CN114381513B - 一种与x连锁淋巴增生症相关的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与X连锁淋巴增生症相关的生物标志物及其应用。所述生物标志物包括SH2D1A基因，所述SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv倒位突变。本发明首次发现SH2D1A基因NM_002351:exon2:c.154_201+87inv倒位突变与XLP疾病密切相关，能够导致X连锁淋巴增生症的发生，在一定程度上扩充了SH2D1A基因的突变谱，有利于X连锁淋巴增生症的早期诊断和筛查。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种与X连锁淋巴增生症相关的生物标志物及其应用。
背景技术
X连锁淋巴增生症(X-linked lymphoproliferative disease，XLP)，又称X连锁淋巴组织增生综合征，包括XLP1和XLP2两个亚型，XLP1型是最常见的类型(约占60％)，它是由编码信号淋巴细胞激活分子(SLAM)相关蛋白(SAP，也称为SH2结构域蛋白1A[SH2D1A]或DSHP)基因突变引起的一种X连锁隐性遗传病，SAP缺陷会导致淋巴细胞对EB病毒应答中发生无限制增殖，并且出现自然杀伤(NK)细胞功能障碍，以EBV感染后的暴发性传染性单核细胞增多症、异常免疫球蛋白血症及B细胞淋巴瘤为主要临床特点。
SH2D1A基因半合子(男性)或纯合突变(女性)，导致SAP蛋白表达减少，不能正常参与免疫细胞间的信号转导，而致T/B细胞相互作用异常、使NK细胞介导的细胞毒作用缺陷，最终导致XLP1的发生。
SH2D1A基因位于于人X染色体q25上，全长2523bp，编码129个氨基酸，蛋白细胞浆表达，NCBI Gene ID:4068，SH2D1A基因突变类型包括插入、缺失、错义及剪切突变等。值得注意的是，突变类型与临床表型的严重程度不相关，所以与XLP1的鉴别诊断主要依赖于基因检测，尽早的诊断及进行造血干细胞移植，对XLP患者预后改善十分重要。
现有技术中常通过检测SH2D1A基因突变来辅助诊断XLP-1型X连锁淋巴增生症，基因突变形式包括大片段缺失、小片段缺失、无义突变、错义突变和剪切异常，如郭霞等公开了127种与XLP-1型X连锁淋巴增生症相关的SH2D1A基因突变(参见：郭霞,唐雪,高举,等.X-连锁淋巴增殖性疾病分子机制和诊治进展[J].国际输血及血液学杂志,2018,41(5):5.)，然而并不能完全表征所有XLP-1型X连锁淋巴增生症患者。
综上所述，补充开发新的XLP-1型X连锁淋巴增生症的检测标志物指标，以提高检出率，对于X连锁淋巴增生症治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种与X连锁淋巴增生症相关的生物标志物及其应用，本发明首次发现SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv倒位突变与X连锁淋巴增生症密切相关，从而可将其作为检测X连锁淋巴增生症的标志物，扩充了SH2D1A基因的突变谱，有利于X连锁淋巴增生症的早期诊断和筛查。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种与X连锁淋巴增生症相关的生物标志物，所述生物标志物包括SH2D1A基因，所述SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv倒位突变。
本发明首次发现SH2D1A基因一个新的突变位点，与SH2D1A野生型基因相比，核苷酸NM_002351:exon2:c.154_201+87inv倒位突变，且与XLP疾病密切相关，c.154_201+87inv倒位突变可造成mRNA发生异常剪切，并或可诱发无义介导的mRNA提前降解，形成截短蛋白，造成SAP蛋白发生缺陷，导致淋巴细胞对EB病毒应答中发生无限制增殖以及自然杀伤(NK)细胞功能障碍，进而导致X连锁淋巴增生症的发生。在一定程度上扩充了SH2D1A基因的突变谱，有利于X连锁淋巴增生症的早期诊断和筛查。
优选地，所述SH2D1A基因的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
SEQ ID NO.1：
CATACCGAGTGTCCCAGACAGAAACAGGTTCTTGGAGTGCTGAGGTATAGTTGTATTTATTTTTGCTTCTGGGGGTGTCAAGGAGGTATTTGAAATTTAGGCTGGTTTTATAAAAGAGCAAATTATACATT。
第二方面，本发明提供检测第一方面所述的与X连锁淋巴增生症相关的生物标志物的引物，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。
SEQ ID NO.2：GGAAACTGTGGTTGGGCAGA。
SEQ ID NO.3：TGCAAAATGATGGCTAAACAGGA。
SEQ ID NO.4：ACCTCCTTGACACCCCCAGA。
本发明采用独特策略设计检测所述的与X连锁淋巴增生症相关的生物标志物的引物，所述引物特异性强，扩增效果好。
第三方面，本发明提供第一方面所述的与X连锁淋巴增生症相关的生物标志物在制备诊断X连锁淋巴增生症的产品中的应用。
第四方面，本发明提供一种X连锁淋巴增生症诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括第二方面所述的检测第一方面所述的与X连锁淋巴增生症相关的生物标志物的引物。
优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
优选地，所述试剂盒还包括标准品和/或对照品。
本发明基于所述与X连锁淋巴增生症相关的生物标志物，设计直接检测SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv倒位突变的试剂盒，可快速检测样本中是否存在突变基因，以辅助X连锁淋巴增生症早期诊断。
第五方面，本发明提供一种第四方面所述的与X连锁淋巴增生症诊断试剂盒以非疾病诊断为目的的使用方法，所述使用方法包括：
以样本基因组为模板，使用所述与X连锁淋巴增生症相关的生物标志物的引物进行PCR扩增，对所述PCR扩增产物进行分析及结果判读。
本发明中，利用X连锁淋巴增生症诊断试剂盒通过特异性引物，扩增获得SH2D1A基因所有外显子区域及包含SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv的区域，对扩增产物测序，随后进行SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv的扩增产物片段分析以及SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv的基因型及其他致病变异分析，可充分获取SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv突变信息，从而辅助X连锁淋巴增生症早期诊断。
优选地，所述PCR扩增的程序包括：
94～96℃预变性1～4min；
94～96℃变性8～12s，58～62℃退火25～33s，70～74℃延伸55～60s，进行30个循环；
70～74℃延伸1～3min。
优选地，所述分析包括对SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv区的基因型进行分析。
优选地，所述SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv区的基因型可通过本领域常规技术方法包括但不限于倒位PCR、Southern印迹法、DNA序列分析、原位杂交等进行检测。
优选地，所述结果判读包括所述SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv区的基因型为倒位突变，则判断检测对象为候选X连锁淋巴增生症患者。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次发现SH2D1A基因一个新的突变位点，与SH2D1A野生型基因相比，核苷酸NM_002351:exon2:c.154_201+87inv倒位突变，且与XLP疾病密切相关，可作为X连锁淋巴增生症早期诊断的生物标志物，在一定程度上扩充了SH2D1A基因的突变谱，有利于X连锁淋巴增生症的早期诊断和筛查；
(2)本发明基于所述X连锁淋巴增生症相关的生物标志物，采用独特侧策略设计检测所述标志物的引物，并构建检测SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv倒位突变的试剂盒，所述试剂盒操作简单、成本低且检测周期短，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为先证者家系图，Ⅰ-1为先证者外婆的姐妹1，Ⅰ-2为先证者外婆的姐妹2，Ⅰ-3为先证者外婆，Ⅱ-1为先证者外婆的姐妹1的女儿，Ⅱ-2为先证者的父亲，Ⅱ-3为先证者的母亲，Ⅱ-4为先证者的舅舅，Ⅲ-1为先证者；
图2为SH2D1A基因2号外显子扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA Marker，Ⅰ-1为先证者外婆的姐妹1，Ⅰ-2为先证者外婆的姐妹2，Ⅰ-3为先证者外婆，Ⅱ-1为先证者外婆的姐妹1的女儿，Ⅱ-2为先证者的父亲，Ⅱ-3为先证者的母亲，Ⅱ-4为先证者的舅舅，Ⅲ-1为先证者；
图3为SH2D1A基因cDNA跨2号外显子序列扩增示意图；
图4为测序结果比对图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例获取生物样品并进行DNA提取。
2020年，门诊收取一患者，临床表型为：无明显诱因出现下肢疼痛，胸腹盆CT：肝脾大，肺部感染，双肾异常信号，纤支镜：支气管内膜炎症；EB病毒感染；家族无遗传病史。
取患者(作为先证者)及其家系(家系图如图1所示)血液样本并利用磁珠法提取血液样本中基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个样本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7～2.0之间，浓度不少于30ng/μL，总量不少于2μg。
实施例2
本实施例对实施例1获取的样本DNA进行检测，包括以下步骤：
(1)参考人类基因组序列数据库，设计SH2D1A基因1-4号外显子序列分别对应的PCR特异性引物对，如表1所示；
表1
(2)PCR反应体系如表2所示，PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环；最后72℃延伸2min，于4℃保存；
表2
(3)PCR扩增结束后，取5μL扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳30min，染色20min，然后将凝胶块置于凝胶成像仪中观察，根据比对Marker的片段大小情况，初步判断扩增片段是否正确，进而对符合要求的扩增产物进行纯化，采用PCR产物纯化试剂盒，并按试剂盒要求进行操作，上样测序：采用ABI公司BigDye3.1SequencingKit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作；用ABI公司3730型测序仪进行测序；
(4)2号外显子扩增产物采用Bioptic公司Standard Cartridge Kit(S2)试剂盒，并按试剂盒要求进行操作；用Bioptic公司Qseq100片段分析仪进行分析；
(5)测序结果通过Chromas序列分析软件，将测序结果与标准序列进行比对，寻找突变位点；片段分析结果通过预期扩增片段长度分析，当只有454bp和297bp产物时，结果为野生型，当只有201bp产物时，结果为纯合突变，当结果同时存在454bp、297bp和201bp产物时，结果为杂合突变；
结果如图2所示，分析结果如下：患者片段分析结果只有201bp产物，为纯合突变(男性：半合子突变)，患者父亲片段分析结果只有454bp和297bp产物，为野生型；患者母亲片段分析结果同时存在454bp、297bp和201bp产物，为杂合突变，测序结果未发现其他基因突变。
实施例3
本实施例进一步验证SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv倒位突变与X连锁淋巴增生症关系，包括以下步骤：
(1)利用Trizol法提取患者及其父母血液样本中RNA，利用分光光度计测量RNA的浓度及纯度，所得的每个样本RNA的OD260/OD280均位于1.8～2.0之间，浓度不少于100ng/μL，总量不少于5μg，对提取的RNA进行逆转录得到cDNA产物；
(2)参考人类基因组序列数据库，设计SH2D1A基因cDNA跨2号外显子序列对应的PCR特异性引物对(扩增示意图如图3所示)，引物序列如表3所示；
表3
(3)PCR反应体系如表4所示，PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环；最后72℃延伸2min，于4℃保存；
表4
| 组分 | 加入量(μL) |
| 2×PCR mix | 25 |
| 引物mix(5μM) | 3 |
| cDNA模板 | 2 |
| 灭菌双蒸水 | 20 |
(4)PCR扩增结束后，取5μL扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳30min，染色20min，然后将凝胶块置于凝胶成像仪中观察，根据比对Marker的片段大小情况，初步判断扩增片段是否正确，进而对符合要求的扩增产物进行纯化：采用PCR产物纯化试剂盒，并按试剂盒要求进行操作，上样测序：采用ABI公司BigDye3.1SequencingKit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作；用ABI公司3730型测序仪进行测序；
(5)结果分析：测序结果通过Chromas序列分析软件，将测序结果与标准序列进行比对，结果如图4所示，分析结果确认患者mRNA中因异常剪切造成外显子2纯合缺失，患者父亲为野生型，患者母亲为杂合突变。
综上所述，本发明首次发现SH2D1A基因一个新的突变位点，与SH2D1A野生型基因相比，核苷酸NM_002351:exon2:c.154_201+87inv倒位突变，且与XLP疾病密切相关，c.154_201+87inv倒位突变可造成mRNA发生异常剪切，并或可诱发无义介导的mRNA提前降解，形成截短蛋白，造成SAP蛋白发生缺陷，导致淋巴细胞对EB病毒应答中发生无限制增殖以及自然杀伤(NK)细胞功能障碍，进而导致X连锁淋巴增生症的发生。在一定程度上扩充了SH2D1A基因的突变谱，有利于X连锁淋巴增生症的早期诊断和筛查。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 苏州赛福医学检验有限公司
<120> 一种与X连锁淋巴增生症相关的生物标志物及其应用
<130> 2022-01-11
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cataccgagt gtcccagaca gaaacaggtt cttggagtgc tgaggtatag ttgtatttat 60
ttttgcttct gggggtgtca aggaggtatt tgaaatttag gctggtttta taaaagagca 120
aattatacat t 131
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaaactgtg gttgggcaga 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcaaaatga tggctaaaca gga 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acctccttga cacccccaga 20
Claims (4)
1.检测与X连锁淋巴增生症XLP1亚型相关的生物标志物试剂在制备诊断X连锁淋巴增生症XLP1亚型的产品中的应用；
所述生物标志物为SH2D1A基因NM_002351第2号外显子c.154_201+87inv；
所述SH2D1A基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种X连锁淋巴增生症XLP1亚型诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括检测权利要求1所述的与X连锁淋巴增生症XLP1亚型相关的生物标志物的引物。
3.根据权利要求2所述的X连锁淋巴增生症XLP1亚型诊断试剂盒，其特征在于，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。
4.根据权利要求2所述的X连锁淋巴增生症XLP1亚型诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
Priority Applications (1)
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| CN202210034910.6A CN114381513B (zh) | 2022-01-13 | 2022-01-13 | 一种与x连锁淋巴增生症相关的生物标志物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN114381513A CN114381513A (zh) | 2022-04-22 |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN103740827A (zh) * | 2014-01-13 | 2014-04-23 | 香港中文大学深圳研究院 | 胎儿dna芯片及其应用 |
-
2022
- 2022-01-13 CN CN202210034910.6A patent/CN114381513B/zh active Active
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Exon skipping caused by a complex structural variation in SH2D1A resulted in X-linked lymphoproliferative syndrome type 1;Liwen Wu et al;Mol Genet Genomic Me;第10卷;第1-8页 * |
| X-linked lymphoproliferative disease due to SAP/SH2D1A deficiency: a multicenter study on the manifestations, management and outcome of the disease;Claire Booth et al;Blood;第111卷(第1期);第53-62页 * |
| X连锁淋巴组织细胞异常增生症研究进展;陈兰勤;刘春燕;申昆玲;;中国实用儿科杂志(04);第309-311页 * |
Also Published As
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|---|---|
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