CN114480411A - 一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因及其检测试剂 - Google Patents

一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因及其检测试剂 Download PDF

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张均
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Abstract

本发明提供一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因及其检测试剂，所述突变位于COL4A5基因第七号内含子区域，第439‑7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即COL4A5,c.439‑7(IVS7)A>G。此突变可引起COL4A5基因的mRNA剪接异常，导致移码突变。该移码突变导致COL4A5基因所编码蛋白质发生结构改变。本发明的检测试剂可有效、快速地检测COL4A5的上述致病突变，且价格低廉。

Description

一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因及其检测试剂
技术领域
本发明涉及遗传病基因检测领域，具体涉及一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因及其检测试剂。
背景技术
Alport综合征(Alport syndrome,AS)是一种常见的遗传性肾炎综合征，主要表现为血尿、肾功能进行性减退、感音神经性耳聋和眼部异常。该病是由于编码肾小球基底膜的主要胶原成分-IV胶原基因突变而产生的肾小球基底膜疾病。IV型胶原6条ɑ链聚合成3条三股螺旋分子结构称为单体，单体聚合形成二聚体或四聚体，再相互绞连形成胶原网状结构。电镜下可观察到Alport综合征特征性的病理改变，肾小球基底膜(Glomerular BasementMembrane，GBM)广泛增厚、或变薄以及致密层分裂为其典型病变。GBM致密层不规则的外观是超微结构最突出的异常，其范围既可累及所有的毛细血管襻或毛细血管襻内所有的区域，也可累及部分毛细血管襻或毛细血管襻内的部分区域。因此，临床常用肾活检术从病理上加以诊断，但这是一种有创检查，患者可能因此而出现并发症。不能为上述患者提供准确的治疗指导。
近年来，AS的致病基因已经被鉴定出来，使得肾病综合征的基因诊断成为可能。这些致病基因包括COL4A5、COL4A6、COL4A3和COL4A4，其筛查可以帮助临床医师完成AS的“基因诊断”。这不仅可避免临床盲目用药及由此带来的药物不良反应和经济负担，对某些患者还可能进行早期干预或治疗，延迟甚至避免终末期肾脏病(End stage renal disease，ESRD)的发生。
既往的研究显示：基因突变多位于全外显子区域，表现为某种氨基酸编码的突变。目前，对AS患者的致病基因的检测，多采用全外显子测序技术。如中国专利申请CN104450726A公开的COL4A5基因突变体及其应用。
然而，最近报道在基因内含子区域同样也可以存在某些突变而导致mRNA剪接改变。这些突变需要在mRNA水平对编码基因产生的效应进行证明。因此，鉴定内含子区域的致病突变，并研发省时、精准的对实验条件要求较低的诊断试剂对AS患者进行快速检测，对AS临床基因诊断具有必要性。
目前，对于AS患者基因内含子区域突变导致mRNA剪接改变而致病的报道相对较少。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种可导致mRNA剪接异常的AS致病基因突变，并基于此研发了突变检测试剂。该突变检测试剂可以快速、准确判断检测对象是否具有此致病突变。
本发明提供一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因，所述突变位于COL4A5基因第七号内含子区域，第439-7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即c.439-7(IVS7)A>G；此突变可引起COL4A5基因的mRNA剪接异常，导致改变编码蛋白质结构的移码突变。
进一步，所述mRNA剪接异常是指mRNA RT-PCR产物第439-7位多余6个碱基TAATAG。
本发明还提供上述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂，所述诊断试剂包括基因组DNA点突变分析试剂，所述分析试剂包括1)患者样本基因组DNA提取试剂盒；2)DNA-PCR扩增试剂盒：采用引物P1和P2扩增患者基因组DNA，获得目的条带；3)DNA-PCR产物Sanger测序试剂盒：以引物P2对DNA-PCR产物Sanger测序；当检测得到COL4A5基因第七号内含子区域，第439-7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即COL4A5,c.439-7(IVS7)A>G，确诊为Alport综合征患者。
其中，P1:AGCATTCTGTAATTGGCGTGTT(SEQ ID NO.1)；
P2:ATTGAAGTTGCCAGCTTTCCT(SEQ ID NO.2)。
进一步，所述用于患者基因组DNA提取的样本为：外周血、尿液或指甲。
本发明还提供上述COL4A5致病突变基因的另一病因学诊断试剂，所述诊断试剂包括mRNA突变分析试剂，所述试剂包括1)患者样本RNA提取试剂盒；2))RT-PCR扩增试剂盒：以引物P3和P4扩增患者RNA，获得目的条带；3)RT-PCR产物Sanger测序试剂盒：以引物P3对RT-PCR产物Sanger测序；当检测得到mRNA RT-PCR产物第439-7位多余6个碱基TAATAG时，确诊为Alport综合征患者。
其中，P3:ATGCAATGGAACCAAGGGAG(SEQ ID NO.3)；
P4:CATCAAACCTGGTGGTCCTG(SEQ ID NO.4)。
进一步，所述用于患者RNA提取的样本为：尿液或血液。
本发明还提供上述病因学诊断试剂中用于扩增患者基因组DNA的引物对组P1和P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
上述病因学诊断试剂中用于基因组DNA-PCR产物Sanger测序的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供上述病因学诊断试剂中用于扩增患者RNA的引物对组P3和P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。
上述病因学诊断试剂中用于RT-PCR产物Sanger测序的引物，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
本发明还提供上述病因学诊断试剂的制备方法，包括如下步骤：将所述引物对组中的4条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
该突变不存在于ClinVar数据库、dbSNP等数据库，为新发现的致病突变，可引起X-连锁显性遗传的AS临床表现。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
1.本发明公开的COL4A5致病突变基因是临床AS患者的致病突变之一，该突变导致mRNA剪接异常，进而导致蛋白翻译提前终止，编码蛋白功能异常。
2.本发明的检测试剂可有效、快速地检测COL4A5的上述致病突变。
3.本发明的检测试剂价格低廉，可减轻患者经济负担。
附图说明
图1：剪接突变示意图
图中，正常情况下，初始转录产生的mRNA加工会除去内含子。当内含子中的突变产生一个新的剪接位点时，导致一小段内含子序列不能被完全切除，导致编码框改变，基因所编码的蛋白功能异常。
图2：血液细胞基因组DNA提取
图中，采用本发明血液基因组DNA提取试剂盒分离获得外周血细胞DNA。
(M:DNA marker；1～2：患者DNA样品；3-4：对照DNA样品。)
图3：本发明COL4A5致病突变基因的突变区域扩增
图中，采用引物P1和P2扩增患者基因组DNA，获得目的条带。
(M:DNA marker；1～2：患者DNA样品；3-4：对照DNA样品。)
图4：genomic DNA-PCR产物Sanger测序
图中，将PCR产物直接电泳、切胶纯化后进行测序。
结果显示，患者1基因组DNA中存在一个点突变c.439-7(IVS7)A>G(竖线标记处)。
图5：RT-PCR扩增COL4A5
图中，以引物P3和P4扩增患者尿液细胞RNA样品，获得目的条带。
(M:RNA marker；1～2：患者DNA样品；3-4：对照DNA样品。)
图6：RT-PCR产物Sanger测序
图中，将RT-PCR产物直接电泳、切胶纯化后进行测序。结果显示，患者mRNA RT-PCR产物多余了6个碱基。
具体实施方式
实施例1本发明Alport综合征患者COL4A5致病突变基因患者症状及致病突变基因的发现
来自新桥医院肾内科患者，症状：蛋白尿、血尿、薄基底膜，疑是AS患者。经全序列测序，比对，发现本发明Alport综合征患者COL4A5致病突变基因。
COL4A5基因原始序列如SEQ ID NO.5所示。此序列包含本发明突变基因位点在内的部分基因组DNA序列。
实施例2本发明COL4A 5致病突变基因区域扩增引物的设计与合成
从NCBI数据库中获得COL4A5基因组序列，应用Primer软件设计设计检测引物，所用引物序列如下。引物从北京六合华大基因有限公司合成，采用PAGE纯化。
COL4A 5基因突变区域扩增引物
P1:AGCATTCTGTAATTGGCGTGTT(SEQ ID NO.1)
P2:ATTGAAGTTGCCAGCTTTCCT(SEQ ID NO.2)
Sanger测序引物:P2
COL4A5 mRNA剪接异常的RT-PCT检测引物
P3:ATGCAATGGAACCAAGGGAG(SEQ ID NO.3)
P4:CATCAAACCTGGTGGTCCTG(SEQ ID NO.4)
Sanger测序引物:P3。
实施例3：本发明COL4A 5致病突变基因的检测试剂，以及致病突变基因的检测和验证
一、获取临床样本并设置实验组和对照组
1)实验组
患者1，样本来自新桥医院肾内科，症状：蛋白尿、血尿、薄基底膜，疑是AS患者。
患者2，样本来自新桥医院肾内科，症状：蛋白尿、血尿、薄基底膜，疑是AS患者。
3)对照组
选取2例正常人为对照组，样品编号：3、4。
二、实验方案与步骤
1.筛查检测：
本发明诊断试剂I包括1)测试者样本基因组DNA提取试剂盒；2)PCR扩增试剂盒:采用引物P1和P2扩增测试者基因组DNA，获得目的条带；3)测序试剂盒：genomic DNA-PCR产物Sanger测序。
当检测得到COL4A5基因第七号内含子区域，第439-7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即COL4A5,c.439-7(IVS7)A>G，确诊断为Alport综合征患者。
1.1本实施例中基因组DNA提取样品为外周血样本。
采用本发明基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)提取外周血样品基因组DNA。
1.1.1取抗凝的外周血200μL。
1.1.2加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
1.1.3加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。
1.1.4加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec。
1.1.5将上一步所得溶液加入吸附柱中，12000rpm/30sec，弃废液。
1.1.6向吸附柱中加入500μL GD，12000rpm/30sec，弃废液。
1.1.7向吸附柱中加入600μL PW，12000rpm/30sec，弃废液，重复一次。
1.1.8 12000rpm/2min。
1.1.9吸附柱移到新的1.5mL离心管中，室温5min，晾干。
1.1.10加入30μL TB，室温3min溶解，12000rpm/2min，得到DNA样品。(如图2所示)
1.2采用本发明PCR扩增试剂盒：引物P1和P2扩增测试者基因组DNA，获得目的条带。如图3所示。
1.2.1基因组DNA样品的PCR反应体系组成
1.2.1.1引物稀释：合成的引物加水溶解至10μM，备用。
1.2.1.2反应体系组成:
Figure BDA0003568690750000051
混匀后进行下一步。
1.2.2基因组DNA样品的PCR检测
1.2.2.1 PCR反应条件
Figure BDA0003568690750000061
1.2.2.2 PCR产物电泳检测
PCR反应结束后，取5μL产物，于2％琼脂糖凝胶中进行电泳，观察产物的有无及分子量大小。
1.3采用本发明测序试剂盒：基因组DNA样品的PCR产物的序列测定：
将上述产物在低熔点琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后切除相应的DNA条带回收纯化产物。采用Sanger法直接测定序列，获得相应的峰图。
1.4结果显示：
患者甲：基因组DNA中存在一个点突变c.439-7(IVS7)A>G，如图4所示。
患者乙：基因组DNA正常。
对照组1：基因组DNA正常。
对照组2：基因组DNA正常。
2.确诊验证：
本发明诊断试剂Ⅱ包括mRNA突变分析试剂，所述试剂包括1)患者样本RNA提取试剂盒；2)RT-PCR扩增试剂盒：以引物P3和P4扩增患者RNA，获得目的条带；3)测序试剂盒：RT-PCR产物Sanger测序。
当检测得到mRNA RT-PCR产物第439位多余6个碱基TAATAG时，确诊为本发明突变基因引起的Alport综合征患者。
2.1本实施例中患者RNA提取样本为尿液样本
采用本发明RNAeasy动物RNA抽提试剂盒(离心柱法)提取尿液样本RNA。
2.1.1收集新鲜尿液200mL；
2.1.2离心，收获细胞沉淀；
2.1.3加入裂解液300μL，轻轻吹打8-10次，至固悬物溶解；
2.1.4加入等体积结合液至裂解液中，轻轻颠倒混匀3-5次；
2.1.5将混合物转移至纯化柱内，12,000g离心30秒，弃液体；
2.1.6加入600μL洗涤液I，12,000g离心30秒，弃液体；
2.1.7加入600μL洗涤液II，12,000g离心30秒，弃液体；重复步骤2.1.7一次；
2.1.8最高速(约14,000-16,000g)离心1分钟，去除残留的液体；
2.1.9加入30-50μL洗脱液，室温放置2-3分钟，最高速离心30秒，得到RNA。
2.2 RNA样品的检测
2.2.1 RT反应
采用本发明RT-PCR扩增试剂盒(MCE公司产品)，RT Master Mix for qPCR(gDNAdigester plus)进行反应。
2.2.1.1反应体系组成
Figure BDA0003568690750000071
2.2.1.2用移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2min。
2.2.1.3直接加入2×Super RT Mix，用移液器轻轻吹打混匀。
2.2.1.4按如下操作，完成RT反应。
25℃ 5分钟
42℃ 60分钟
85℃ 2分钟
产物备用。
2.2.2 PCR扩增错误拼接位点部分序列
反应体系组成:
Figure BDA0003568690750000072
Figure BDA0003568690750000081
混匀后进行下一步。
PCR反应条件
Figure BDA0003568690750000082
RT-PCR反应结束后，取5μL产物，于2％琼脂糖凝胶中进行电泳，观察产物的有无及分子量大小。(如图5所示)
2.2.3采用本发明RT-PCR产物Sanger测序试剂盒：Sanger测序分析RT-PCR产物并与基因组DNA PCR产物比较。
将上述RT-PCR产物在低熔点琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后切除相应的DNA条带回收纯化产物。采用Sanger法直接测定序列，获得相应的峰图。(如图6所示)
2.3结果显示：
患者甲：mRNA第439位多余了6个碱基，与基因组DNA中的点突变c.439-7(IVS7)A>G相对应，确诊为因本发明突变基因引起的Alport综合征患者。
患者乙：mRNA正常。其他突变引起的Alport综合征患者。
对照组1：mRNA正常。
对照组2：mRNA正常。
对照组3：mRNA正常。
突变机理如图1所示。
实施例4：
实施例3的1部分作为检测试剂独立使用。
实施例5：
实施例3的2部分作为另一检测试剂独立使用。
实施例6：
与实施例2基本相同，所不同之处在于：
本实施例中患者基因组DNA提取样品为指甲。
1.1指甲DNA提取
1.1.1指甲剪碎后，装入2ml离心管内。
1.1.2.加入1mL 75％乙醇，离心甩一下，去上清。
1.1.3.加入1mL水，离心甩一下，去上清。
1.1.4.加入1mL水，离心甩一下，去上清。
1.1.5.加入200μLGA，20μL蛋白酶K，20μL 1M DTT，混匀。
1.1.6. 56℃孵育3小时。
1.1.7.离心甩一下，将上清移到新管，加入200μLGB。
1.1.8. 56℃孵育10min，每3min漩涡混匀一下。
1.1.9.加200μL无水乙醇，漩涡混匀，将溶液分加入到一个吸附柱中，12000rpm/30sec，弃废液。
1.1.10.向吸附柱中加入500μL GD，12000rpm/30sec，弃废液。
1.1.11.向吸附柱中加入600μL PW，12000rpm/30sec，弃废液，重复一次。
1.1.12. 12000rpm/2min。
1.1.13.吸附柱移到新的1.5mL离心管中，室温5min，晾干。
1.1.14.加入30μL TB，室温3min溶解，12000rpm/2min，得到DNA样品。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院
<120> 一种Alport综合征患者COL4A5基因致病突变及其检测试剂
<130> 中国专利申请CN104450726A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agcattctgt aattggcgtg tt 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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attgaagttg ccagctttcc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catcaaacct ggtggtcctg 20
<210> 5
<211> 428
<212> DNA
<213> Human
<400> 5
ggagaacgtg gatttccagg cagtcccggt tttcctggtt tacagggtcc tccagtaagt 60
tataaaattt gggattatga tgaacacagg aattaacaaa agaagcagaa atgtagtgag 120
agagcccaat gcattcatgt ggaacaaagt aatacatttt aaagtaataa actagaggaa 180
aatgtttcaa aaagaagttg gtaatatagc tttctcctgg gcaaaagcaa ggattttgta 240
tgtatataaa tgtcacctct aagtatccta aggtatatcc tattcagaaa tgacgctaca 300
gcagtctact cattttatac tctatttaga aagcattctg taattggcgt gtttctctct 360
catacatata aaataatccc ttttcttttt aataataggg accccctggg atcccaggta 420
tgaaggta 428

Claims (10)

1.一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因，其特征在于，所述突变位于COL4A5基因第七号内含子区域，第439-7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即c.439-7(IVS7)A>G；此突变可引起COL4A5基因的mRNA剪接异常，导致改变编码蛋白质结构的移码突变。
2.根据权利要求1所述的Alport综合征患者COL4A5致病突变基因，其特征在于，所述mRNA剪接异常是指mRNA RT-PCR产物第439-7位多余6个碱基TAATAG。
3.根据权利要求1所述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包括基因组DNA点突变分析试剂，所述分析试剂包括1)患者样本基因组DNA提取试剂盒；2)DNA-PCR扩增试剂盒：采用引物P1和P2扩增患者基因组DNA，获得目的条带；3)DNA-PCR产物Sanger测序试剂盒：以引物P2对DNA-PCR产物Sanger测序；当检测得到COL4A5基因第七号内含子区域，第439-7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即c.439-7(IVS7)A>G，确诊为Alport综合征患者。
4.根据权利要求3所述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂，其特征在于，所述用于患者基因组DNA提取的样本为：外周血、尿液、或指甲。
5.根据权利要求2所述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包括mRNA突变分析试剂，所述试剂包括1)患者样本RNA提取试剂盒；2))RT-PCR扩增试剂盒：以引物P3和P4扩增患者RNA，获得目的条带；3)RT-PCR产物Sanger测序试剂盒：以引物P3对RT-PCR产物Sanger测序；当检测得到mRNA第439-7位多余6个碱基TAATAG时，确诊为Alport综合征患者。
6.根据权利要求5所述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂，其特征在于，所述用于患者RNA提取的样本为：尿液或血液。
7.根据权利要求3所述病因学诊断试剂中用于扩增患者基因组DNA的引物对组P1和P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
8.根据权利要求3所述病因学诊断试剂中用于基因组DNA-PCR产物Sanger测序的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.根据权利要求5所述病因学诊断试剂中用于扩增患者RNA的引物对组P3和P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。
10.根据权利要求5所述病因学诊断试剂中用于RT-PCR产物Sanger测序的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
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