6)为用于特异性扩增NAIP基因外显子5片段的扩增引物；

上游引物5’-GGAGGCAACACATGTAATAGAGGTAAG-3’(SEQ ID NO.7)和下游引物5’-TTGTGGTGACCAGTTTTCACCTAC-3’(SEQ ID NO.8)为用于特异性扩增GTF2H2-T和GTF2H2-C基因内含子8片段的扩增引物；

上游引物5’-CTTCAAAGCCTTTCCAGTCTGTC-3’(SEQ ID NO.9)和下游引物5’-TGGTTTCTACACATAACCCATTCAG-3’(SEQ ID NO.10)为用于特异性扩增H4F5-T和H4F5-C基因内含子2片段的扩增引物；

上游引物5’-TACTGTTCCGCTCCCAGA-3’(SEQ ID NO.11)和下游引物5’-GCTGCGACCTCACCT-3’(SEQ ID NO.12)为用于特异性扩增SMN1和SMN2基因外显子1片段的扩增引物；

上游引物5’-GCCCTCTTCAAAAGA-3’(SEQ ID NO.13)和下游引物5’-AAATCAATTGAAGCAATGG-3’(SEQ ID NO.14)为用于特异性扩增SMN1和SMN2基因外显子3片段的扩增引物；

上游引物5’-TCAATGGCCCACCACCGCCA-3’(SEQ ID NO.15)和下游引物5’-TGGTGGTCCAGAAGGAAATG-3’(SEQ ID NO.16)为用于特异性扩增SMN1和SMN2基因外显子5片段的扩增引物；

上游引物5’-GATGATGCTGATGCTTTG-3’(SEQ ID NO.17)和下游引物5’-TTGTCAGGAAAAGATGCTGAG-3’(SEQ ID NO.18)为用于特异性扩增SMN1和SMN2基因外显子6片段的扩增引物；

上游引物5’-TGTCAGAAGTCTAAGCCA-3’(SEQ ID NO.19)和下游引物5’-TCTTCACTTCTAAAGCTAAG-3’(SEQ ID NO.20)为用于特异性扩增5号染色体长臂端粒侧参比序列片段的扩增引物；

上游引物5’-GAGTTCCCATTCCTGAATGAGTC-3’(SEQ ID NO.21)和下游引物5’-TCTAAATGGCAACAACGAGCAC-3’(SEQ ID NO.22)为用于特异性扩增5号染色体长臂着丝粒侧参比序列片段的扩增引物；

5’-TTTATTTTCCTTACAGGGTTT-3’(SEQ ID NO.23)为特异性检测SMN1和SMN2基因外显子7的质谱延伸探针引物；

5’-GAAAGTATGTTTCTTCCACA-3’(SEQ ID NO.24)为特异性检测SMN1和SMN2基因外显子8质谱延伸探针引物；

5’-GCGCACCCGCGGGTTTGCTATGG-3’(SEQ ID NO.25)为特异性检测SMN1基因外显子1c.5C>T的质谱延伸探针引物

5’-ATGAGCAGCGGCGGC-3’(SEQ ID NO.26)为特异性检测SMN1基因外显子1c.22dupA的质谱延伸探针引物；

5’-AACATTTGTCCCCAACTTTC-3’(SEQ ID NO.27)为特异性检测SMN1基因外显子3c.275G>C的质谱延伸探针引物；

5’-AGGCAGCCAGCATGATAGTA-3’(SEQ ID NO.28)为特异性检测SMN1基因外显子5c.683T>A的质谱延伸探针引物；

5’-ACATGAGTGGCTATCAT-3’(SEQ ID NO.29)为特异性检测SMN1基因外显子6c.819_820insT的质谱延伸探针引物；

5’-AGTGATTACTTACCATA-3’(SEQ ID NO.30)为特异性检测SMN1基因外显子6c.830A>G的质谱延伸探针引物；

5’-GGCCTAGATGCAGTTCAGTTG-3’(SEQ ID NO.31)为特异性检测NAIP基因外显子5的质谱延伸探针引物；

5’-GTGCTCTCACTGGTAGACCCT-3’(SEQ ID NO.32)为特异性检测GTF2H2基因内含子8rs1406035794G>A的质谱延伸探针引物；

5’-CCATTTTCATGGCTGGAGA-3’(SEQ ID NO.33)为特异性检测H4F5基因内含子2rs631548A>G的质谱延伸探针引物；

5’-TGCATCAGATTCCACAAGCTT-3’(SEQ ID NO.34)为特异性检测5号染色体长臂端粒侧参比序列的质谱延伸探针引物；

5’-GTGCAGACGTAGGTTTTCA-3’(SEQ ID NO.35)为特异性检测5号染色体长臂着丝粒侧参比序列的质谱延伸探针引物。

9个目的序列，分别位于SMN1、SMN2、NAIP、GTF2H2和H4F5基因，以及2个参比序列序列。所有目的基因和参比序列扩增子DNA序列长度为80－200bp(参见图3)。

NAIP基因缺失主要是缺失外显子4和5，所以引物设置在外显子5。

GTF2H2基因(OMIM:601748)是一个多拷贝转录修复基因，在5号染色体上有两个同源变异体拷贝，端粒变异体(T-GTF2H2)与着丝粒变异体(C-GTF2H2)，这两个变异体拷贝分别在8号与11号外显子上有一个碱基的变异：T-GTF2H2→C-GTF2H2的8号外显子存在A→G改变，11号外显子为G→C。

H4F5-T和H4F5-C是H4F5的两种变异体。

以上所述的扩增引物和质谱探针由本领域常用的方法合成。

以上所述的扩增引物和质谱探针，均无须其它任何标记。

所述的引物组合在制备同时检测SMN1、SMN2、NAIP、GTF2H2和/或H4F5基因型及拷贝数的产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述基因型包括但不限于基因发生片段缺失或基因发生点突变。

进一步本发明要求保护一种人类脊髓性肌萎缩症基因检测试剂盒，包括以上所述引物组合。

优选地，还包括多重PCR反应试剂、单碱基延伸反应试剂和去dNTP混合物反应试剂。

优选地，所述引物组合为含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1～22所示序列中的一条或多条的PCR反应扩增引物混合液和核苷酸序列如SEQ ID NO：23～35所示序列中的一条或多条的延伸引物混合液。

更优选地，多重PCR反应试剂包括：PCR反应扩增引物混合液、多重PCR酶、延伸反应多重PCR缓冲液、氯化镁缓冲液、dNTP混合物。

更优选地，单碱基延伸反应试剂包括：延伸缓冲液、延伸终止混合液、反应催化酶、延伸引物混合物。

更优选地，去dNTP混合物反应试剂包括：延伸缓冲液、延伸终止混合液、反应催化酶、延伸引物混合物。

优选地，PCR反应扩增引物混合液中SEQ ID NO：1～4所示序列和SEQ ID NO：7～10的浓度为1pmol/μL，SEQ ID NO：5～6所示序列和SEQ ID NO：11～22的浓度为0.5pmol/μL。

优选地，延伸引物混合液中，SEQ ID NO：23所示序列的浓度为20pmol/μL；SEQ IDNO.24所示序列的浓度为15.5pmol/μL；SEQ ID NO.25所示序列的浓度为8.75pmol/μL；SEQID NO.26所示序列的浓度为7.5pmol/μL；SEQ ID NO.27所示序列的浓度为7.9pmol/μL；SEQID NO.28所示序列的浓度为6.05pmol/μL；SEQ ID NO.29所示序列的浓度为9.15pmol/μL；SEQ ID NO.30所示序列的浓度为9.5pmol/μL；SEQ ID NO.31所示序列的浓度为9pmol/μL；SEQ ID NO.32所示序列的浓度为18pmol/μL；SEQ ID NO.33所示序列的浓度为16.3pmol/μL；SEQ ID NO.34所示序列的浓度为7pmol/μL；SEQ ID NO.35所示序列的浓度为9pmol/μL。

具体的本试剂盒的使用方法为：

1、样品处理

gDNA标本可以通过以下方法获得：抽取外周全血标本，EDTA抗凝，天根柱式法DNA提取试剂盒抽提得到gDNA标本，或者通过传统的酚氯仿提取gDNA。

将待检gDNA标本，2-3份SMN1、SMN2、NAIP、H4F5、GTF2H2基因拷贝数均为2的正常gDNA标本作为参照标本，以及1-2份SMN1、SMN2、NAIP、H4F5、GTF2H2基因拷贝数已知的质量控制gDNA标本，同时按照一下程序进行检测。

2、多重PCR反应

其多重PCR反应体系为：模板gDNA 15-100ng、PCR反应扩增引物混合液1.00μL、多重PCR酶1.00U、延伸反应多重PCR缓冲液0.50μL、氯化镁缓冲液0.40μL、dNTP混合物0.10μL、灭菌双蒸水至5.00μL。

其反应程序为：95℃预变性3min；95℃30sec，58℃30sec，72℃20sec，35个循环；72℃5min；12℃保存。

PCR扩增仪中进行反应。

3、去dNTP混合物

向上一步的多重PCR反应扩增产物中添加去dNTP混合物反应体系。

其中，去dNTP混合物反应体系：磷酸酶缓冲液0.17μL，磷酸消化酶0.30U，灭菌双蒸水至1.53μL。

去dNTP混合物反应条件为：37℃40min；85℃5min；4℃保存。

4、单碱基延伸反应

向上一步的去dNTP混合物产物中添加单碱基延伸反应体系。

其中，单碱基延伸反应体系为：延伸缓冲液0.20μL，延伸终止混合液0.20μL，反应催化酶1.28U，延伸引物混合物0.94μL，灭菌双蒸水至2.00μL。

单碱基延伸反应应程序为：95℃预变性30sec；[95℃5sec,(52℃5sec，80℃5sec，5个循环)，40个循环]；72℃3min；4℃保存。

反应结束后，2000rpm瞬时离心，每孔加入41μL的灭菌双蒸水(此时每孔内的总体积为50μL)，换新的膜将96孔板封住，震荡混匀后，瞬时离心。

5、质谱检测

使用飞行时间质谱检测系统进行质谱检测，质谱检测程序设置参数如图1：

图1：

检测结果用Typer 4.0软件(美国Agena公司)分析，并将各位点峰面积导出至Excel文件。

6、结果判读

定性检测时，根据延伸引物及引物延伸后分子量大小(如表2)，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为当峰值≥2时，突变型峰值/野生型峰值≥0.5的样本为突变阳性，提示该样本存在相应的基因突变，当峰值≥2时，突变型峰值/野生型峰值＜0.5的样本为突变阴性，样本不存在相应的突变位点。

表2各目的基因和突变位点质谱探针及单碱基延伸分子量与基因型列表：

定量检测时，以SMN1、SMN2、NAIP、H4F5、GT2F2H2基因拷贝数均为2的正常样本作为对照样本，根据质谱检测获得待检样本、对照样本的两个内参和目标基因峰面积值，按下述公式进行计算。

两个内参基因均按上述公式进行推算并将这两次结果取均值，该均值则为目标基因的拷贝数数量。检测结果判定见表3。

表3相对拷贝数定量数据分析结果判定：

在拷贝数定量检测上，参考相关文献(Gao Y,Wang J,Shangguan S,etal.Quantitative Measurement of PARD3Copy Number Variations in Human NeuralTube Defects[J].Cellular and Molecular Neurobiology,2017)，引入了两个目的基因临近序列的两个无CNV变异的内参基因，每次检测中加入2-3份已知拷贝数的对照样本。原理上说，一个基因拷贝数越多相当于模板越多，经过PCR扩增、去dNTP混合物、单碱基延伸、质谱分析后，其分子量所在峰值强度也越高，但是峰值强度也会受到上样gDNA总量、样本与芯片基因结合情况、激光激发芯片基质飞行情况等因素的影响。本研究中我们首先计算样本的目标基因峰面积/内参基因峰面积比值，这相当于自身样本的一个“校正”，消除了除自身样本拷贝数外其他因素的影响。接着根据参照样本和待检样本该比值以及结合参比样本目标基因拷贝数进行计算，对待检样本拷贝数进行推算。

本发明是针对5q13.2上SMA相关基因缺失和常见点突变进行快速检测，对于点突变位点的检测基本原理是目标序列经过富集后，所设计质谱探针3’末端距离目标检测位点仅隔一个碱基，以四种经过修饰的分子量大小不一样的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)为底物进行单碱基延伸反应，根据延伸碱基种类对检测位点进行分型。而本发明拷贝数检测目标基因SMN1、SMN2、NAIP、H4F5、GTF2H2均位于5q13.2上，选择同一染色体的临近序列做为参比序列能够很好的避免DNA提取时造成的参比序列和目的序列拷贝数的差异，从而对目的基因拷贝数进行准确定量。SMA1基因是否存在纯合缺失或者复合杂合突变(一个SMN1基因缺失，另一个发生点突变)均能导致疾病的发生，据此分子机制，任何一种分子诊断方法的最终目的都是为了确定SMN1基因拷贝数的确切数值。同时通过准确分析SMN2、NAIP、H4F5、GTF2H2四种修饰基因，尤其是SMN2基因拷贝数情况，有助于临床上SMA疾病严重程度判断和临床分型。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的引物组合(包括扩增引物和质谱延伸探针引物)具有很好的特异性和重复性。利用此引物组合构建的检测方法可以对SMN1、SMN2、NAIP、H4F5、GTF2H2基因相关序列拷贝数进行定量检测，能够直接分析SMA的决定基因和修饰基因是否有缺失、缺失数量和多拷贝，从而能够直接根据分子诊断结果推断临床表型严重程度；本检测方法对SMN1、SMN2、NAIP、H4F5、GTF2H2基因相关序列拷贝数的定量检测，具有良好的灵敏度、特异性、稳定性与准确性，能有效解决假阴性及假阳性等技术瓶颈，准确检测目的基因的拷贝数变异；本检测方法，操作简单、成本相对较低、结果稳定可靠；本检测方法，通量高成本低，具有普遍的代表性和通用性，易于实现自动化和规模化检测，适合大规模人群筛查；本检测方法，还能对部分常见的SMN1上点突变进行基因分型；本检测方法，满足当前SMA防治中大规模人群筛查、产前诊断和常规分子诊断的需要。

附图说明

图1为位于不同染色体参比序列与目的序列洗脱后原始序列拷贝数差异比值示意图。

图2为位于同一染色体参比序列与目的序列洗脱后原始序列拷贝数比值示意图。

图3为各基因引物及探针位置及详细序列。

图4为SMA基因突变DNA质谱快速基因分型方案示意图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

以下实施例中选用的飞行时间质谱相关试剂均购买于以上各试剂均选用广州市于达瑞生物技术股份有限公司。

实施例1一种人类脊髓性肌萎缩症基因检测试剂盒

一、组成

核苷酸序列如SEQ ID NO：1～22所示扩增引物、核苷酸序列如SEQ ID NO：23～35所示的质谱延伸探针引物、多重PCR反应试剂、单碱基延伸反应试剂和去dNTP混合物反应试剂。

其中，所有扩增引物预混为PCR反应扩增引物混合液；所有质谱延伸探针预混为引物延伸引物混合液。

其中，多重PCR反应试剂包括：PCR反应扩增引物混合液、多重PCR酶、延伸反应多重PCR缓冲液、氯化镁缓冲液、dNTP混合物。

PCR反应扩增引物混合液中各引物的扩增目标和浓度见下表4：

表4：

引物延伸引物混合液中各质谱延伸探针的检测目标和浓度见下表5。

表5：

二、使用方法

所用MALDI-TOF DNA质谱分析仪为广州达瑞生物研发生产的飞行时间质谱检测系统，其分析范围4000-10000Daltons，分辨率≥750。PCR扩增反应、去dNTP混合物反应、单碱基延伸反应所用PCR仪器为ABI2720仪或同类仪器，购于美国ABI公司。

1、样品处理

gDNA标本通过以下方法获得：抽取外周全血标本，EDTA抗凝，天根柱式法DNA提取试剂盒抽提得到gDNA标本，或者通过传统的酚氯仿提取gDNA。

将待检gDNA标本，2～3份SMN1、SMN2、NAIP、H4F5、GTF2H2基因拷贝数均为2的正常gDNA标本作为参照标本，以及1～2份SMN1、SMN2、NAIP、H4F5、GTF2H2基因拷贝数已知的质量控制gDNA标本，按照下面的步骤进行检测。

2、PCR扩增反应

每次根据所需检测的标本量，先按照表4的浓度配制PCR反应扩增引物混合液，震荡混匀后瞬时离心，然后依次按照表6反应体系顺序分别加入各组成分(除了模板gDNA以外)，配制成反应混合液。取相应数量的96孔板，将反应混合液震荡混匀10秒后瞬时离心，并分装于96孔板相应的孔中，最后加入模板gDNA。并用封口膜将96孔板封住，震荡混匀后瞬时离心，放入PCR扩增仪。反应所用的96孔板购于美国Axgen有限公司，封口膜购于美国Thermo公司。

表6 PCR扩增反应体系：

PCR扩增反应体系程序为：95℃预变性3min；95℃30sec，58℃30sec，72℃20sec，35个循环；72℃5min；12℃保存。

3、去dNTP混合物反应

向上一步的每孔PCR扩增反应产物中加入2.00μL去dNTP混合物反应体系(表7)，换新的膜将96孔板封住，震荡混匀后瞬时离心。

表7去dNTP混合物反应体系：

去dNTP混合物反应程序为：37℃40min；85℃5min；4℃保存。

4、单碱基延伸反应

先按照表5配制延伸引物混合液，震荡混匀后瞬时离心，然后依次按照表8反应体系顺序分别加入各组成分，配制成单碱基延伸反应混合液。向上一步的去dNTP混合物反应后的每孔产物中加入上述2.00μL单碱基延伸反应混合液，用新的膜将96孔板封住，震荡混匀后瞬时离心。

表8单碱基延伸反应体系：

单碱基延伸反应程序为：95℃预变性30sec；[95℃5sec,(52℃5sec，80℃5sec，5个循环)，40个循环]；72℃3min；4℃保存。

5、质谱检测

打开“板管理系统”软件，编辑实验计划文件，包括样本的位置，样本名称和所用的引物，连接质谱仪与所建立的实验计划文件。点击“芯片托盘进入/推出”按钮，把芯片放在托盘上，再放到芯片甲板上，记录芯片位置(左边记为1，右边记为2)。手不要触及芯片表面；将96孔板放到标有MTP1/2的位置，按A₁在左下角的方向固定好；芯片第一次使用时；在校准品加样槽内加入75μL的校正标准品，芯片非第一次使用时不需要添加校正标准品。然后再点击“芯片托盘进入/推出”按钮，关闭甲板。再点击“添加/维持树脂”按钮，打开树脂槽，添加树脂或者补充灭菌双蒸水(A.仪器第一次开机时需要加28g树脂进入树脂槽并加16ml灭菌双蒸水混匀。B.第一次使用时把9g树脂全部倒入树脂槽内，并加入5.2ml灭菌双蒸水并混匀。C.非第一次使用时，需观察液面，若水的液面低于树脂面，则应补充适量的高压灭菌水。D.树脂溶液加入树脂槽后，需尽快使用，且不能放置超过30天。)质谱检测程序设置参数见表9。

表9质谱检测程序设置参数

6、数据分析和结果判断

定性检测时，根据延伸引物及引物延伸后分子量大小(如表10)，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为当峰值≥2时，突变型峰值/野生型峰值≥0.5的样本为突变阳性，提示该样本存在相应的基因突变，当峰值≥2时，突变型峰值/野生型峰值＜0.5的样本为突变阴性，样本不存在相应的突变位点。

表10各目的基因和突变位点质谱探针及单碱基延伸分子量与基因型列表：

两个内参基因均按上述公式进行推算并将这两次结果取均值，该均值则为目标基因的拷贝数数量。检测结果判定见表11。

表11相对拷贝数定量数据分析结果判定：

实施例2目的基因相对拷贝数计算

以两样本为例，举例说明本发明给出的计算拷贝数的公式的使用方法。

下表为各样本按照实施例1的试剂盒检测后获得的峰面积，并进一步计算了峰面积比例(峰面积比例＝目的基因峰面积/参比基因峰面积)

表12：

所有标本的参比基因相对拷贝数保持为2，正常参考样本目的基因相对拷贝数为2，即可据参考样本峰面积比例为基础计算受检样本目的基因相对拷贝数。

*：受检样本1的目的基因拷贝数＝(0.43/0.44)×2＝1.955，即2拷贝；

受检样本2的目的基因拷贝数＝(0.20/0.44)×2＝0.909，即1拷贝。

实施例3已知基因型样本的检测

一、实验方法

1、样本来源及类型

从实验室标本库中选取和合作医疗机构收集的已确诊基因型的SMA gDNA标本，基因型分别为SMN1/SMN2＝2/0、SMN1/SMN2＝0/2且NAIP、GTF2H2和H4F5基因均无缺失的样本各5份(共10份)，SMN1/SMN2＝2/2且NAIP、GTF2H2和H4F5基因均无缺失的样本10份，用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至10-50ng/μL备用。SMN1基因c.5C>T、c.22dupA、c.275G>C、c.683T>A、c.819_820insT和c.830A>G突变的质粒DNA各3例，用灭菌双蒸水稀释至0.001-0.002pg/μL备用。

2、样本检测

使用实施例1的试剂盒进行样本检测。

二、实验结果

结果见表13。使用实施例1的试剂盒进行样本检测获得的结果与已知的基因型完全一致。

表13：

实施例4人群样本分子筛查应用性评价

一、实验方法

1、样本来源及类型

从实验室EDTA抗凝全血样本库中，随机收集96份，男女各48份，年龄20-50岁。采用前述离心柱式法提取基因组DNA，DNA浓度范围为10～50ng/μL，1.65﹤OD_260/280﹤2.00。

2、样本检测

(1)使用实施例1的试剂盒进行样本检测。

(2)从上述96份待检gDNA标本随机抽取20份用荷兰MRC公司的多重连接探针扩增(Multiple Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA)检测试剂盒(货号：P021-050R)对拷贝数检测结果进行验证。此外，还对该20份样本进行本发明检测范围内的6个点突变位点进行一代测序验证，一代测序体系如下表14。

表14突变位点验证一代测序反应体系：

测序反应程序为95℃预变性3min；95℃30sec+58℃30sec+72℃20sec，35个循环；72℃5min；12℃保存。

二、实验结果

结果见表15和16。96份评价标本的检测结果显示：本发明试剂盒能对目的基因发生纯合缺失及非纯合缺失、多拷贝的样本准确定量，同时突变位点的质谱检测结果与一代测序结果完全一致，在检测范围内目的基因的定量和定性结果准确性与灵敏度均达到100％。由此说明，本发明所建立的飞行时间质谱试剂盒，能快速简便对致病基因SMN1，修饰基因SMN2、GTF2H2、NAIP、H4F5拷贝数定量，以及筛检SMN1上常见的突变。其灵敏度、准确性与实用性能满足当前大规模人群筛查和常规分子诊断要求。

表15 96例gDNA标本SMA相关基因检测结果汇总表：

表16 20例gDNA标本SMA相关基因检测结果验证分析：

序列表

<110> 广州市达瑞生物技术股份有限公司

<120> 一种检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的飞行时间质谱核酸分析方法

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcttgtgaaa caaaatgctt 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataatgctgg cagacttac 19

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcaatgtga aatattttac tggactc 27

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actacaacac ccttctcaca gctc 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtttgatca caatttgctg 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cactgcgcat ttgagagttg t 21

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggaggcaaca catgtaatag aggtaag 27

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgtggtgac cagttttcac ctac 24

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttcaaagcc tttccagtct gtc 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggtttctac acataaccca ttcag 25

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tactgttccg ctcccaga 18

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctgcgacct cacct 15

<210> 13

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gccctcttca aaaga 15

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaatcaattg aagcaatgg 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcaatggccc accaccgcca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tggtggtcca gaaggaaatg 20

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gatgatgctg atgctttg 18

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttgtcaggaa aagatgctga g 21

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgtcagaagt ctaagcca 18

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcttcacttc taaagctaag 20

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gagttcccat tcctgaatga gtc 23

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tctaaatggc aacaacgagc ac 22

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tttattttcc ttacagggtt t 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gaaagtatgt ttcttccaca 20

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gcgcacccgc gggtttgcta tgg 23

<210> 26

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atgagcagcg gcggc 15

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aacatttgtc cccaactttc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aggcagccag catgatagta 20

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

acatgagtgg ctatcat 17

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

agtgattact taccata 17

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ggcctagatg cagttcagtt g 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gtgctctcac tggtagaccc t 21

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccattttcat ggctggaga 19

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tgcatcagat tccacaagct t 21

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gtgcagacgt aggttttca 19

Claims

1.一个用检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的引物组合，其特征在于，包括22条扩增引物和13条质谱延伸探针引物，其中扩增引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：1～22所示序列，质谱延伸探针引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：23～35所示序列。

2.权利要求1所述的引物组合在制备同时检测SMN1、SMN2、NAIP、GTF2H2和H4F5基因型及拷贝数的产品中的应用。

3.一种人类脊髓性肌萎缩症基因检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物组合。

4.根据权利要求3所述的人类脊髓性肌萎缩症基因检测试剂盒，其特征在于，还包括多重PCR反应试剂、单碱基延伸反应试剂和去dNTP混合物反应试剂。

5.根据权利要求3所述的人类脊髓性肌萎缩症基因检测试剂盒，其特征在于，权利要求1所述引物组合为含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1～22所示序列的PCR反应扩增引物混合液和核苷酸序列如SEQ ID NO：23～35所示序列的延伸引物混合液。

6.根据权利要求5所述的人类脊髓性肌萎缩症基因检测试剂盒，其特征在于，PCR反应扩增引物混合液中SEQ ID NO：1～4所示序列和SEQ ID NO：7～10的浓度为1pmol/μL，SEQID NO：5～6所示序列和SEQ ID NO：11～22的浓度为0.5pmol/μL。

7.根据权利要求5所述的人类脊髓性肌萎缩症基因检测试剂盒，其特征在于，延伸引物混合液中，SEQ ID NO：23所示序列的浓度为20pmol/μL；SEQ ID NO. 24所示序列的浓度为15.5pmol/μL；SEQ ID NO. 25所示序列的浓度为8.75pmol/μL；SEQ ID NO. 26所示序列的浓度为7.5pmol/μL；SEQ ID NO. 27所示序列的浓度为7.9pmol/μL；SEQ ID NO. 28所示序列的浓度为6.05pmol/μL；SEQ ID NO. 29所示序列的浓度为9.15pmol/μL；SEQ ID NO. 30所示序列的浓度为9.5 pmol/μL；SEQ ID NO. 31所示序列的浓度为9pmol/μL；SEQ ID NO.32所示序列的浓度为18pmol/μL；SEQ ID NO. 33所示序列的浓度为16.3pmol/μL；SEQ IDNO. 34所示序列的浓度为7 pmol/μL；SEQ ID NO. 35所示序列的浓度为9 pmol/μL。