CN115011702B - 一种RhD血型基因RHD56C＞G等位基因及其检测 - Google Patents

一种RhD血型基因RHD56C＞G等位基因及其检测 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种RhD血型基因RHD56C>G等位基因，该基因RHD56C＞G等位基因位点g.25272603C>G突变。采用特异性引物‑PCR技术设计出针对基因突变的引物序列，通过基因扩增方法对包含突变基因的区域专门针对RHD56C>G等位基因进行检测。

Description

一种RhD血型基因RHD56C＞G等位基因及其检测
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种RhD血型基因RHD56C＞G等位基因及检测。
背景技术
Rh血型系统是目前国际输血协会确认的30个红细胞血型系统中最具复杂性和多态性的血型系统，其中D抗原是最重要的抗原，也是免疫性最强的抗原。在输血过程中，由于D抗原不合可以产生Rh抗体，引起溶血性输血反应。RhD阴性血型妇女妊娠RhD阳性胎儿可致敏产生抗-D抗体，导致胎儿/新生儿溶血性疾病。
Rh血型基因(RH)位于人类染色体1p34.3p6.11区域，主要由紧密连锁的RHD基因和RHCE基因串联排列组成，RHD基因编码D抗原，RHCE基因编码C，c，E，e抗原，RHD基因决定D表型。RHD基因和RHCE基因高度同源(93.8％)，均有10个外显子和9个内含子，长度分别为57932bp和58575bp，均编码417个氨基酸。RHD基因外显子1、2、8的编码区与RHCE基因完全相同，仅外显子3、4、5、6、7、9及外显子10的3′端非翻译区存在部分碱基差异。
RhD抗原表型除了正常的D阳性和阴性表型外，还存在多种D变异表型。D变异体主要包括弱D、部分D和DEL型。RHD基因编码区碱基突变可导致抗原表达完整，但是强度减弱，从而表现为弱D表型。高加索人群中96.6％的Rh阴性血型是由RHD等位基因纯合缺失导致，仅3.4％的Rh阴性血型者携带突变RHD基因，然而，中国汉族RHD血型阴性人群等位基因频率与欧美人群亦存在差异，RHD外显子全缺失型仅占30～40％，RHD-CE(2-9)-D占20～30％，其余均为D变异型。
目前，Rh血型D抗原的常规检测方法是采用血清学盐水法和间接抗人球蛋白试验及吸收放散试验进行鉴定，该技术主要依赖于抗-D抗体的特异性和抗原表达量，不同基因突变位点导致RhD变异体的抗原表达量存在差异，可出现假阴性/假阳性结果。基因分型技术可弥补血清学技术的不足，对于RhD变异体的检测具有重要的临床实用意义及科研价值。本发明提供一种RhD血型基因RHD56C＞G等位基因及一种用于检测RHD56C>G等位基因的特异性引物。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提供一种RhD血型基因RHD56C＞G等位基因及用于其检测的特异性引物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种RhD血型基因RHD56C>G等位基因，该基因RHD56C＞G等位基因位点g.25272603C>G突变；所述g.25272603C>G突变是指突变位点在SEQ ID NO:1序列的第271位碱基C突变为G；其突变基因DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
一种用于检测RHD56C>G等位基因的特异性引物，该特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示，用于检测RHD56C>G等位基因。
本发明的检测方法是利用人类RhD血型不同等位基因特异性序列位点的改变，设计出针对性引物序列进行聚合酶链反应来完成的。
RhD血型基因RHD56C>G等位基因位点g.25272603C>G突变，该突变发生于第1号染色体的25272603位置，该基因在NCBl参考数据库GRCh38.p13中的编号为NC_000001.11(25272393-25330445)。这里列出在该数据库中包含有本位点野生型的部分碱基序列供参考，如SEQ ID NO：1所示，其突变位点在SEQ ID NO:1序列的第271位由碱基C突变为G。RHD基因突变的相对应序列如SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID NO:1
ACAATATTGGAAAACATACATTTCCTCCCCTCCCCATCATAGTCCCTCTGCTTCCGTGTTAACTCCATAGAGAGGCCAGCACAACCAGCCTTGCAGCCTGAGATAAGGCCTTTGGCGGGTGTCTCCCCTATCGCTCCCTCAAGCCCTCAAGTAGGTGTTGGAGAGAGGGGTGATGCCTGGTGCTGGTGGAACCCCTGCACAGAGACGGACACAGGATGAGCTCTAAGTACCCGCGGTCTGTCCGGCGCTGCCTGCCCCTCTGGGCCCTAACACTGGAAGCAGCTCTCATTCTCCTCTTCTATTTTTTTACCCACTATGACGCTTCCTTAGAGGATCAAAAGGGGCTCGTGGCATCCTATCAAGGTGAGAGTTCATTGGAAAAGTGGTCACAGGAGCAAATAGCAGGGGCAGGGGCGGGGGAGGCCTGTGGTTCTCCAGGGGCACAGATGTTCCTTTCTACAAAATCCCAAGGAAAAAGAT
SEQ ID NO:2
ACAATATTGGAAAACATACATTTCCTCCCCTCCCCATCATAGTCCCTCTGCTTCCGTGTTAACTCCATAGAGAGGCCAGCACAACCAGCCTTGCAGCCTGAGATAAGGCCTTTGGCGGGTGTCTCCCCTATCGCTCCCTCAAGCCCTCAAGTAGGTGTTGGAGAGAGGGGTGATGCCTGGTGCTGGTGGAACCCCTGCACAGAGACGGACACAGGATGAGCTCTAAGTACCCGCGGTCTGTCCGGCGCTGCCTGCCCCTCTGGGCCCTAAGACTGGAAGCAGCTCTCATTCTCCTCTTCTATTTTTTTACCCACTATGACGCTTCCTTAGAGGATCAAAAGGGGCTCGTGGCATCCTATCAAGGTGAGAGTTCATTGGAAAAGTGGTCACAGGAGCAAATAGCAGGGGCAGGGGCGGGGGAGGCCTGTGGTTCTCCAGGGGCACAGATGTTCCTTTCTACAAAATCCCAAGGAAAAAGATAGGCCTGTGGTTCTCCAGGGGCACAGATGTTCCTTTCTACAAAATCCCAAGGAAAAAGAT
RhD血型基因RHD56C>G等位基因的检测方法是通过基因扩增对包含突变基因的目标部位进行选择性地扩增，以此检测该突变基因的有无。所述检测方法如下：
(1)提取待检样本中DNA；
(2)以该DNA为模板，以针对RHD56C>G突变基因附近的编码区设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；
(3)测出PCR反应产物的核苷酸序列组成；
(4)将核苷酸序列与RHD野生型基因的序列进行比较，确定是否有56C→G突变，所述PCR反应产物的核苷酸序列组成可以将PCR反应产物通过测序仪进行测序。
所述RhD血型基因RHD56C>G等位基因的检测，具体步骤如下：
(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的RHD基因(序列号：NC_000001.11)，通过Primer-BLAST在线软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列，上游引物序列如表1中SEQID NO:3所示；下游引物序列如SEQID NO:4所示，扩增产物片段长度为231bp。
表1RHD56C>G等位基因检测引物序列及反应特异性
Figure BDA0003614128680000031
(2)RHD56C＞G等位基因增扩：反应总体积50μL，含buffer 5.0μL，DNA模板1.0μL，Taq聚合酶(1U/μL)1.0μL，GC-MELT Reagent 10.0ul，dNTP 7.0ul，以及特异性上、下引物(10umol/μL)各1.0ul，并加纯水至总体积50μL。
反应条件：94℃预变性3分钟，然后依次94℃变性30秒，接着61℃退火15秒，共35个循环，68℃延伸7分钟，4℃10分钟。
(3)RHD56C＞G等位基因检测：用1.5％琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。
本发明的有益效果是：本发明针对新发现的RHD56C>G等位基因设计特异性引物，利用PCR扩增技术及一代测序技术，可有效区分RHD基因和RHCE基因片段，同时对RHD基因25272603位点进行序列分析，可弥补血清学分型技术的不足，具有重要的临床实用意义及科研应用价值。
附图说明
图1为RHD56C>G等位基因检测凝胶电泳图；
图2为RHD56C>G等位基因突变的测序图。
具体实施方式
实施例1
DNA模板的制备：
采用购置的试剂盒提取全血基因组DNA，具体步骤如下：
(1)取一只1.5mL的无菌离心管，加入20ul的Taq聚合酶；
(2)轻轻震荡然经EDTA抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取200μL血样及200ul buffer AL加入上述含有Taq聚合酶的离心管中，使用涡旋振荡器(Votex)震荡混匀；
(3)56℃孵育10分钟(期间颠倒离心管2-3次混匀)；
(4)瞬离，加入无水乙醇200ul，混匀后再次瞬离；
(5)用移液器缓慢地尽可能将液体转至吸附柱中，8000rpm室温离心1分钟，弃去废液；
(6)换柱，向吸附柱中加入buffer AW1 500ul，8000rpm室温离心1分钟，弃去废液；
(7)换柱，向吸附柱中加入buffer AW2 500ul，13200rpm室温离心3分钟，弃去废液；
(8)空转，12000rpm室温离心1分钟；
(9)将吸附柱置于1.5ml的EP管中，向吸附柱中加入100ul的AE，室温下静置10-20分钟；
(10)8000rpm室温离心1分钟；
(11)将提取的DNA样本置于-20℃保存；
(12)用Nanodrop核酸仪检测含量。
实施例2
RHD56C＞G等位基因检测技术方案：
仪器：Veriti 96型PCR仪、BIO-RAD Gel Doc XR+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。
试剂：QIAamp DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)；PCR缓冲液、dNTP、Taq酶(美国ABI公司)；引物和探针由上海生工生物有限公司合成。
(1)RHD56C＞G等位基因增扩：
反应总体积：50μL，含5.0μL的buffer，DNA模板1.0μL，Taq聚合酶(1U/μL)1.0μL，GC-MELT Reagent 10.0ul，7.0ul的dNTP，以及特异性上、下引物(10umol/μL)各1.0ul，并加纯水至总体积50μL。
反应条件：94℃预变性3分钟，然后依次94℃变性30秒，接着61℃退火15秒，共35个循环，68℃延伸7分钟，4℃10分钟。
(2)RHD56C＞G等位基因检测：
用2.5％琼脂糖凝胶对将步骤(1)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，PCR产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示PCR产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，M表示分子量标记物，1为空白对照，2为野生型对照，3为RHD56C＞G突变型样本。
(3)Sanger测序与结果判断：
PCR产物在ABI3730型全自动DNA测序仪上进行测序。将测序结果与RHD野生型参考序列(NCBI Reference Sequence:NC_000001.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。检测所得基因突变图如图2所示，图中箭头所示为RHD基因显示g.25272603C>G突变。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京鼓楼医院
<120> 一种RhD血型基因RHD56C＞G等位基因及检测
<130> 2022.04.21
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 480
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
acaatattgg aaaacataca tttcctcccc tccccatcat agtccctctg cttccgtgtt 60
aactccatag agaggccagc acaaccagcc ttgcagcctg agataaggcc tttggcgggt 120
gtctccccta tcgctccctc aagccctcaa gtaggtgttg gagagagggg tgatgcctgg 180
tgctggtgga acccctgcac agagacggac acaggatgag ctctaagtac ccgcggtctg 240
tccggcgctg cctgcccctc tgggccctaa cactggaagc agctctcatt ctcctcttct 300
atttttttac ccactatgac gcttccttag aggatcaaaa ggggctcgtg gcatcctatc 360
aaggtgagag ttcattggaa aagtggtcac aggagcaaat agcaggggca ggggcggggg 420
aggcctgtgg ttctccaggg gcacagatgt tcctttctac aaaatcccaa ggaaaaagat 480
<210> 2
<211> 540
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
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aggcctgtgg ttctccaggg gcacagatgt tcctttctac aaaatcccaa ggaaaaagat 540
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Home Sapiens
<400> 3
ctccatagag aggccagcac aa 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 4
gagaatgaga gctgcttcca gtc 23

Claims (2)

1.一种RhD血型基因RHD56C>G等位基因，其特征在于，该基因RHD56C＞G等位基因位点g.25272603C>G突变；所述g.25272603C>G突变是指突变位点在SEQ ID NO:1序列的第271位碱基C突变为G；其突变基因DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种用于检测RHD56C>G等位基因的特异性引物，其特征在于，该特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示，用于检测RHD56C>G等位基因。
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