CN110577990B - 一种检测地贫基因突变的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸检测技术领域,具体涉及一种检测地贫基因突变的试剂盒。该试剂盒包括如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:10所示的扩增引物和如SEQ ID NO:11~SEQ ID NO:28所示的延伸引物。本发明的试剂盒实现了在同一反应体系地贫基因各类型突变热点的基因分型,灵活性与可扩展性兼备,操作简单且高通量低成本,对开展地贫人群筛查、产前诊断等具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域,具体涉及一种检测地贫基因突变的试剂盒。
背景技术
地中海贫血(简称“地贫”)是一组对人类健康影响最大的遗传性溶血性疾病,分子机理是源于α珠蛋白基因簇(16p13.3)或β珠蛋白基因簇(11p15.5)的基因缺失或突变。重型α-地贫胎死腹中并给孕妇带来严重并发症;重型β-地贫患儿出生后3~6个月出现慢性进行性贫血,终生依赖输血及除铁治疗,多于未成年死亡,虽可采用骨髓移植,但组织配型、骨髓来源、治疗费用等因素决定了此治疗只适应于极少数患者。此病为常染色体隐性遗传方式,通过人群分子筛查和基因诊断,对双方均为致病基因携带者的高风险孕妇进行胎儿产前诊断,从而避免重型患儿的出生是目前国际上公认的地贫防治首要措施。然而,实现有效防控目标的前提,就是采用准确实用的基因检测方法进行分子筛查和基因诊断。检测方法操作越简单、成本越低,则推广容易而惠及面广;检测位点越多、范围越全,则灵敏度高而漏检率低。
目前临床上的地贫基因检测常规方法有跨越断裂点的PCR扩增法和反向点杂交(Reverse dot-blot,RDB),Gap-PCR是通过设计位于突变基因断裂点两侧的3个引物,构成两个独立的、跨越断点的PCR体系来鉴别样品的基因型,广泛用于α-地贫基因缺失的诊断。RDB是检测点突变的一种新技术,用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交,使一次杂交即可同时筛查出被检DNA的多种突变,用于检测α-地贫基因点突变和β-地贫基因点突变。基于这两种方法的商品化试剂盒,已在临床使用了二十多年,然而存在通量低、耗时长、操作繁琐、成本高、检测位点不完全等问题,尤其是PCR扩增后对产物分析开管操作而造成的实验室携带污染所导致的假阳性或假阴性严重后果,已明显不能满足当前大规模人群分子筛查和常规分子诊断的方法学要求。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一,提供一种单反应管检测α-地贫基因缺失、α-地贫基因点突变、β-地贫基因点突变的方法,该方法灵活性与可扩展性兼备,操作简单且高通量自动化,能满足地贫大规模人群分子筛查和常规基因诊断的要求。
因此,本发明的目的之一在于提供一种引物组。
本发明的另一目的在于提供一种上述引物组在制备地贫基因突变的检测试剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种上述试剂盒的使用方法。
本发明所采用的技术方案如下文所述。
一种引物组,所述引物组包括如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:10所示的扩增引物和如SEQ ID NO:11~SEQ ID NO:28所示的延伸引物。
在本发明的一些具体实施方案中,所述引物组可以由本领域常规技术手段合成。
本发明还提供一种所述引物组在制备地贫基因突变的检测试剂中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中,所述地贫基因突变包括α地贫基因-α3.7缺失、α地贫基因--SEA缺失、α地贫基因-α4.2缺失、α地贫基因αWSα点突变、α地贫基因αQSα点突变、α地贫基因αCSα点突变、β地贫基因–32(C>A)点突变、β地贫基因-29(A>G)点突变、β地贫基因-28(A>G)点突变、β地贫基因Cap+1(A>C)点突变、β地贫基因Int(ATG>AGG)点突变、β地贫基因CD17(A>T)点突变、β地贫基因CD26(G->A)点突变、β地贫基因IVS-1-1(G>T)点突变、β地贫基因CD41/42(-TCTT)点突变、β地贫基因CD43(G>T)点突变、β地贫基因IVS-2-654(C>T)点突变或β地贫基因CD71/72(+A)点突变中的至少一种。
本发明还提供一种检测基因突变的试剂盒,所述试剂盒包括:如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:10所示的扩增引物和如SEQ ID NO:11~SEQ ID NO:28所示的延伸引物。
在本发明的一些具体实施方案中,所述扩增引物用来特异性扩增α2珠蛋白基因Z-box区域、--SEA地贫基因缺失截短序列、-α4.2地贫基因缺失截短序列、-α3.7地贫基因缺失截短序列和β珠蛋白基因序列。
在本发明的一些具体实施方案中,所述延伸引物用来特异性检测α地贫基因-α3.7缺失、α地贫基因--SEA缺失、α地贫基因-α4.2缺失、α地贫基因αWSα点突变、α地贫基因αQSα点突变、α地贫基因αCSα点突变、β地贫基因–32(C>A)点突变、β地贫基因-29(A>G)点突变、β地贫基因-28(A>G)点突变、β地贫基因Cap+1(A>C)点突变、β地贫基因Int(ATG>AGG)点突变、β地贫基因CD17(A>T)点突变、β地贫基因CD26(G->A)点突变、β地贫基因IVS-1-1(G>T)点突变、β地贫基因CD41/42(-TCTT)点突变、β地贫基因CD43(G>T)点突变、β地贫基因IVS-2-654(C>T)点突变和β地贫基因CD71/72(+A)点突变。
在本发明的一些具体实施方案中,所述基因突变导致地中海贫血。
在本发明的一些具体实施方案中,所述基因突变包括点突变、截短突变和缺失突变中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中,所述试剂盒还包括PCR扩增体系;优选地,所述PCR扩增体系包括模板gDNA、DNA聚合酶、缓冲液、dNTP和灭菌双蒸水,更优选地,还包括甜菜碱和二甲基亚砜。
在本发明的一些具体实施方案中,所述DNA聚合酶为High Affinity HotStartTaq,所述模板gDNA为正常基因型对照gDNA。
在本发明的一些具体实施方案中,所述PCR扩增体系总体积为5.00μl,其中各组分的反应终浓度为:
在本发明的一些具体实施方案中,所述试剂盒的PCR扩增程序为:
95℃预变性8min;95℃15sec+66℃30sec,72℃1min45sec,28个循环;72℃5min。
在本发明的一些具体实施方案中,所述试剂盒还包括去dNTP体系。
在本发明的一些具体实施方案中,所述去dNTP体系包括磷酸酶缓冲液、磷酸消化酶和灭菌双蒸水。
在本发明的一些具体实施方案中,所述去dNTP体系中各组分的反应终浓度为:
磷酸酶缓冲液 0.17μl
磷酸消化酶 0.30μl
灭菌双蒸水 补足反应体系体积至2.00μl
在本发明的一些具体实施方案中,所述去dNTP体系的反应程序为:37℃预变性40min;85℃5min。
在本发明的一些具体实施方案中,所述试剂盒还包括单碱基延伸反应体系。
在本发明的一些具体实施方案中,所述单碱基延伸反应体系包括延伸缓冲液、延伸终止混合物、反应催化酶、延伸引物混合物和灭菌双蒸水。
在本发明的一些具体实施方案中,所述单碱基延伸反应体系中各组分的反应终浓度为:
在本发明的一些具体实施方案中,每100μl所述延伸引物混合液的组成包括:
在本发明的一些具体实施方案中,所述单碱基延伸反应体系的反应程序为:95℃预变性30sec;95℃30sec,(58℃5sec,80℃5sec,5个循环),40个循环;72℃3min。
在本发明的一些具体实施方案中,所述试剂盒基于MALDI-TOF质谱平台进行检测。
本发明还提供一种上述引物组或上述试剂盒在地贫基因分型中的用途。
本发明还提供一种上述试剂盒的使用方法,包括:
取待测样本gDNA经PCR扩增和单碱基延伸反应后,所得产物用MALDI-TOF质谱仪进行检测,根据质谱峰值实现快速基因分型。
本发明还提供一种地贫基因突变的检测方法,包括:取待测样本gDNA与上述引物组经扩增反应和单碱基延伸反应后,所得产物用MALDI-TOF质谱仪进行检测,根据质谱峰值实现快速检测。
本发明还提供一种地贫基因分型的方法,包括:取待测样本gDNA与上述引物组经扩增反应和单碱基延伸反应后,所得产物用MALDI-TOF质谱仪进行检测,根据质谱峰值实现快速检测。
本发明的有益效果为:
本发明基于地中海贫血源于16号染色体α珠蛋白基因簇(16p13.3)和11号染色体β珠蛋白基因簇(11p15.5)的基因突变。对于点突变位点的检测是通过PCR反应富集目标序列后,设计3’末端距离目标检测位点仅隔一个碱基的质谱探针,以四种经过修饰的分子量大小不一样的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)为底物进行单碱基延伸反应,根据延伸碱基种类对检测位点进行分型。对于缺失突变位点的检测是富集目标序列后,在缺失的片段上设计质谱探针,若目标位点存在缺失突变,则相应的质谱探针结合到突变后的序列上,并在3’末端延伸一个碱基;反之,则质谱探针无结合和延伸。因此可以根据质谱探针是否延伸来判断缺失突变的有无。
本发明设计的引物组无需添加荧光素、生物素等其它标记,且对α-地中海贫血珠蛋白和β-地中海贫血珠蛋白基因缺失和点突变的检测,具有良好的灵敏度、稳定性与准确性。
本发明以地贫基因作为靶点,针对大片段缺失、点突变、拷贝数变异等多突变类型,尤其是高GC复杂二级结构及序列高同源的DNA结构特征,设计出的试剂盒能够对上述突变并行检测,实现了多基因、多位点、多突变类型的DNA质谱分析快速基因分型。
本发明采用MALDI-TOF质谱平台,具有极高的精确度和极快的速度,上样检测与结果分析均可自动化,反应体系仅普通寡核苷酸而无须荧光标记,人力成本与检测成本低,适合大规模人群分子筛查和常规基因诊断。
本发明实现了在同一反应体系地贫基因各类型突变热点的基因分型,灵活性与可扩展性兼备,操作简单且高通量低成本,能有效满足地贫基因快速检测这一核心问题的方法学研究趋势与现实需求。
附图说明
图1示出了实施例1中PCR扩增产物的电泳图;
图2示出了实施例1扩增引物优化后的PCR扩增产物的电泳图;
图3示出了实施例4中18种基因型批内重复性评价检测结果;
图4示出了实施例4中18种基因型批间稳定性评价检测结果。
具体实施方式
近年来的研究在检测通量、自动化与标准化方面取得了一定进展:如采用变性高效液相色谱(DHPLC)或高分辨熔解曲线(HRM)技术检测点突变,采用多重连接探针扩增(MLPA)或实时定量PCR技术检测地贫基因缺失,以及采用液态芯片和二代测序(NGS)技术平台的多位点同时检测。
发明人所在课题组基于荧光PCR技术平台,能实现一次性闭管检测,在一定程度上简化了操作并降低了工作量和试剂成本,有明显的临床推广应用价值。然而,此方案的检测容量有限,检测条件也难以统一,只能采用多反应管、多反应体系、多反应条件、多突变位点组合,才能实现多基因、多位点、多突变类型的基因分型。
发明人所在课题组基于NGS平台的研究提示,珠蛋白基因的高同源序列(α1和α2基因、β和ψβ基因等)及NGS的读长限制(<150bp),明显影响Reads Mapping(测序得到的DNA片段在基因组上定位)的准确性,因而数据分析具有挑战性、结果具有不确定性,且操作繁琐、检测成本昂贵、检测时间长(5-7天),还需要凑齐一定样本量方可上机检测,目前情况下常规应用尚不现实。尤其是随着分子流行病学的进一步研究,发现某些突变位点在某一地区和人群中有一定的携带率,有必要作为突变热点纳入常规检测而以防漏检,由此凸现了检测方法的灵活性与可扩展性非常重要。
质谱能快速而极为准确地测定生物大分子的分子量,灵敏度高、样品用量少、分析速度快,一直以来在蛋白质组研究领域有着举足轻重的作用。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry,MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型生物质谱,该技术采用“软电离”方式而产生稳定分子离子,因而是测定生物大分子分子量的有效方法,其无论是在理论上还是在设计上都十分简单和高效,在核酸分析研究方面已取得了突破性进展。众所周知,在分子生物学实验中合成的寡核苷酸引物、探针,为判断合成是否完全、合成的序列是否正确、合成的产物纯度是否符合要求,质谱是迄今为止最好的检测手段。MALDI-TOF-MS的基本原理是带电样本分子在外加电场的作用下“飞”向探测器,飞行时间与样本分子的荷/质比(电荷/分子量)成一定比例关系,以此获得待测物质的精确分子量。分子量是有机化合物最基本的理化性质参数,一个DNA片段有其特有的分子量,当此序列中增加或减少一个碱基,甚至其中某个碱基替换成另外一个碱基,其分子量即发生了变化,MALDI-TOF-MS即是检测这种差异最灵敏的技术,准确度高达0.1%~0.01%,远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。MALDI-TOF-MS的一个质谱峰即对应一特定分子量的DNA分子,以此实现定性鉴别。
本发明于一个反应管内同时扩增突变热点所包含的缺失突变截短目的序列、点突变物理位置目的基因序列,即多基因目的序列PCR扩增。然后加入各缺失型突变截短序列特异性及各点突变位点特异性单碱基延伸引物,经与目标序列的特异性杂交、单碱基延伸,生成大量与突变热点相对应的DNA小分子,即突变热点探针单碱基延伸。最后,将产物于MALDI-TOF质谱仪自动进样检测,根据样本检测质谱图,可采用自动分析软件或人工方式进行结果判读而获得基因分型结果。实现了同一反应体系同步检测各类型突变热点的地贫基因的快速分型。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改,这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
材料及试剂说明
DNA聚合酶(HA Taq)、外周血基因组DNA柱式提取试剂购于天根生化科技(北京)有限公司;dNTPs购于宝生物工程(大连)有限公司;去dNTP的碱性磷酸酶试剂、ddNTP单碱基延伸试剂、MALDI-TOF-MS基质芯片等由广州市达瑞生物技术股份有限公司提供;96孔板购于美国Axgen公司;封口膜购于美国Thermo公司;MALDI-TOF DNA质谱分析仪为广州达瑞生物技术股份有限公司生产的飞行时间质谱检测系统,其分析范围4000-10000Daltons。PCR扩增反应、去dNTP混合物反应、单碱基延伸反应所用PCR仪器为ABI2720或Bio-Rad C1000。
实施例1.引物设计
基于地贫基因突变热点所包含的缺失突变截短目的序列、点突变物理位置目的基因序列设计了扩增引物和延伸引物。
其中,扩增引物包括:
(1)一对特异性扩增α2珠蛋白基因Z-box区域的引物中,
上游引物序列为:5’-CTTTCCCTACCCAGAGCCAAG-3’(SEQ ID NO:29),
下游引物序列为:5’-CGAGGCTCCAGCTTAACGGTATTT 3’(SEQ ID NO:30);
(2)一对特异性扩增--SEA地贫基因缺失截短序列的引物中,
上游引物序列为:5’-TTCCCATATCGCACAAAGATTG-3’(SEQ ID NO:31),
下游引物序列为:5’-GGGCATAAAATTGTATGTG-3’(SEQ ID NO:32);
(3)一对特异性扩增-α4.2地贫基因缺失截短序列的引物中,
上游引物序列为:5’-AGTCAGTGGGGAAGGAGGAA-3’(SEQ ID NO:33),
下游引物序列为:5’-TTCTGACTCTGCCCACAGCCT-3’(SEQ ID NO:34);
(4)一对特异性扩增-α3.7地贫基因缺失截短序列的引物中,
上游引物序列为:5’-ACAACCAGTATTTACCTAGCAAGT-3’(SEQ ID NO:35),
下游引物序列为:5’-TTCGCGGTGGCTCCACTTTC-3’(SEQ ID NO:36);
(5)一对特异性扩增β珠蛋白基因序列的引物中,
上游引物序列为:5’-GCTCAAGGCCCTTCATAATATCC-3’(SEQ ID NO:37),
下游引物序列为:5’-TTATGGTAGACAAAACTCTTC-3’(SEQ ID NO:38);
延伸引物包括:
(6)特异性检测α地贫基因--SEA缺失的质谱分析特异性探针为:
5’-GTCCTTCAGCTGTAA-3’(SEQ ID NO:11);
(7)特异性检测α地贫基因-α4.2缺失的质谱分析特异性探针为:
5’-CCGGAATGTGCCAACAGTG-3’(SEQ ID NO:12);
(8)特异性检测α地贫基因-α3.7缺失的质谱分析特异性探针为:
5’-GGACACACATGGCTAGAACCTCTC-3’(SEQ ID NO:13)。
(9)特异性检测α地贫基因αWSα点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-cacccctgcggtgca-3’(SEQ ID NO:14)。
(10)特异性检测α地贫基因αQSα点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-cggtgcacgcctccc-3’(SEQ ID NO:15)。
(11)特异性检测α地贫基因αCSα点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-Cctaccgaggctccagctt-3’(SEQ ID NO:16)。
(12)特异性检测β地贫基因–32(C>A)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-Tgagccagggctggg-3’(SEQ ID NO:17)。
(13)特异性检测β地贫基因-29(A>G)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-ggctctgccctgacttt-3’(SEQ ID NO:18)。
(14)特异性检测β地贫基因-28(A>G)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-Tgccagggctgggcata-3’(SEQ ID NO:19)。
(15)特异性检测β地贫基因Cap+1(A>C)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-Gcagttgtgtcagaagcaaatg-3’(SEQ ID NO:20)。
(16)特异性检测β地贫基因Int(ATG>AGG)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-Cgcaacctcaaacagacacca-3’(SEQ ID NO:21)。
(17)特异性检测β地贫基因CD17(A>T)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-aacttcatccacgttcacct-3’(SEQ ID NO:22)。
(18)特异性检测β地贫基因CD26(G->A)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-cctgcccagggcct-3’(SEQ ID NO:23)。
(19)特异性检测β地贫基因IVS-1-1(G>T)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-Ctgtcttgtaaccttgataccaa-3’(SEQ ID NO:24)。
(20)特异性检测β地贫基因CD41/42(-TCTT)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-CAACcattccgggacagagagaa-3’(SEQ ID NO:25)。
(21)特异性检测β地贫基因CD43(G>T)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-Gggacagatccccaaaggact-3’(SEQ ID NO:26)。
(22)特异性检测β地贫基因IVS-2-654(C>T)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-acagtgataatttctgggttaagg-3’(SEQ ID NO:27)。
(23)特异性检测β地贫基因CD71/72(+A)点突变的质谱分析特异性探针为:
5’-tgagccaggccatcact-3’(SEQ ID NO:28)。
PCR扩增体系如表1所示。
表1本发明试剂盒PCR反应体系
PCR扩增程序为:95℃预变性8min;95℃15sec+66℃30sec,72℃1min45sec,28个循环;72℃5min;4℃保存。
利用上述反应条件进行PCR扩增实验,扩增结果如图1所示。
在此基础上,对扩增引物进一步优化,优化后的扩增引物为:
(1)一对特异性扩增α2珠蛋白基因Z-box区域的引物中,
上游引物序列为:5’-CTTCCTTCCTCACCCCACATCC-3’(SEQ ID NO:1),
下游引物序列为:5’-AGGCTCCAGCTTAACGGTATTT-3’(SEQ ID NO:2);
(2)一对特异性扩增--SEA地贫基因缺失截短序列的引物中,
上游引物序列为:5’-AGAAGCTGAGTGATGGGTCCG-3’(SEQ ID NO:3),
下游引物序列为:5’-ATGAGTGTGAGTTTGCACCT-3’(SEQ ID NO:4);
(3)一对特异性扩增-α4.2地贫基因缺失截短序列的引物中,
上游引物序列为:5’-TACTCACACTTCCTGTGTCATGGTG-3’(SEQ ID NO:5),
下游引物序列为:5’-TCTGCCCACAGCCTGAA-3’(SEQ ID NO:6);
(4)一对特异性扩增-α3.7地贫基因缺失截短序列的引物中,
上游引物序列为:5’-ACCTACATTCTGCAACCACA-3’(SEQ ID NO:7),
下游引物序列为:5’-AAGAGCAAATGCATCCTCA-3’(SEQ ID NO:8);
(5)一对特异性扩增β珠蛋白基因序列的引物中,
上游引物序列为:5’-AGGCAGAATCCAGATGCTCAA-3’(SEQ ID NO:9),
下游引物序列为:5’-GGATATTATGAAGGGCCTTGAGC-3’(SEQ ID NO:10);
利用上述反应条件进行PCR扩增实验,扩增结果如图2所示。
实施例2.地贫基因突变检测试剂盒的组装
1、本发明检测基因突变的试剂盒包括如下组分:
(1)引物组,如实施例1所示;
(2)PCR扩增体系如实施例1所示;
(3)去dNTPs反应体系如表2所示:
表2去dNTPs反应体系
(4)单碱基延伸反应体系如表3所示:
表3本发明试剂盒单碱基延伸反应体系
其中,每100.00μl延伸引物混合液的组成如表4所示
表4延伸引物混合液体系
2、上述试剂盒的使用方法
(1)根据检测的样本数目,按照表1将PCR反应总体系的各组分(模板gDNA除外),按照项目所需的量添加到1.5mLPCR管中,配制成PCR反应混合物。取相应数量的96孔板,将反应混合液震荡混匀10秒后瞬时离心,并分装于96孔板相应的孔中,最后加入模板gDNA用封口膜将96孔板封住,震荡混匀后瞬时离心,放入PCR扩增仪。
PCR扩增程序为:95℃预变性8min;95℃15sec+66℃30sec,72℃1min45sec,28个循环;72℃5min;4℃保存。
(2)向每孔PCR产物中加入2.00μl如表2所示的去dNTPs反应体系,更换新的膜将96孔板封住,震荡混匀后瞬时离心。
去dNTPs反应体系的反应程序为:37℃预变性40min;85℃5min;12℃保存。
(3)按照表4配制延伸引物混合液,震荡混匀后瞬时离心,然后依次按照表3反应体系顺序分别加入各组成分,配制成单碱基延伸反应混合液。向去dNTPs反应后的每孔产物中加入上述2.00μl单碱基延伸反应混合液,用新的膜将96孔板封住,震荡混匀后瞬时离心。
单碱基延伸反应程序为:95℃预变性30sec;95℃30sec,(58℃5sec,80℃5sec,5个循环),40个循环;72℃3min;4℃保存。
(4)反应结束后,2000rpm瞬时离心,每孔加入41μl的灭菌双蒸水(此时每孔内的总体积为50μl),换新的膜将96孔板封住,震荡混匀后,瞬时离心。
(5)质谱检测:打开“板管理系统”软件,编辑实验计划文件,包括样本的位置,样本名称和所用的引物,连接质谱仪与所建立的实验计划文件。点击“芯片托盘进入/推出”按钮,把芯片放在托盘上,再放到芯片甲板上,记录芯片位置(左边记为1,右边记为2)。手不要触及芯片表面。将96孔板放到标有MTP1/2的位置,按A1在左下角的方向固定好;芯片第一次使用时;在校准品加样槽内加入75μl的校正标准品,芯片非第一次使用时不需要添加校正标准品。然后再点击“芯片托盘进入/推出”按钮,关闭甲板。再点击“添加/维持树脂”按钮,打开树脂槽,添加树脂或者补充灭菌双蒸水(A.仪器第一次开机时需要加28g树脂进入树脂槽并加16ml灭菌双蒸水混匀。B.第一次使用时把9g树脂全部倒入树脂槽内,并加入5.2ml灭菌双蒸水并混匀。C.非第一次使用时,需观察液面,若水的液面低于树脂面,则应补充适量的高压灭菌水。D.树脂溶液加入树脂槽后,需尽快使用,且不能放置超过30天。)。其中,质谱检测程序的参数如表5所示。
表5质谱检测程序设置参数
(6)样品处理:用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至15-200ng/μl备用。其中gDNA标本可以通过以下方法获得:抽取外周全血标本,EDTA抗凝,采用天根柱式外周血基因组DNA柱式提取试剂(北京天根生物技术公司)抽提得到gDNA样本。
(7)样本检测:将待检gDNA标本,2-3份α和β珠蛋白基因均正常的对照gDNA样本,以及1-2份α珠蛋白基因突变(6种,分别为--SEA、-α3.7、-α4.2缺失和WS、QS、CS点突变)和β珠蛋白基因突变(12种,分别为–32(C>A)、-29(A>G)、-28(A>G)、Cap+1(A>C)、Int(ATG>AGG)、CD17(A>T)、CD41/42(-TCTT)、CD71/72(+A)、IVS-2-654(C>T)、CD26(G>A)、CD43(G>T)和IVS-1-1(G>T))的质控gDNA样本,应用上述反应体系和反应程序,于飞行时间质谱上进行检测,检测结果用Typer 4.0软件(美国Agena公司)分析。
(8)数据分析和结果判断:利用Typer 4.0软件,根据延伸引物及引物延伸后分子量大小(如表6)判读目标位点的基因型。对于点突变的位点(表6中4-18号突变),判断原则为当峰值≥2时,突变型峰值/野生型峰值≥0.5的样本为突变阳性,提示该样本存在相应的基因突变,当峰值≥2时,突变型峰值/野生型峰值<0.5的样本为突变阴性,样本不存在相应的突变位点。对于缺失型α-地贫基因位点(表6中1-3号突变):当突变型峰值/延伸引物峰≥0.5的样本为突变阳性;反之为阴性。其中为突变阳性的位点,结合非缺失型α-地贫基因位点判别是杂合缺失或纯合缺失。若非缺失型α-地贫基因位点为纯合突变,则样本该位点检测结果为纯合缺失。反之,检测结果为杂合缺失。
表6各突变位点质谱探针、野生型和突变型对应分子量表
实施例3.试剂盒的灵敏性与准确性小样本评价
(1)样本来源及类型:选取已确诊的缺失型α-地贫和β地贫gDNA标本,基因型分别为-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα、--SEA/-α4.2、--SEA/--SEA、-SEA/-α3.7、-α3.7/-α3.7、-α4.2/-α4.2、αα/αWSα、αα/αQSα、αα/αCSα、、αWSα/αWSα、αCSα/αCSα、αQSα/αQSα、βN/βCD41-42、βCD41-42/βCD41-42、βN/βIVS-II-654、βIVS-II-654/βIVS-II-654、βN/β-28、β-28/β-28、βN/βCD71-72(+A)、βCD71-72(+A)/βCD71-72(+A)、βN/βCD17、βCD17/βCD17、βN/βCD26、βCD26/βCD26、βN/βIVS-I-1、βIVS-I-1/βIVS-I-1、βN/βCD43、βCD43/βCD43、βN/β-32、β-32/β-32、βN/β-29、β-29/β-29、βN/βCap+1、βCap+1/βCap+1、βN/βInt、βInt/βInt各1份(共38份),用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至15-200ng/μl备用。
(2)样本检测:将上述待检gDNA标本,2份α和β珠蛋白基因均无突变的正常对照gDNA样本,以及1-2份质量控制标本,按照表1配制PCR扩增体系,在体系中分别加入5ng、15ng、30ng、60ng、120ng、240ng,按照反应程序:95℃预变性8min;95℃45sec+66℃1min,72℃1min45sec,32个循环;72℃5min,进行PCR扩增。扩增完成后,按表2于每个反应管加入去dNTP反应体系并按反应条件(37℃40min;85℃5min)于Bio-Rad C1000 PCR仪上去除残留的dNTPs;然后再按表3及表4于每个反应管中加入各目的基因及突变位点质谱延伸探针及ddNTPS单碱基延伸试剂,按反应条件(95℃预变性30sec;95℃30sec,(58℃5sec,80℃5sec,5个循环),40个循环;72℃3min)于Bio-Rad C1000 PCR仪上进行单碱基延伸。反应完成后,于达瑞生物飞行时间质谱检测系统上,用树脂封片去除体系中的盐离子,后将延伸产物点样至芯片,按表5设置质谱参数进行质谱分析。
(3)数据分析和结果判断:利用Typer 4.0软件,根据延伸引物及引物延伸后分子量大小(如表6)判读目标位点的基因型。对于点突变的位点(表6中4-18号突变),判断原则为当峰值≥2时,突变型峰值/野生型峰值≥0.5的样本为突变阳性,提示该样本存在相应的基因突变,当峰值≥2时,突变型峰值/野生型峰值<0.5的样本为突变阴性,样本不存在相应的突变位点。对于缺失型α-地贫基因位点(表6中1-3号突变):当突变型峰值/延伸引物峰≥0.5的样本为突变阳性;反之为阴性。其中为突变阳性的位点,结合非缺失型α-地贫基因位点判别是杂合缺失或纯合缺失。若非缺失型α-地贫基因位点为纯合突变,则样本该位点检测结果为纯合缺失。反之,检测结果为杂合缺失。
3、检测结果:
检测结果见表7和表8。根据所检标本已知的基因型与本案例分析的结果相比较,本试剂盒准确性达到100%,灵敏度达15ng/T。
表7本发明试剂盒检测40例已知基因型样本结果
表8本发明试剂盒检测体系灵敏度结果
注:“﹢”表示在此DNA浓度下,检测体系可以对其准确检出,“-”表示在此DNA浓度下,检测体系不能对其准确检出。
实施例4.试剂盒的重复性和稳定性评价
1、样本收集:
收集218例经gap-PCR和RDB检测的已知基因型gDNA标本,此批标本包含-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα、αα/αWSα、αα/αQSα、αα/αCSα、βN/βCD41-42、βN/βIVS-II-654、βN/β-28、βN/βCD71-72(+A)、βN/βCD17、βN/βCD26、βN/βIVS-I-1、βN/βCD43、βN/β-32、βN/β-29、βN/βCap+1和βN/βInt18种基因型,用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至15-200ng/μl备用。
2、样本检测:
将上述待检gDNA标本,2份α和β珠蛋白基因均无突变的正常对照gDNA样本,以及1-2份质量控制标本,按照表1配制PCR扩增体系,按照反应程序:95℃预变性8min;95℃45sec+66℃1min,72℃1min45sec,32个循环;72℃5min,进行PCR扩增。扩增完成后,按表2于每个反应管加入去dNTP反应体系并按反应条件(37℃40min;85℃5min)于ABI27200 PCR仪上去除残留的dNTPs;然后再按表3及表4于每个反应管中加入各目的基因及突变位点质谱延伸探针及ddNTPS单碱基延伸试剂,按反应条件(95℃预变性30sec;95℃30sec,(58℃5sec,80℃5sec,5个循环),40个循环;72℃3min)于ABI2720 PCR仪上进行单碱基延伸。反应完成后,于飞行时间质谱检测系统上,用树脂封片去除体系中的盐离子,后将延伸产物点样至芯片,按表5设置质谱参数进行质谱分析。每个样本进行16次重复性试验;同时,对该体系稳定性做评价,在24天内,每隔2天将19种基因型各取一管进行检测,共检测12次,通过统计各个位点每次检测的突变型峰值和野生型峰值的比值或突变型峰值和延伸引物峰值的比值,进行稳定性分析。
3、数据分析和结果判断:
利用Typer 4.0软件,根据延伸引物及引物延伸后分子量大小(如表6)判读目标位点的基因型。对于点突变的位点(表6中4-18号突变),判断原则为当峰值≥2时,突变型峰值/野生型峰值≥0.5的样本为突变阳性,提示该样本存在相应的基因突变,当峰值≥2时,突变型峰值/野生型峰值<0.5的样本为突变阴性,样本不存在相应的突变位点。对于缺失型α-地贫基因位点(表6中1-3号突变):当突变型峰值/延伸引物峰≥0.5的样本为突变阳性;反之为阴性。其中为突变阳性的位点,结合非缺失型α-地贫基因位点判别是杂合缺失或纯合缺失。若非缺失型α-地贫基因位点为纯合突变,则样本该位点检测结果为纯合缺失。反之,检测结果为杂合缺失。通过统计各个位点每次检测的突变型峰值和野生型峰值的比值或突变型峰值和延伸引物峰值的比值,进行稳定性分析。
检测结果如图3~4所示,其中,图3为18种基因型批内重复性评价检测结果(横坐标表示检测次数。对于3.7、4.2和SEA缺失突变的位点,纵坐标表示突变型峰值和延伸引物峰值的比值;对于其他点突变位点,纵坐标表示突变型峰值和野生型峰的比值),每个样本16次重复性试验结果均一致,结果表明本试剂盒的检测体系具有良好的重复性。图4为18种基因型批间稳定性评价检测结果(横坐标表示检测次数。对于3.7、4.2和SEA缺失突变的位点,纵坐标表示突变型峰值和延伸引物峰值的比值;对于其他点突变位点,纵坐标表示突变型峰值和野生型峰的比值),每个样本隔天12次检测结果均一致,结果表明本试剂盒的检测体系具有良好的稳定性。
实施例5.小规模人群筛查检测评价
1、样本收集:
随机收集96份EDTA抗凝全血标本,男女各48份,年龄20-50岁。再用外周血基因组DNA柱式提取试剂抽提gDNA,以灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至15-200ng/μl备用。
2、样本检测:
将上述96份待检gDNA标本,采用双盲的方法,同时应用缺失型α-地贫gap-PCR方法、RDB法及本试剂盒平行检测。本试剂盒的检测方法为:将上述待检gDNA标本,2份α和β珠蛋白基因均无突变的正常对照gDNA样本,以及1-2份质量控制标本,应用上述本发明的反应体系(表1),以及反应程序(95℃预变性8min;95℃45sec+66℃1min,72℃1min45sec,32个循环;72℃5min)进行PCR扩增。扩增完成后,按表2于每个反应管加入去dNTP反应体系并按反应条件(37℃40min;85℃5min)于Bio-Rad C1000 PCR仪上去除残留的dNTPs;然后再按表3及表4于每个反应管中加入各目的基因及突变位点质谱延伸探针及ddNTPS单碱基延伸试剂,按反应条件(95℃预变性30sec;95℃30sec,(58℃5sec,80℃5sec,5个循环),40个循环;72℃3min)于Bio-Rad C1000 PCR仪上进行单碱基延伸。反应完成后,于达瑞生物飞行时间质谱检测系统上,用树脂封片去除体系中的盐离子,后将延伸产物点样至芯片,按表5设置质谱参数进行质谱分析。
3、检测结果:
两种检测方法均检出31例标本有α珠蛋白基因缺失,1例有α珠蛋白基因点突变,16例有β珠蛋白基因点突变,48例无上述突变,阴性与阳性符合率100%。其中,31例α珠蛋白基因缺失标本中,由Gap-PCR检测的α珠蛋白基因缺失类型和数目,与本发明所述的试剂盒所获得的基因拷贝数结果一致;1例α珠蛋白基因点突变标本,由RDB法所检出的α珠蛋白基因突变点突变类型,与本发明所述的试剂盒所获得的点突变类型一致;16例β珠蛋白基因点突变标本,由RDB法所检出的β珠蛋白基因点突变类型,与本发明所述的试剂盒所获得的点突变类型一致,符合率达100%(见表9);表9中,目标基因型一栏为采用本发明试剂盒测得的基因型,α珠蛋白基因一栏为采用Gap-PCR法和RDB法检测的α珠蛋白基因缺失和点突变类型,β珠蛋白基因一栏为采用RDB法检测的β珠蛋白基因点突变类型。
表9 48例随机人群α珠蛋白基因和β珠蛋白基因突变筛查阳性检测结果
实施例6.大样本盲法分析评价
1、样本收集:
选取表型资料完整、均已用gap-PCR方法、RDB法检测过的常见α珠蛋白基因和β珠蛋白基因突变的gDNA标本480份,包含-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα、αα/αWSα、αα/αQSα、αα/αCSα、βN/βCD41-42、βN/βIVS-II-654、βN/β-28、βN/βCD71-72(+A)、βN/βCD17、βN/βCD26、βN/βIVS-I-1、βN/βCD43、βN/β-32、βN/β-29、βN/βCap+1、βN/βInt这18种多见的α-地贫和β-地贫基因型。这批标本,先检测其浓度,按所需标本量为1μl、DNA浓度为20ng/μl左右进行稀释,然后,于核酸蛋白分析仪上,测定标本浓度以保证DNA浓度范围为15-200ng/μl,OD260/280>1.55,对于不符合要求的标本,不纳入本次评价分析。
2、样本检测:
将上述480份待检gDNA标本,进行盲法编号后,应用实施例2的试剂盒进行检测。
3、检测结果:
此批480份盲法分析标本中,有3例DNA浓度和纯度未达到要求,未纳入汇总分析。有效的477份评价标本的检测结果如表10和表11所示,可见本发明试剂盒能对目的基因发生纯合缺失及非纯合缺失、多拷贝的样本准确定量,同时突变位点的质谱检测结果与一代测序结果完全一致,在检测范围内目的基因的定量和定性结果准确性与灵敏度均达到100%,表11中,目标基因型一栏为采用本发明试剂盒测得的样本的基因型,α珠蛋白基因一栏为采用Gap-PCR法和RDB法检测的α珠蛋白基因缺失和点突变类型,β珠蛋白基因一栏为采用RDB法检测的β珠蛋白基因点突变类型。
由此说明,本发明所建立的定量PCR试剂盒,能实现缺失型α-地贫和β-地贫快速分子诊断,其灵敏度、准确性与实用性能满足当前大规模人群筛查和常规分子诊断要求;并能初步筛检α珠蛋白基因多拷贝、点突变和β珠蛋白基因点突变。
表10 477例盲法标本α-地贫和β-地贫基因突变诊断结果汇总分析
表11 477例盲法标本α-地贫和β-地贫基因突变诊断结果汇总表
本发明以MALDI-TOF-MS为技术平台,采用目标基因模板多重PCR富集扩增及位点特异性质谱探针单碱基延伸策略,建立同一反应体系同步检测各类型突变热点的地贫基因快速分型方法,灵活性与可扩展性兼备,操作简单且高通量自动化,符合大规模人群分子筛查和常规基因诊断的要求。
本领域技术人员应该理解的是,本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言,本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是,本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案,且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市达瑞生物技术股份有限公司&南方医科大学
<120> 检测地贫基因突变的试剂盒
<130> 111
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttccttcct caccccacat cc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggctccagc ttaacggtat tt 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaagctgag tgatgggtcc g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgagtgtga gtttgcacct 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tactcacact tcctgtgtca tggtg 25
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctgcccaca gcctgaa 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acctacattc tgcaaccaca 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagagcaaat gcatcctca 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggcagaatc cagatgctca a 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggatattatg aagggccttg agc 23
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtccttcagc tgtaa 15
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccggaatgtg ccaacagtg 19
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggacacacat ggctagaacc tctc 24
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cacccctgcg gtgca 15
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cggtgcacgc ctccc 15
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctaccgagg ctccagctt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgagccaggg ctggg 15
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggctctgccc tgacttt 17
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgccagggct gggcata 17
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcagttgtgt cagaagcaaa tg 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgcaacctca aacagacacc a 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aacttcatcc acgttcacct 20
<210> 23
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cctgcccagg gcct 14
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctgtcttgta accttgatac caa 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caaccattcc gggacagaga gaa 23
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gggacagatc cccaaaggac t 21
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acagtgataa tttctgggtt aagg 24
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgagccaggc catcact 17
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctttccctac ccagagccaa g 21
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgaggctcca gcttaacggt attt 24
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ttcccatatc gcacaaagat tg 22
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gggcataaaa ttgtatgtg 19
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agtcagtggg gaaggaggaa 20
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttctgactct gcccacagcc t 21
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acaaccagta tttacctagc aagt 24
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttcgcggtgg ctccactttc 20
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gctcaaggcc cttcataata tcc 23
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ttatggtaga caaaactctt c 21
Claims (10)
1.一种用于检测地贫基因突变的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 10所示的扩增引物和如SEQ ID NO: 11~SEQ ID NO: 28所示的延伸引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括PCR扩增体系。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR扩增体系包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、和灭菌双蒸水。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR扩增体系还包括甜菜碱、二甲基亚砜。
5.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括单碱基延伸反应体系。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述单碱基延伸反应体系包括延伸缓冲液、延伸终止混合物、反应催化酶、延伸引物混合物和灭菌双蒸水。
7.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括去dNTP体系。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述去dNTP体系包括磷酸酶缓冲液、磷酸消化酶和灭菌双蒸水。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒基于MALDI-TOF质谱平台进行检测。
10.一种如权利要求1~9中任一项所述的试剂盒在非诊断治疗目的的地贫基因分型中的用途。
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