CN106834287B

CN106834287B - 一种用于检测RhD阴性表型的SNP标记

Info

Publication number: CN106834287B
Application number: CN201710231005.9A
Authority: CN
Inventors: 朱于莉; 焦淑贤; 吕红娟; 刘丽; 冯智慧
Original assignee: Qingdao Blood Center
Current assignee: Qingdao Blood Center
Priority date: 2017-04-11
Filing date: 2017-04-11
Publication date: 2020-02-18
Anticipated expiration: 2037-04-11
Also published as: CN106834287A

Abstract

本发明的目的是提供一种用于检测RhD阴性血型的SNP标记，包含有第一SNP标记，是RHD基因编码区域由起始密码子起第208位碱基发生了突变，由C突变为T；第二SNP标记，是RHD基因编码区域由起始密码子起第211位碱基发生插入了G，导致后续移码突变。本发明通过检测筛选获得的SNP位点，从而提供了一种有效的进行RhD血型基因诊断途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及血站献血员进行RHD基因的快速检测。

Description

一种用于检测RhD阴性表型的SNP标记

技术领域

本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种用于检测红细胞RhD阴性血型的SNP标记。

发明背景

Rh血型系统(Rhesus monkeys)是由著名科学家、诺贝尔奖得主Karl Landsteiner率先从恒河猴的红细胞上发现，故因此得名。Rh血型系统是目前人类36个血型系统中最复杂的，其重要性仅次于ABO系统，在临床输血、新生儿溶血病的诊治中占有重要地位。Rh血型系统中D抗原是免疫原性最强、多态性最复杂的。对于中国大陆的汉族人来讲，RhD阴性人群只占千分之三左右，由于十分罕见，故又名熊猫血。由于RhD的强抗原性，导致RhD阴性者不能接受RhD阳性血液，因为RhD抗原将刺激RhD阴性人体产生抗-RhD抗体。如果再次输入RhD阳性血液，即可导致溶血性输血反应。同样，若RhD阴性妇女由于妊娠或输血刺激体内产生抗-RhD抗体，再次怀孕则会导致新生儿溶血病的发生。

RhD血型系统而除了正常的RhD阳性、阴性外，还存在许多变异型，包括弱D(weakD)、部分D(partial D)及DEL型(放散型)。这些变异型的红细胞表面存在不完全的、或者变异的RhD抗原，若输注给阴性个体也有可能刺激产生抗体，因此这些变异型的个体有两个主要特点：一是他们作为受血者和献血者是不同的两种处理，作为受血者，他们只能输入RhD阴性血液；而作为献血者，他们的血液只能作为RhD阳性血使用。二是容易漏检，由于RhD抗原的变异，导致在常规的血型血清学检测时常规抗体无法与之反应，故易错判为RhD阴性，由于目前没有特别有效的清除不规则抗体的措施，所以这对于需多次输血的患者、妊娠期妇女来说危害十分巨大。因此准确的定型是确保正确输注的前提。目前血型的常规检测方法是血清学实验，但这个实验受多种限制，比如样本的质量、自身抗体或不规则抗体的干扰、疾病的影响等，同时对于DEL型这种只能通过吸收放散试验才能检测到的类别更是无法判断，这就需要利用分子生物学的方法在基因水平进行诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测RhD阴性血型的SNP标记，可以准确的对红细胞RhD阴性血型进行确证，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种与RhD阴性血型相关的SNP标记，包含有：

第一SNP标记，是RHD基因编码区域由起始密码子起第208位碱基发生了突变，由C突变为T；

第二SNP标记，是RHD基因编码区域由起始密码子起第211位碱基发生插入了G，导致后续移码突变。

本发明的另一个方面提供上述SNP标记的应用，是在制备检测红细胞RhD阴性血型的制品中的应用；

根据本发明的另一个方面，是提供上述SNP标记在检测红细胞RhD阴性血型中的应用。

上述的测定方法，是通过能扩增上述SNP标记的引物对待检测的血样DNA进行PCR扩增，扩增产物进行测序后进行基因型分析，确定待检样品是否存在上述的SNP标记。

上述方法中所使用的引物对，根据实施例的优选，其引物的序列信息如下：

RHD-2F:5’-TCCCCCTCGTCCTTCTCG-3’(SEQ ID NO:1)

RHD-2R:5’-CAGGATGCCCAGTTAATTTGAAT-3’(SEQ ID NO:2)。

其中SEQ ID NO：2同时为测序引物。

本发明通过检测筛选获得的SNP位点，从而提供了一种有效的进行RhD血型基因诊断途径，应用效果表明本发明所提供的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及血站献血员进行RHD基因的快速检测。

附图说明

图1：实施例1的RhD阴性表型RHD基因测序图，其中A：先证者父亲，正常RhD阳性表型，携带RHD全缺失基因；B：先证者母亲，正常RhD阳性表型，携带突变基因；C：先证者，RhD阴性表型。该家系中两名RHD基因编码区域由起始密码子起第208位碱基发生了突变，由C突变为T，第211位碱基发生插入突变，插入G，导致后续移码突变。

具体实施方式

申请人从226例血清学检测为RhD阴性或变异型个体进行RHD基因测序，发现了一例新的SNP突变导致RhD阴性，从而促成了本发明。

RH基因位于染色体1p34.3-1p36.1区域，可转录成2837bp的mRNA(NCBI登录号为NM_016124.4)，最终翻译形成417个氨基酸组成的蛋白质。由RHD基因(编码RhD抗原)和RHCE基因(编码RHC、c、E和e抗原)紧密串联排列组成。RHD基因和RHCE基因结构高度同源，均由10个外显子和9个内含子组成，其中两者的第8外显子完全相同，差异较大的是外显子3、4、5、7、9和内含子4。因此采用分子生物学的手段，建立RHD基因检测系统，并应用于临床和采供血工作当中，有助于RhD阴性个体的准确检出，有助于降低受血者不规则抗体的产生，有助于产前不规则抗体的预防和监测，有助于降低新生儿溶血病的发生。

对于本发明所涉及SNP标记，申请人解释如下：

SNP(single nucleotide polymorphism，SNP，即单核苷酸多态性)是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：SNP标记的筛选

1、提取外周血基因组DNA：

在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取RhD阴性或变异型献血员外周静脉血2-5mL，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，加入等体积TE(pH8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。

加入180μL TE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚(约300μL)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μL)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。

加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。

加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚、氯仿、异戊醇各100μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。

加入l/10体积3mol/L、pH5.2醋酸钠(约30μL)，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。

向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。

对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。

2、直接测序法寻找该献血员RHD基因的突变

PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：

(1)PCR反应条件：95℃5m；95℃30s，58℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5m。

(2)反应体系：(Onelambda公司Fast startTaq polymerase)

应用该反应体系分别进行每位RhD阴性献血员的基因组DNA模板与该RhD引物的扩增反应。

PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，SEQ ID NO：2：5’-CAGGATGCCCAGTTAATTTGAAT-3’，在该RhD阴性献血员RHD基因第二外显子处发现两处突变，第208位碱基C突变为T，第211位碱基发生G插入突变(图1C)，从而导致后续移码突变，475-477位碱基编码为TAA终止密码，第二外显子只翻译出159个氨基酸，并且导致后续8个外显子均无法翻译为蛋白，RhD蛋白翻译提前终止，造成RhD阴性血型。多次测序结果表明此两处突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的，应为为一新生突变。该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见，该突变导致了RhD蛋白长度截短，从而导致RhD阴性。而在200例RhD阳性献血员的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

通过上述的分析，证明该方法可以准确测定RHD基因，从而可以更加精准的确定待测者的RhD血型，对于患者制定输血政策具有重要意义。

实施例2：对SNP突变先证者的父母进行遗传验证

1、提取外周血基因组DNA：

2、直接测序法寻找该先证者父母RHD基因第二外显子的突变

PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：

(2)反应体系：(Onelambda公司Fast startTaqpolymerase)

应用该反应体系分别进行先证者父母的基因组DNA模板与扩增引物的扩增反应。

PCR产物测序：采用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序(图1)，先证者父亲(A)为正常RhD阳性表型，携带RHD全缺失基因；先证者母亲(B)为正常RhD阳性表型，携带突变基因，表现为RHD正常基因与SNP突变基因杂合峰；先证者(C)遗传父亲RHD全缺失基因和母亲SNP突变基因，顾表现为RhD阴性表型。该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见。而在200例RhD阳性献血员的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

上述的实验结果表明，该SNP突变位点能够精准的确定待测者的RhD血型，对于患者制定输血政策具有重要意义。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛市中心血站（青岛市公民义务献血办公室青岛市输血医学研究所）

<120> 一种用于检测RhD阴性表型的SNP标记

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

tccccctcgt ccttctcg 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

caggatgccc agttaatttg aat 23

Claims

1.一种SNP标记，其特征在于，所述的SNP标记包含有：

第一SNP标记，是RHD基因编码区域由起始密码子起第208位碱基发生了突变，由C突变为T；和第二SNP标记，是RHD基因编码区域由起始密码子起第211位碱基发生插入了G，导致后续移码突变。

2.权利要求1所述的SNP标记在制备检测红细胞RhD阴性血型的制品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为检测试剂盒。

4.权利要求1所述的SNP标记在检测红细胞RhD阴性血型中的应用。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法是通过能扩增权利要求1所述的SNP标记的引物对待检测的血样的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行测序后进行基因型分析，确定待检样品是否存在上述的SNP标记。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法中使用的引物的序列分别为SEQID NO:1和SEQ ID NO:2。