CN103045722B - 结晶样先天性白内障致病基因crygd检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒，涉及基因检测盒。一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒，由AS-PCR扩增检测试剂组成，所述的AS-PCR扩增检测试剂由10×PCR？buffer？2μl；dNTP混合物0.5μl；10μmol/L的AS-PCR特异性上下游引物和内参的上下游引物各0.5μl；2U/μl的Taq？DNA聚合酶0.5μl；去离子水13μl组成。本发明对患者血液中提取的DNA组直接对CRYGD基因P23T点突变进行检测，能够精确地诊断结晶样先天性白内障，从而降低漏检率，并能与其他先天性白内障进行鉴别。

Description

结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测盒，具体涉及一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒。

背景技术

先天性白内障是胎儿发育过程中晶状体代谢异常导致的不同程度、不同形式的晶状体混浊，不仅使视网膜成像模糊，而且阻止视通路的发育，是目前儿童低视力和致盲的主要病因。该病的发病率约为0.5％，占儿童致盲性眼病的第二位。先天性白内障致病因素中有1/3与遗传相关，遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和x连锁遗传三种类型。致病基因筛查是探索疾病分子发病机制的重要步骤。

目前研究发现39个位点、17个基因与先天性白内障相关。包括晶状体蛋白基因，膜蛋白基因即缝隙连接蛋白基因和主要内源性膜蛋白基因，念珠状纤丝蛋白基因，铁蛋白轻链基因以及转录调节因子基因。

人晶状体内90%可溶性蛋白为晶状体蛋白，分别为α晶状体蛋白(40%)，β晶状体蛋白(35%)和γ晶状体蛋白(25%)，由三类晶状体蛋白基因α、β、γ编码。CRYG编码的γ晶状体蛋白在人晶状体中具有较高的浓度和屈光指数，γ晶状体蛋白在晶状体纤维细胞内大量表达并且只表达于己分化的晶状体纤维细胞，而在晶状体上皮细胞内无表达，因此，它对晶状体发育与维持其透明性具有重要作用。γ晶状体蛋白结构较为稳定，其中γC、γD、γS晶状体蛋白分别由CRYGC、CRYGD、CRYGS基因编码。

在己知先天性白内障致病侯选基因研究中发现，晶状体蛋白基因突变后不仅能造成晶状体蛋白结构的异常而影响其紧密排列，还会降低晶状体蛋白溶解性而导致混浊的形成。目前已发现几种基因突变，如CRYAB（D140N）与双层板层白内障相关，CRYBB2（W151C）与中央核性白内障相关，CRYGC（T5P）与中央粉尘状白内障相关，CRYGD（R14C）与点状进行性白内障相关，CRYGS（G18V）与多形态皮质性白内障相关。

由于遗传性先天性白内障具有非常显著的遗传异质性，不同的基因突变可导致相同表型的白内障，不同表型的白内障可由相同的基因突变造成。导致先天性白内障的临床症状及实验室检测指征具有多样性，因此有必要对白内障的各种临床类型，尤其是尚未发现相关的分子生物学基础的临床类型进行研究，并根据该变异建立起方便、快速和准确的检测方法，用于先天性白内障的诊断。

在已知的报道中，结晶样先天性白内障致病基因CRYGD基因第二个外显子中第70位碱基发生C-->A置换改变，导致第23位的脯氨酸改变为苏氨酸(P23T)，使γ晶状体蛋白结构的改变，引起白内障的发生，但是目前还没有较好的方法对其进行定位和检测。

发明内容

本发明的目的是为了对结晶样先天性白内障致病基因CRYGD进行检测，从而提供了一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒。

一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒，由AS-PCR扩增检测试剂组成，所述的AS-PCR扩增检测试剂由 10×PCR buffer 2ul；dNTP混合物0.5ul；10 umol/L的AS-PCR特异性上下游引物和内参的上下游引物各0.5ul；2 U/ul的Taq DNA 聚合酶0.5ul；去离子水13ul组成。

进一步地，所述的正向特异性引物序列为：5’-GAATGCAGCAGCGACCACA-3’，反向特异性引物序列为：5’-GGGTCCTGACTTGAGGATGT-3’。

上述结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒的使用方法，使用时，将目标基因组DNA 150 ng加入所述的试剂盒中，95℃预变性5 min，95℃ 变性30 S，55℃退火30 S，72℃延伸10 min，共32个循环，然后将扩增产物在1％琼脂糖凝胶上120 V恒压电泳10min，再按照常规方法检测，即可对结晶样先天性白内障致病基因CRYGD第二个外显子中第70位碱基发生C-->A（P23T）点突变进行定位和检测。

进一步地，将扩增产物在2％琼脂糖凝胶上120 V恒压电泳20min。

本发明结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒的检测对象为结晶样先天性白内障致病基因CRYGD，结晶样先天性白内障致病基因CRYGD的序列见序列表，经过100例临床试验，检测准确率高达99.9%。

与现有技术相比，利用本发明公开的结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒及其使用方法，对患者血液中提取的DNA组直接对CRYGD基因P23T点突变进行检测，能够精确地诊断结晶样先天性白内障，从而降低漏检率，并能与其他先天性白内障进行鉴别。

附图说明

图1：患者眼部检查表型为晶状体核性结晶样混浊。

图2：收集的家系图，符合常染色体显性遗传；图中方形图标表示男性，圆形图标表示女性，空白图形表示正常人，黑色填充图形表示患者，打斜线图形表示去世。

图3：D2S325连锁分析图；图中方形图标表示男性，圆形图标表示女性，空白图形表示正常人，黑色填充图形表示患者，打斜线图形表示去世。

图4：CRYGC和CRYGD附近的微卫星标记D2S2358进行的PAGE图。

图5：家系图及单倍体构建图。

图6：CRYGD基因C70A（P23T）突变序列测序图；图中箭头为错义突变所在位置。

图7：CRYGD基因正常序列测序图；图中箭头为该位置正常序列。

图8：AS-PCR产物凝胶电泳图；M代表DNA分子量Marker,箭头代表患者，其余为正常人，患者同时扩增出227Kb和530bp两个产物，而正常人只有参照产物530bp。

具体实施方式

    经过山西省眼科医院伦理委员会的批准，在严格遵守赫尔辛基宣言的前提下，本研究收集山西省榆社县一个四代先天性结晶样混浊白内障家系共22例成员，其中患者10例。对家系所有成员进行全面检查，美多丽滴眼液散瞳后经裂隙灯和检眼镜检查确定临床表型，对患者眼部图像进行数码采集。患者眼部检查表型均为晶状体核性结晶样混浊，混浊程度相似，形态一致。患者晶状体内可见点簇状灰白色混浊，中央混浊较为密集，向周边部放散。部分患者伴有继发性外斜视，不合并其他眼部及全身疾病。经受检者知情同意，采集其中17例家系成员的外周静脉血5ml。该家系共有22个家系成员，10名患者。每代都有患者，为垂直遗传，男女皆可患病，符合单基因常染色体显性遗传特点。

图1为患者眼部检查表型，为晶状体核性结晶样混浊；图为所收集的家系图，符合常染色体显性遗传，其中方形图标表示男性，圆形图标表示女性，空白图形表示正常人，黑色填充图形表示患者，打斜线图形表示去世。

实施1  对致病基因进行染色体定位

1、基因组DNA的提取

采用标准饱和酚/氯仿抽提法提取全血基因组DNA。

 2、连锁分析

（1）微卫星标记位点的选择：分别选取与17个已知ADCC致病基因距离5Mb范围内的22对多态性微卫星遗传标记，每个ADCC候选基因及其周围微卫星标记的物理距离如表1所示。

表1：17个已知ADCC致病基因及其附近微卫星标记的物理距离

（2）微卫星标记的扩增：

多重PCR反应采用Touch Down PCR程序，共两相循环：95℃预变性5 rain，第1相循环94℃ 30 S，起始退火温度63℃ 45 S，以后每个循环下降0．8℃ ，72℃ 45 S，共10个循环；第2相循环94℃ 30 S，55℃ 45 S，72℃ 45 S，共25个循环，最后72℃ 延伸10 min，4℃ 保存。PCR过程在美国伯乐（BioRad）上完成。其中PCR反应体系为25ul。包括基因组DNA 1ul（40 ng/ul）；上、下游引物各1ul（10pmol/ul）； TRANS-Tap MIX 12.5ul；去离子水补齐体系至25ul。

（3）微卫星基因型分析

微卫星标记经PCR扩增后，加入HD-LIZ500混合变性上样，经美国ABI公司3130遗传分析仪行毛细管电泳，通过Data Collection软件进行数据收集。用GeneMapper 3.7软件进行PCR扩增产物片段大小分析。

（4）计算LOD值和构建单倍体

利用Linkage package 5.2软件包中Mlink程序计算在不同重组率的情况下两点联锁值（log of odds，LOD），并假定致病基因频率为0.00001，外显率为100%。若LOD值>1支持连锁；LOD值<－3否定连锁。

连锁分析结果显示：对22对微卫星遗传标记等位基因片段长度分析结果显示，该家系在2号染色体上的微卫星标记D2S325和D2S2358与所有患者表型共分离，如表2。CRYGC和CRYGD做Genescan所用STR为D2S325，连锁分析结果见图3，可见5纯合，7连锁。

用CRYGC和CRYGD附近的D2S2358再跑PAGE，提示连锁，结果见图4及图5。Linkage package 5.2软件包Mlink程序计算两点LOD值，在重组率为0时，分别为ZD2S325=1.20和ZD2S2358=0.22，而在其他已知致病基因附近的微卫星遗传标记两点LOD值均为负数。因此，根据单倍体分析结果将该家系致病基因定位于2号染色体CRYGC或CRYGD基因。家系图及单倍体构建由Cyrillic 2.1软件绘制完成。

表2: 2号染色体上的微卫星标记D2S325和D2S2358与所有患者表型共分离

注：带下划线基因为可疑连锁,其中括号“（）”内数字编号代表病人。

实施例2   候选基因突变检测

1、候选基因突变的测序分析

PCR反应扩增：根据表3提供的CRYGC基因和CRYGD基因全部编码序列及外显子与内含子交界区及5’和3’非翻译区（5’UTR和3’UTR），引物序列用Primer 3自行设计，由大连宝生物公司合成。

PCR反应体系包括基因组DNA 150 ng；10×PCR buffer 2ul；dNTP混合物0.5ul；上下游引物(均为10 umol/L)各0.5ul；Taq DNA 聚合酶(2 U/ul)0.5ul；去离子水14ul。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃ 变性30 S，55℃退火30 S，72℃延伸10 min，共32个循环，4℃保存。PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上120 V恒压电泳10min。PCR原液经纯化（QIAquick PCR Purification Kit）后直接用ABI Prisms 310 Genetic Analyzer 进行双向测序，包括。测序结果同NCBI中发表的CRYGD基因cDNA序列进行比对（GenBank NM_006891）。蛋白质结构和功能分析采用Polyphen（http://coot.embl.de/PolyPhen/）程序。若发现可疑序列改变，对患者家中其他成员及100名正常对照进行相应区域的序列分析。

测序结果显示CRYGC基因3个外显子、外显子与内含子交界区及5’-UTR和3’-UTR均未发现异常改变；但患者测序中发现CRYGD基因中发现一个已知的错义突变，特征为CRYGD第二个外显子中第70位碱基发生C-->A置换改变（C70A），导致第23位的脯氨酸改变为苏氨酸（P23T），如图6所示，而正常人则没有出现，如图7所示。

表3：CRYGC基因和CRYGD基因3个外显子测序引物 

基因	外显子	引物序列	退火温度	片段大小
					CRYGC	1&2	F:TGCATAAAATCCCCTTACCG	58	500
		R:CCTCCCTGTAACCCACATTG
						3	F:TGGTTGGACAAATTCTGGAAG	58	450
		R:CCCACCCCATTCACTTCTTA
					CRYGD	1&2	F:CAGCAGCCCTCCTGCTAT	58	450
		R:GGGTCCTGACTTGAGGATGT
						3	F:GCTTTTCTTCTCTTTTTATTTCTGG	60	300
		R:AAGAAAGACACAAGCAAATCAGT

2、等位基因特异引物技术（AS-PCR）

AS-PCR对CRYGD突变所在位置设计特异性AS-PCR引物，序列如表4，片段大小为227bp。其中上游靠近3’的A代表与突变后序列互补的碱基。AS-PCR所用内参为该段序列测序所用的引物，片段大小约530bp。

一种结晶样先天性白内障致病基因检测试剂盒，由AS-PCR扩增检测试剂组成，所述的AS-PCR扩增检测试剂由 10×PCR buffer 2ul；dNTP混合物0.5ul；10 umol/L的AS-PCR特异性上下游引物和内参的上下游引物各0.5ul；2 U/ul的Taq DNA 聚合酶0.5ul；去离子水13ul组成；其中正向特异性引物序列为：5’-GAATGCAGCAGCGACCACA-3’，反向特异性引物序列为：5’-GGGTCCTGACTTGAGGATGT-3’。

使用时，将目标基因组DNA 150 ng加入所述的试剂盒中，95℃预变性5 min，95℃ 变性30 S，55℃退火30 S，72℃延伸10 min，共32个循环，然后将扩增产物在1％琼脂糖凝胶上120 V恒压电泳10min，或者将扩增产物在2％琼脂糖凝胶上120 V恒压电泳20min。

对该家系17个成员做AS-PCR扩增，扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果提示100%病人都同时扩增出227bp和530bp大小的片段，而正常个体仅有内参530bp大小的片段，如图8所示。

表4：特异性AS-PCR引物 

上游	5’-GAATGCAGCAGCGACCACA-3’
		下游	5’-GGGTCCTGACTTGAGGATGT-3’

<110> 山西省眼科医院

<120>结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂盒

<160> 2

<210> 1

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

        1 ttgtgcggtt cttgccaacg cagcagccct cctgctatat agcccgccgc gccgcagccc

       61 cacccgctca gcgccgccgc cccaccagct cagcaccgcc gtgcgcccag ccagccatgg

      121 ggaaggtgag cccagcctgc gccccgggac cccggagctt cctccatcgc gggggccaga

      181 gactggggca ggagcaggcc tgtgagacct cgccttgtcc cgccttgcct tgcagatcac

      241 cctctacgag gaccggggct tccagggccg ccactatgaa tgcagcagcg accaccccaa

      301 cctgcagccc tacttgagcc gctgcaactc ggcgcgcgtg gacagcggct gctggatgct

      361 ctatgagcag cccaactact cgggcctcca gtacttcctg cgccgcggcg actatgccga

      421 ccaccagcag tggatgggcc tcagcgactc ggtccgctcc tgccgcctca tcccccacgt

      481 gagtacatcc tcaagtcagg acccaggccc tcaggacact cactggatgg tttcaagcaa

      541 aagttaaaca ttagaagtag tgatcagtca caataactga gagtggacaa aagatgaact

      601 atagtggatt aagtcaatag agtttgctcc ccacataagc aaagtattac ccagacacca

      661 gttaatcaca attaatccac aaatatgtat tgagtaggaa tgtgtctcct gccctagggg

      721 ttgtataaga cttaagtcct attctggaat catttagaat ggagttgtag aaaaaccact

      781 aatacccaat agaagaataa atgctagagc gtacagcagt tactgagcaa acagggtaat

      841 ttcttttgag actttttccc gtttttgctc ctctcttgca tattttgggt tttcccaacc

      901 tatataagta agactttcct tcaaaggaga gcaacacaca tattttacac atgtgtccct

      961 tttatcccat atgtgtgtta gaacactaaa gtttatgcaa aattcgtcct tggacttact

     1021 gatgtttctt cctccatttt tcttcattgc attcacaagt tattgactta gaattaattg

     1081 ttctttaata tatgaagata tttaacattt tatattttaa tatattttaa atatttatat

     1141 tttaatatat ttaaaacact tatattttga atagaaggct tatatattta acatatttta

     1201 tttatgtcat tgatttaaat gatgcattat catttaattc aatatattaa atgatatatt

     1261 taatatattt taaatactta tatttaaaat acatattttt atattttaaa tatatttaca

     1321 ttaaatatat ttaatgaata taatgtattt aataatatat ttatttaata aatatgtatt

     1381 taatatattt atataactac ataaattata ttatatttta aatatattta acatatttta

     1441 aatatatttt aatatatttt taatatattt catttacatt atatgtgtgt atatatatat

     1501 ttttgttgtt gttgttttgt ttttgttttt tgaaacagag tctcactctg acgcccaggc

     1561 tggagtgcag tggtgcaatc tcggctcact gcaacctccg cctcctggat tcaaatgatt

     1621 ctcgtctctc agtctcctga gtagctggag ttacaggagc acgccaccac acccagctaa

     1681 tttttgtatt tttattttta ttttatttta ttttattatt tattattatt attttttttg

     1741 acgaagtctt gctctgttcc ccacgctgga gtgcagtggc atgatctcgg cacactgcaa

     1801 cctctgcttc ctgggcccta gcaattttct tcccaagtag ctgggattac aggcacccgc

     1861 caccacacct ggctaatttt tgtattttta gtatagacaa ggtttcgcca tattcgtcag

     1921 gctggtcttg aactcctgac ctcaagtgat ccacctgcct cggcttccca gggtgctggg

     1981 actacaggca tgagccactg ccccacccct tatatttctg tattttaaat atattttatt

     2041 tatattttag taaagttatt ttaaaataaa atataatttg taaaataaat ataattttaa

     2101 tttatactta taaaatataa tttgaatata attattaaaa taaaatatga ttaactttaa

     2161 ataaaatata attttataca ttttataata tattttaaat atagtatata attaaatatg

     2221 tattagatat catatgtata ttaaaattat acattattta aatatatttc tttataattt

     2281 aatgtttatt ttaatattaa aacatttctt caaaatggta taaaatagta ataagctgtt

     2341 acaggtttgg atttgcatgt ggtacaggat actgagccta ggaggcagct catcctaaga

     2401 aatagctgaa tatattaaag agtgagattt ccttctcaat ttcttcacca cacttcataa

     2461 tcttgaaaag gtactgaatc tctgtgctcg gtaatgagga gtttataaat attcagaatt

     2521 aattaaattt taccatgtat ttcaaaatgg cttgagcggg tcctcaccaa gctggactgc

     2581 ctaacaatgc attggaatca tttcacactt gcttttcttc tctttttatt tctgggtccg

     2641 ccagtctggc tctcacagga tcagactcta tgagagagag gactacagag gccagatgat

     2701 agagttcact gaggactgct cctgtcttca ggaccgcttc cgcttcaatg aaatccactc

     2761 cctcaacgtg ctggagggct cctgggtcct ctacgagctg tccaactacc gaggacggca

     2821 gtacctgctg atgccagggg actataggcg ctaccaggac tggggggcca cgaatgccag

     2881 agtgggctct ctgaggagag tcatagattt ctcctgaaat atgtcctctt ttgttgtttc

     2941 ttaatttgga aactaataaa atattttctg tgtgttcctg gca

Claims (1)

1.一种结晶样先天性白内障致病基因CRYGD检测试剂在制备检测结晶样先天性白内障的试剂盒中的应用，其特征是：检测试剂由AS-PCR扩增检测试剂组成，所述的AS-PCR扩增检测试剂由 10×PCR buffer 2μl；dNTP混合物0.5μl；10μmol/L的AS-PCR特异性上下游引物和内参的上下游引物各0.5μl；2 U/μl的Taq DNA 聚合酶0.5μl；去离子水13μl组成；

所述特异性上游引物序列为：5’-GAATGCAGCAGCGACCACA-3’，特异性下游引物序列为：5’-GGGTCCTGACTTGAGGATGT-3’；

PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸10min，共32个循环，4℃保存。