CN111218453A - 一种RhD血型抗原RHD-G353A突变体及检测 - Google Patents

一种RhD血型抗原RHD-G353A突变体及检测 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RhD血型抗原RHD‑G353A突变体及检测，野生型的RHD基因如序列SEQ ID NO:1，突变型的RHD基因如序列SEQ ID NO:2；一种用于检测RHD1058G>C等位基因的特异性引物，所述特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，所述特异性引物的下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。本发明所述的一种RhD血型抗原RHD‑G353A突变体及检测，可以高灵敏且高精度检测掺杂于基因库中突变基因的有无。

Description

一种RhD血型抗原RHD-G353A突变体及检测
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种RhD血型抗原RHD-G353A突变体及检测。
背景技术
Rh血型是人类红细胞血型系统中最为复杂、最具多态性的系统，也是引起临床输血反应和严重新生儿溶血病的主要红细胞血型。目前已发现50多种Rh血型抗原，其中RhD抗原具有很强的免疫原性，是由RHD基因编码产生，是血型研究的重点。临床上根据红细胞膜表面是否检测到D抗原，将Rh血型抗原分为RhD阳性和RhD阴性两大类。
目前，Rh血型D抗原的常规检测方法是采用血清学盐水法和间接抗人球蛋白试验以及吸收放散试验进行鉴定。但是血清学技术存在一定的局限性。由于疾病或其他因素的影响，某些个体的红细胞在血清学定型时结果难以判定；慢性长期输血患者血清学结果有时呈现“混合视野”的现象；当无法获得样本的红细胞或红细胞样本不足时，像胎儿血型鉴定、法医鉴定遗留物等，血清学检测也不能获得正确结果。
用免疫血清学的方法对RhD血型的检测主要依赖于抗-D抗体的特异性和抗原表达量。目前随着分子生物技术的发展，RhD突变体逐年增加，其抗原表达量和基因突变位点各有差异。这些基因突变体的检测主要通过分子生物学方法确定Rh血型D抗原基因型，不仅在弥补血清学技术的不足上具有重要的临床实用意义，而且还具有广泛的科研应用价值。本研究小组最近发现了2例Rh血型RHD-G353A突变体携带有RHD1058G>C等位基因，并针对新发现的RHD1058G>C等位基因建立了针对性检测方法。
发明内容
本发明目：一种RhD血型抗原RHD-G353A突变体RHD1058G>C等位基因及其检测方法，通过检测RHD1058G>C等位基因进行Rh血型基因型分析。
技术方案：一种RhD血型抗原RHD-G353A突变体RHD1058G>C等位基因，野生型的RHD基因如序列SEQ ID NO:1，突变型的RHD基因如序列SEQ ID NO:2；相比野生型的RHD基因，突变型的RHD基因具有g.25306714G>C的基因位点突变，即突变型的RHD基因序列的第80位碱基G突变为C；由野生型的RHD基因序列转录得到的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，由突变型的RHD基因基因序列转录得到的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，其中氨基酸序列SEQ ID NO：6的第353位由甘氨酸G转变为丙氨酸A。
进一步地，一种用于检测RHD1058G>C等位基因的特异性引物，所述特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，所述特异性引物的下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的有益效果如下所述：本发明一种RhD血型抗原RHD-G353A突变体及检测，采用分子生物学方法进行基因水平的检测，可以高灵敏且高精度检测掺杂于基因库中突变基因的有无。由于不同民族间存在RHD基因的差异，在相关研究的基础上，根据中国人的RHD基因分子背景，专门针对新发现的RHD1058G>C等位基因而设计的。本发明不仅在弥补血清学技术的不足上具有重要的临床实用意义，而且还具有广泛的科研应用价值。
附图说明
附图1为实施例中RHD1058G>C等位基因检测凝胶电泳图；
附图2为实施例中RHD1058G>C等位基因突变测序图。
具体实施方式
下面结合附图1至2对本发明作更进一步的说明。
一种RhD血型抗原RHD-G353A突变体RHD1058G>C等位基因，野生型的RHD基因如序列SEQ ID NO:1，突变型的RHD基因如序列SEQ ID NO:2；相比野生型的RHD基因，突变型的RHD基因具有g.25306714G>C的基因位点突变，即突变型的RHD基因序列的第80位碱基G突变为C；由野生型的RHD基因序列转录得到的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，由突变型的RHD基因基因序列转录得到的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，其中氨基酸序列SEQ ID NO：6的第353位由甘氨酸G转变为丙氨酸A。
SEQ ID NO:1
ATCATGGGCTACAACTTCAGCTTGCTGGGTCTGCTTGGAGAGATCATCTACATTGTGCTGCTGGTGCTTGATACCGTCGGAGCCGGCAATGGCATGTGGGTCACTGGGCTTACCCCCCATCCCCTTAACACTCCCCTCCAACTCAGGAAGAAATGTGTGCAGAGTCCTTAGCTGGGGCGTGTGCACTCGGGGCCAGGTGCTCAGTAGGCTTCGGTGAATATTTGTTGGCTGATTTATTCAGAAATTCTGTCCAGCCCCTACCTTGGATGGATTTATCACCTCTCCAGGCCACCTCTTCTTTCCA
SEQ ID NO:2
ATCATGGGCTACAACTTCAGCTTGCTGGGTCTGCTTGGAGAGATCATCTACATTGTGCTGCTGGTGCTTGATACCGTCGCAGCCGGCAATGGCATGTGGGTCACTGGGCTTACCCCCCATCCCCTTAACACTCCCCTCCAACTCAGGAAGAAATGTGTGCAGAGTCCTTAGCTGGGGCGTGTGCACTCGGGGCCAGGTGCTCAGTAGGCTTCGGTGAATATTTGTTGGCTGATTTATTCAGAAATTCTGTCCAGCCCCTACCTTGGATGGATTTATCACCTCTCCAGGCCACCTCTTCTTTCCA
SEQ ID NO:5
MSSKYPRSVRRCLPLWALTLEAALILLFYFFTHYDASLEDQKGLVASYQVGQDLTVMAAIGLGFLTSSFRRHSWSSVAFNLFMLALGVQWAILLDGFLSQFPSGKVVITLFSIRLATMSALSVLISVDAVLGKVNLAQLVVMVLVEVTALGNLRMVISNIFNTDYHMNMMHIYVFAAYFGLSVAWCLPKPLPEGTEDKDQTATIPSLSAMLGALFLWMFWPSFNSALLRSPIERKNAVFNTYYAVAVSVVTAISGSSLAHPQGKISKTYVHSAVLAGGVAVGTSCHLIPSPWLAMVLGLVAGLISVGGAKYLPGCCNRVLGIPHSSIMGYNFSLLGLLGEIIYIVLLVLDTVGAGNGMI
SEQ ID NO:6
MSSKYPRSVRRCLPLWALTLEAALILLFYFFTHYDASLEDQKGLVASYQVGQDLTVMAAIGLGFLTSSFRRHSWSSVAFNLFMLALGVQWAILLDGFLSQFPSGKVVITLFSIRLATMSALSVLISVDAVLGKVNLAQLVVMVLVEVTALGNLRMVISNIFNTDYHMNMMHIYVFAAYFGLSVAWCLPKPLPEGTEDKDQTATIPSLSAMLGALFLWMFWPSFNSALLRSPIERKNAVFNTYYAVAVSVVTAISGSSLAHPQGKISKTYVHSAVLAGGVAVGTSCHLIPSPWLAMVLGLVAGLISVGGAKYLPGCCNRVLGIPHSSIMGYNFSLLGLLGEIIYIVLLVLDTVAAGNGMI
一种用于检测RHD1058G>C等位基因的特异性引物，所述特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，所述特异性引物的下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。
所述RhD血型抗原RHD-G353A突变体RHD1058G>C等位基因的检测方法，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无。所述检测方法如下：
(1)提取待检样本中DNA；
(2)以该DNA为模板，以针对RHD1058G>C突变基因附近的编码区设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；
(3)测出PCR反应产物的核苷酸序列组成；
(4)将核苷酸序列与RHD野生型基因的序列进行比较，确定是否有1058G→C突变。所述PCR反应产物的核苷酸序列组成可以将PCR反应产物通过测序仪进行测序。
所述RhD血型抗原RHD-G353A突变体RHD1058G>C等位基因的检测。具体步骤如下：
(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的RHD基因(序列号：NC_000001.11)，通过Oligo 6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列,上游引物序列如表1中SEQID NO:3所示；下游引物序列如SEQID NO:4所示，扩增产物片段长度为190bp；
表1.RHD1058G>C等位基因检测引物序列及反应特异性
Figure BDA0002406187050000041
注：*寡核苷酸引物序列所涉及的外显子碱基序列的位置是指由ATG起始编码子开始的10个外显子整个排列顺序；所涉及的内含子碱基序列的位置是指每个内含子单个排列顺序。
(2)RHD1058G>C等位基因增扩：反应体系总体积50μL；其中含PCR 5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，1U/μL的Taq聚合酶1.0μL，MgCl2终浓度为2.0mmol/L，dNTP终浓度为200nmol/L，特异性正向引物和反向引物的终浓度均为200nmol/L；加消毒双蒸水至反应体系总体积50μL；将上述反应体系在PCR仪中反应，反应条件：95℃预变性5min，然后依次94℃变性30s，接着61℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环；
(3)RHD1058G>C等位基因检测：用琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。
DNA模板的制备方法：
采用购置的试剂盒提取全血基因组DNA，具体步骤如下：
(1)取无菌2.0mL离心管一只，加入1mL细胞裂解液；
(2)轻轻震荡然经EDTA抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μL血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5-6次混匀；
(3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2-3次混匀)；
(4)12000rpm室温离心5分钟；
(5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出；
(6)使用涡旋振荡器(Votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10-15秒)；
(7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μL。用移液枪头吸放溶液5-6次裂解白细胞。此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散。若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μL并重复置于37℃孵育；
(8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μL，用涡旋振荡器剧烈震荡10-20秒；
(9)12000rpm室温离心5分钟；
(10)其上清液转至对应编号的已加入300μL室温异丙醇的2.0mL离心管中；
(11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状DNA形成沉淀；
(12)12000rpm室温离心1分钟；
(13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次；
(14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净。将离心管置于50℃烘烤5-10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净；
(15)向离心管中加入50-100μL的DNA溶解液，轻轻混匀；
(16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估DNA提取效果，Nanodrop核酸仪检测含量，定量到20ng/μL，-20℃保存。
RHD1058G>C等位基因检测技术方案：
仪器：Veriti 96型PCR仪、BIO-RAD Gel Doc XR+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。
试剂：QIAamp DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)；DNAIsolation Kit提取试剂盒(北京PELFREEZ公司)；PCR缓冲液、dNTP、Taq酶(美国ABI公司)；引物和探针由上海生工生物有限公司合成。
(1)RHD1058G>C等位基因增扩：反应总体积：50μL，含PCR 5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，Taq聚合酶(1U/μL)1.0μL，MgCl2终浓度2.0mmol/L，dNTP终浓度200nmol/L，以及特异性上、下引物终浓度200nmol/L，并加消毒双蒸水至总体积50μL；反应条件：95℃预变性5分钟，然后依次94℃变性30秒，接着61℃退火40秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
(2)RHD1058G>C等位基因检测：用1.5％琼脂糖凝胶对将步骤(1)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，PCR产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示PCR产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，M：50bp梯度分子量标记物，1：空白对照，2：野生型对照，3：RHD1058G>C突变型样本。
(3)扩增产物纯化：本研究采用Takara公司的Agarose Gel DNA PurificationKit试剂盒，将琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物进行纯化回收，准备测序。
(4)Sanger测序与结果判断：纯化后PCR产物在ABI3730型全自动DNA测序仪上进行测序。将测序结果与RHD野生型参考序列(NCBI Reference Sequence:NC_000001.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。检测所得基因突变如图2所示，图中箭头所示为RHD基因g.25306714G>C突变。
序列表
<110> 无锡市第五人民医院
<120> 一种RhD血型抗原RHD-G353A突变体及检测
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 304
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atcatgggct acaacttcag cttgctgggt ctgcttggag agatcatcta cattgtgctg 60
ctggtgcttg ataccgtcgg agccggcaat ggcatgtggg tcactgggct taccccccat 120
ccccttaaca ctcccctcca actcaggaag aaatgtgtgc agagtcctta gctggggcgt 180
gtgcactcgg ggccaggtgc tcagtaggct tcggtgaata tttgttggct gatttattca 240
gaaattctgt ccagccccta ccttggatgg atttatcacc tctccaggcc acctcttctt 300
tcca 304
<210> 2
<211> 304
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atcatgggct acaacttcag cttgctgggt ctgcttggag agatcatcta cattgtgctg 60
ctggtgcttg ataccgtcgc agccggcaat ggcatgtggg tcactgggct taccccccat 120
ccccttaaca ctcccctcca actcaggaag aaatgtgtgc agagtcctta gctggggcgt 180
gtgcactcgg ggccaggtgc tcagtaggct tcggtgaata tttgttggct gatttattca 240
gaaattctgt ccagccccta ccttggatgg atttatcacc tctccaggcc acctcttctt 300
tcca 304
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ttgtgctgct ggtgcttgat accgtcgc 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
tctgaataaa tcagccaaca aatattc 27
<210> 5
<211> 359
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Ser Ser Lys Tyr Pro Arg Ser Val Arg Arg Cys Leu Pro Leu Trp
1 5 10 15
Ala Leu Thr Leu Glu Ala Ala Leu Ile Leu Leu Phe Tyr Phe Phe Thr
20 25 30
His Tyr Asp Ala Ser Leu Glu Asp Gln Lys Gly Leu Val Ala Ser Tyr
35 40 45
Gln Val Gly Gln Asp Leu Thr Val Met Ala Ala Ile Gly Leu Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Ser Ser Phe Arg Arg His Ser Trp Ser Ser Val Ala Phe Asn
65 70 75 80
Leu Phe Met Leu Ala Leu Gly Val Gln Trp Ala Ile Leu Leu Asp Gly
85 90 95
Phe Leu Ser Gln Phe Pro Ser Gly Lys Val Val Ile Thr Leu Phe Ser
100 105 110
Ile Arg Leu Ala Thr Met Ser Ala Leu Ser Val Leu Ile Ser Val Asp
115 120 125
Ala Val Leu Gly Lys Val Asn Leu Ala Gln Leu Val Val Met Val Leu
130 135 140
Val Glu Val Thr Ala Leu Gly Asn Leu Arg Met Val Ile Ser Asn Ile
145 150 155 160
Phe Asn Thr Asp Tyr His Met Asn Met Met His Ile Tyr Val Phe Ala
165 170 175
Ala Tyr Phe Gly Leu Ser Val Ala Trp Cys Leu Pro Lys Pro Leu Pro
180 185 190
Glu Gly Thr Glu Asp Lys Asp Gln Thr Ala Thr Ile Pro Ser Leu Ser
195 200 205
Ala Met Leu Gly Ala Leu Phe Leu Trp Met Phe Trp Pro Ser Phe Asn
210 215 220
Ser Ala Leu Leu Arg Ser Pro Ile Glu Arg Lys Asn Ala Val Phe Asn
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Ala Val Ala Val Ser Val Val Thr Ala Ile Ser Gly Ser
245 250 255
Ser Leu Ala His Pro Gln Gly Lys Ile Ser Lys Thr Tyr Val His Ser
260 265 270
Ala Val Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Cys His Leu Ile
275 280 285
Pro Ser Pro Trp Leu Ala Met Val Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Ile
290 295 300
Ser Val Gly Gly Ala Lys Tyr Leu Pro Gly Cys Cys Asn Arg Val Leu
305 310 315 320
Gly Ile Pro His Ser Ser Ile Met Gly Tyr Asn Phe Ser Leu Leu Gly
325 330 335
Leu Leu Gly Glu Ile Ile Tyr Ile Val Leu Leu Val Leu Asp Thr Val
340 345 350
Gly Ala Gly Asn Gly Met Ile
355
<210> 6
<211> 359
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Ser Ser Lys Tyr Pro Arg Ser Val Arg Arg Cys Leu Pro Leu Trp
1 5 10 15
Ala Leu Thr Leu Glu Ala Ala Leu Ile Leu Leu Phe Tyr Phe Phe Thr
20 25 30
His Tyr Asp Ala Ser Leu Glu Asp Gln Lys Gly Leu Val Ala Ser Tyr
35 40 45
Gln Val Gly Gln Asp Leu Thr Val Met Ala Ala Ile Gly Leu Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Ser Ser Phe Arg Arg His Ser Trp Ser Ser Val Ala Phe Asn
65 70 75 80
Leu Phe Met Leu Ala Leu Gly Val Gln Trp Ala Ile Leu Leu Asp Gly
85 90 95
Phe Leu Ser Gln Phe Pro Ser Gly Lys Val Val Ile Thr Leu Phe Ser
100 105 110
Ile Arg Leu Ala Thr Met Ser Ala Leu Ser Val Leu Ile Ser Val Asp
115 120 125
Ala Val Leu Gly Lys Val Asn Leu Ala Gln Leu Val Val Met Val Leu
130 135 140
Val Glu Val Thr Ala Leu Gly Asn Leu Arg Met Val Ile Ser Asn Ile
145 150 155 160
Phe Asn Thr Asp Tyr His Met Asn Met Met His Ile Tyr Val Phe Ala
165 170 175
Ala Tyr Phe Gly Leu Ser Val Ala Trp Cys Leu Pro Lys Pro Leu Pro
180 185 190
Glu Gly Thr Glu Asp Lys Asp Gln Thr Ala Thr Ile Pro Ser Leu Ser
195 200 205
Ala Met Leu Gly Ala Leu Phe Leu Trp Met Phe Trp Pro Ser Phe Asn
210 215 220
Ser Ala Leu Leu Arg Ser Pro Ile Glu Arg Lys Asn Ala Val Phe Asn
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Ala Val Ala Val Ser Val Val Thr Ala Ile Ser Gly Ser
245 250 255
Ser Leu Ala His Pro Gln Gly Lys Ile Ser Lys Thr Tyr Val His Ser
260 265 270
Ala Val Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Cys His Leu Ile
275 280 285
Pro Ser Pro Trp Leu Ala Met Val Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Ile
290 295 300
Ser Val Gly Gly Ala Lys Tyr Leu Pro Gly Cys Cys Asn Arg Val Leu
305 310 315 320
Gly Ile Pro His Ser Ser Ile Met Gly Tyr Asn Phe Ser Leu Leu Gly
325 330 335
Leu Leu Gly Glu Ile Ile Tyr Ile Val Leu Leu Val Leu Asp Thr Val
340 345 350
Ala Ala Gly Asn Gly Met Ile
355

Claims (2)

1.一种RhD血型抗原RHD-G353A突变体RHD1058G>C等位基因，其特征在于：野生型的RHD基因如序列SEQ ID NO:1，突变型的RHD基因如序列SEQ ID NO:2；相比野生型的RHD基因，突变型的RHD基因具有g.25306714G>C的基因位点突变，即突变型的RHD基因序列的第80位碱基G突变为C；由野生型的RHD基因序列转录得到的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，由突变型的RHD基因基因序列转录得到的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，其中氨基酸序列SEQ ID NO：6的第353位由甘氨酸G转变为丙氨酸A。
2.一种用于检测RHD1058G>C等位基因的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，所述特异性引物的下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。
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