CN111471752A - 一种用于检测hbb基因位点突变的引物及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测hbb基因位点突变的引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测HBB基因位点突变的引物及试剂盒，该引物包括PCR扩增引物和测序引物，所述PCR扩增引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述测序引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。该试剂盒包括上述的检测HBB基因位点突变的引物、基因组DNA抽提试剂、检测体系PCR反应液和测序体系试剂。本发明的检测引物和试剂盒能够检测超过200种HBB基因的位点突变类型，并且可以发现新的位点突变类型。此外，本发明的检测引物和试剂盒可确定单个β地中海贫血患者携带的HBB基因位点突变。

Description

一种用于检测HBB基因位点突变的引物及试剂盒
技术领域
本发明属于生命科学和生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测HBB基 因位点突变的引物及试剂盒。
背景技术
β地中海贫血(β地贫)是我国乃至全世界最常见的遗传病之一，在我国南 方的发病率为0.67％。世界上已发现200多种β地贫突变类型，其中绝大部分是 由β珠蛋白(hemoglobin subunit beta，HBB)基因的点突变、小的缺失或插入引 起β珠蛋白链合成的减少或缺失造成的。我国β地贫的突变类型有48种。HBB基 因具有3个外显子和两个内含子，全长1606bp。β地中海贫血的重型无法存活到 成年，中间型常无劳动能力，在高发区会严重影响人口质量。此外β地中海贫 血的分子病理具有高度的异质性，不同类型的基因缺陷导致患者不同的临床表 现，并影响其治疗效果及预后。因此β地贫的产前基因诊断意义重大，并且准 确地检测β地贫患者携带的HBB基因位点突变有利于治疗及预后。目前检测 HBB基因的点突变、小的缺失或插入最常用的方法是反向点杂交，基于此方法 的商业化β地中海贫血基因检测试剂盒大多检测8个常见突变位点和9个少见突 变位点，8个常见突变位点是-28(A-G)、-29(A-G)、CD17(A-T)、βE(CD26 G-A)、CD41-42(-TCTT)、CD43(G-T)、CD71-72(+A)和IVS-Ⅱ-654(C-T)，9个少 见突变位点是-30(T-C)、-32(C-A)、Int(ATG-AGG)、CD14-15(+G)、 CD27-28(+C)、CD31(-C)、IVS-Ⅰ-1(G-T)、IVS-Ⅰ-5(G-C)和Cap(-ACCC)。这些试 剂盒虽然够检测出90％以上的我国β地贫患者携带的β地贫突变，但是仍然会漏 检一些罕见的β地贫突变，例如-31(A-C)、CD8(-AA)、CD71-72(+T)、 IVS-Ⅱ-5(G-C)等，而且可能存在一些未被发现的突变类型。已有利用高通量测 序技术检测HBB基因位点突变的方法，这些方法虽然能够一次检测多个样本携 带的HBB基因位点突变，但无法确定单个样本携带的位点突变，很难应用于临 床检测单个β地贫患者携带的HBB基因位点突变。因此必须建立一种高效的全 面检测单个β地贫患者携带的HBB基因位点突变的方法，避免漏检、误检。
发明内容
鉴于此，有必要针对现有技术存在的问题，提供一种用于检测HBB基因位 点突变的引物及试剂盒，可以快速检测β地中海贫血患者携带的HBB基因位点 突变。本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供一种用于检测HBB基因位点突变的引物，包括PCR 扩增引物和测序引物，所述PCR扩增引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 所示，所述测序引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所 示。
进一步的，所述PCR扩增引物扩增HBB基因的外显子、内含子以及上游 228bp、下游211bp的侧翼序列，扩增产物为2045bp。
第二个方面，本发明提供一种用于检测HBB基因位点突变的试剂盒，包括 上述的检测HBB基因位点突变的引物和基因组DNA抽提试剂。
进一步的，所述试剂盒还包括PCR扩增反应液和Sanger法测序检测试剂。
进一步的，所述PCR扩增反应液的组分包括：ddH2O、5×TransStart FastPfu Flybuffer、dNTPs、TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase。
第三个方面，本发明提供一种检测HBB基因位点突变的方法，是采用上述 试剂盒，具体过程包括：
(1)提取血液或者组织中的基因组DNA；
(2)以步骤1中提取的DNA为模板，采用PCR扩增全长HBB基因；
(3)对步骤2中的PCR产物进行Sanger法测序；
(4)分析测序结果，确定HBB基因是否发生位点突变。
本发明的优势和有益效果是：
(1)本发明的检测引物和试剂盒能够检测超过200种HBB基因的位点突 变类型，并且可以发现新的位点突变类型。
(2)本发明的检测引物和试剂盒能够高效特异地扩增HBB基因，并且一 次PCR反应就能扩增全长HBB基因，不用分段扩增，可以减少试剂盒的成本； 能够准确地检测HBB基因的外显子和内含子中的位点突变，还可以准确地检测 HBB基因168bp启动子和164bp终止子中的位点突变。与现有的点杂交法只能 检测出有限的位点突变相比，本发明的方法能够检测HBB基因外显子、内含子 以及上游168bp、下游164bp侧翼序列中的所有位点突变。
(3)现有的第二代测序技术虽然能够一次检测多个样本携带的HBB基因 位点突变，但无法确定单个样本携带的位点突变，相比之下，本发明的检测引 物和试剂盒更适合用于确定单个β地中海贫血患者携带的HBB基因位点突变。
附图说明
图1是本发明实施例2中不同扩增条件的PCR产物电泳图，M为Marker，1-6 是不同扩增条件的PCR产物，可见4的PCR扩增条件最佳。
图2是本发明实施例3中4例临床样本的PCR产物电泳图，M为Marker，1-4 为检测的临床样本的PCR产物。
图3是本发明实施例3中HBB基因第1外显子野生型序列的测序结果截图。
图4是本发明实施例3中应用本发明的检测方法检测出的反向点杂交法检测到 的全部HBB基因位点突变，其中，a：第1例受试者携带的CD17(A-T)杂合 突变；b：第2例受试者携带的IVS-Ⅱ-654(C-T)杂合突变(后面的双峰是 IVS-Ⅱ-666(C-T)杂合突变)；c：第3例受试者携带的IVS-Ⅱ-654(C-T)杂合 突变；d：第4例受试者携带的CD43(G-T)杂合突变。箭头所示为突变位点。 图5是本发明实施例3中应用本发明的检测方法检测出而反向点杂交法试剂盒 检测不到的部分HBB基因位点突变，其中，a：第1例受试者携带的-99(G-A) 杂合突变和-96(G-A)杂合突变；b：第1例受试者携带的IVS-Ⅱ-16(G-C)杂 合突变；c：第1例受试者携带的IVS-Ⅱ-74(G-C)杂合突变；d：第3例受试者 携带的3′UTR+101(G-C)杂合突变。箭头所示为突变位点。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常 规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可 以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发 明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种用于检测HBB基因位点突变的引物和试剂盒。
其中，检测HBB基因位点突变的引物是跟据HBB基因的序列设计的特异 PCR扩增引物和Sanger法测序引物。
该PCR扩增引物扩增HBB基因的外显子、内含子以及上游228bp、下游 211bp侧翼序列，其碱基序列为：
HBB-F：ATTTGTACTGATGGTATGGGGC(SEQ ID NO:1)；
HBB-R：CCTTTTCTGAGGGATGAATAAGG(SEQ ID NO:2)；
PCR产物为2045bp。
Sanger法测序检测HBB基因序列的引物是HBB-F、HBB-R和HBB-sR。 HBB-sR引物的碱基序列是：GAATGGTGCAAAGAGGCATG(SEQ ID NO:3)。
检测HBB基因突变位点的试剂盒包括：
(i)基因组DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中，基因组DNA抽提所用的试剂由广州欣研生物科技有限公司提供， PCR反应液所用的TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase由北京全式金生物技 术有限公司提供，引物由广州探真生物科技有限公司合成，测序体系试剂包括 测序引物(HBB-F、HBB-R和HBB-sR)，以及其它测序试剂，该测序试剂由 Applied Biosystems公司提供。
检测体系PCR扩增反应液包括：
Figure BDA0002429589850000051
(反应时需要额外加入1μL 100ng/μL基因组DNA)
PCR反应程序为：98℃1min；98℃10s，53℃30s，72℃40s，35个循环；72℃ 10min；4℃保存。
测序体系试剂包括：
(1)
ddH2O 2μL；
HBB-F引物(4μM) 1μL；
BigDye 1μL；
(2)
ddH2O 2μL；
HBB-R引物(4μM) 1μL；
BigDye 1μL；
(3)
ddH2O 2μL；
HBB-sR引物(4μM) 1μL；
BigDye 1μL；
(反应时需要分别额外加入1μL纯化的PCR产物)
测序反应程序为：96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环；4℃ 保存。
实施例2
本实施例提供一种检测HBB基因位点突变的方法，具体包括以下步骤：
(1)血液、组织DNA的提取，采用的是基因组DNA抽提试剂盒，该试剂 盒的主要成分包括：Proteinase K、Buffer AL、Buffer DW1、RNase Solution、 HiPure gDNA MiniColumn、Buffer AE。
1)在1.5mL离心管中，加入20μL Proteinase K，再加入250μL抗凝血 液、血水等液体样品，涡旋5s，加入250μL Buffer DL至样品中，涡旋15s混 匀，65℃水浴15～30min。对于组织样品，把1～10mg组织剪成尽量小的碎 片，转移至1.5mL离心管中，加入230μL BufferATL和20μL Proteinase K，涡 旋混匀，55℃温浴1～3小时，期间需颠倒混匀几次或振荡温浴，加入10μL RNase Solution至消化液中，颠倒混匀，室温或37℃放置15～60min，12,000×g 离心3min，转移上清液至新的1.5m离心管中，加入250μL Buffer DL至消化液 中，最高速度涡旋20s，70℃水浴10min。
2)加入250μL无水乙醇至消化液中，涡旋混匀15～20s。
3)把HiPure gDNA Mini Column装在2mL收集管中，转移上述的的混合液 (包括沉淀)至柱子中，12,000×g离心1min。
4)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入500μL Buffer GW1至柱子中, 12,000×g离心1min。
5)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入650μL Buffer GW2至柱子中。 12,000×g离心1min。
6)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入650μL Buffer GW2至柱子中。 12,000×g离心1min。
7)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。12,000×g离心2min。
8)将柱子装在新的1.5mL离心管中。加入30～100μL预热至70℃的Buffer AE至柱子膜的中央。放置3min，12,000×g离心1min。
9)丢弃DNA结合柱，用微量分光光度计检测DNA的浓度，并且用0.6％ 的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。
10)把DNA用Buffer AE稀释成100ng/μL，保存于2～8℃，长期保存需放 置于-20℃。
(2)HBB基因的PCR扩增
1)配置如下PCR扩增反应体系：
Figure BDA0002429589850000071
2)在PCR仪中进行PCR扩增反应，反应条件如下：
98℃1min；98℃10s，53℃30s，72℃40s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
3)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，150V，25min，凝胶成像系统 观察。
在PCR扩增条件摸索过程中，还采用了其他PCR扩增条件，如下：
PCR1：
Figure BDA0002429589850000081
在PCR仪中进行PCR扩增反应，反应条件为：98℃1min；98℃10s，53℃ 30s，72℃40s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
PCR2：
Figure BDA0002429589850000082
在PCR仪中进行PCR扩增反应，反应条件为：98℃1min；98℃10s，51℃ 30s，72℃40s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
PCR3：
Figure BDA0002429589850000083
Figure BDA0002429589850000091
在PCR仪中进行PCR扩增反应，反应条件为：98℃1min；98℃10s，55℃
30s，72℃40s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
PCR4：
本实施例步骤(2)的扩增条件。
PCR5：
Figure BDA0002429589850000092
在PCR仪中进行PCR扩增反应，反应条件为：98℃1min；98℃10s，53℃ 30s，72℃40s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
PCR6：
Figure BDA0002429589850000093
Figure BDA0002429589850000101
在PCR仪中进行PCR扩增反应，反应条件为：98℃1min；98℃10s，53℃ 30s，72℃40s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
图1提供了以上6种扩增条件下获得的PCR产物电泳图，明显，PCR4即 本实施例步骤2)的扩增条件效果最好。
(3)Sanger法测序，
1)取PCR产物与2μL纯化体系混匀，37℃处理50min进行纯化，95℃处 理5min变性，4℃保存。
2)将1μL纯化产物分别与3条测序引物按照如下体系混匀：
Figure BDA0002429589850000102
3)测序反应程序如下：
96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环；4℃保存。
4)向完成测序反应的产物中加入2μL 125mM EDTA，静置5min，加入 15μL无水乙醇，涡旋混匀。12,000×g离心30min，倒置15s，加入50μL 70％乙 醇，涡旋混匀，12,000×g离心15min，倒置15s，置于95℃金属浴上，加入 10μL Hi-Di后进行变性。
5)变性后上测序仪(ABI3730)检测。
6)分别将测序结果与HBB基因的参考序列(Genbank：NC_000011.10)进 行比对，分析突变情况。
实施例3
临床样本检测
取4例临床样本用深圳益生堂深谷科技有限公司的β-地中海贫血基因检测 试剂盒(反向点杂交法)检测携带的HBB基因位点突变，详细结果如表1所示。
表1采用现有β-地中海贫血基因检测试剂盒对4例临床样本的检测结果
Figure BDA0002429589850000111
同时采用本发明的方法检测这4例临床样本携带的HBB基因位点突变。按 照实施列1和2的试剂和方法提取基因组DNA、PCR扩增和测序。取5μL PCR 产物电泳检测，电泳结果如图2所示，表明本发明所述PCR引物扩增效率高， 且特异性和重复性好(其中，条带亮表明扩增效率高，没有明显的杂带表明特 应性好，4次扩增的条带都很亮表明重复性好)。
样本的部分测序结果如图3至图5所示。图3显示HBB基因第1外显子野 生型序列的测序结果。图4显示本发明的检测方法能检测出反向点杂交法检测 到的全部HBB基因位点突变，图5显示本发明能检测出，而反向点杂交法试剂 盒检测不到的部分HBB基因位点突变。
从检测结果可以看出，本发明所设计的引物能够高效特异地扩增HBB基 因，扩增产物包括HBB的外显子、内含子和部分启动子、终止子，并且本发明 的测序结果准确可靠，重复性和稳定性好。本发明的方法使用100ng基因组 DNA即可以达到最佳PCR扩增效果，完成Sanger法测序检测，灵敏度高。此 外，目前也出现了较为先进的第二代测序法，这种二代测序方法可以一次性检 测多个样本携带的HBB基因位点突变，但对于具体某个β地贫患者要检测自身 携带的HBB基因位点突变时，这种二代测序方法则不适用，因此，本发明还可以针对这种问题提出有效的解决方法，即能够确定单个β地贫患者携带的HBB 基因位点突变，适合临床上检测β地贫患者携带的HBB基因位点突变，为治疗 和预后提供依据。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。
序列表
<110> 公司名称：广州辉园苑医药科技有限公司
<120> 一种用于检测HBB基因位点突变的引物及试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atttgtactgatggtatggggc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttttctgagggatgaataagg 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaatggtgcaaagaggcatg 20

Claims (6)

1.一种用于检测HBB基因位点突变的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和测序引物，所述PCR扩增引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述测序引物的序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测HBB基因位点突变的引物，其特征在于：所述PCR扩增引物扩增HBB基因的外显子、内含子以及上游228bp、下游211bp的侧翼序列，扩增产物为2045bp。
3.一种用于检测HBB基因位点突变的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的检测HBB基因位点突变的引物和基因组DNA抽提试剂。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测HBB基因位点突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR扩增反应液和Sanger法测序检测试剂。
5.根据权利要求4所述的一种用于检测HBB基因位点突变的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增反应液的组分包括：ddH2O、5×TransStart FastPfu Fly buffer、dNTPs、TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase。
6.一种检测HBB基因位点突变的方法，其特征在于：是采用权利要求3～5任意一项所述的试剂盒，具体过程包括：
(1)提取血液或者组织中的基因组DNA；
(2)以步骤1中提取的DNA为模板，采用PCR扩增全长HBB基因；
(3)对步骤2中的PCR产物进行Sanger法测序；
(4)分析测序结果，确定HBB基因是否发生位点突变。
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