CN116287321B - 一种与免疫性溶血性输血反应相关的h血型系统抗原缺失的snp位点、应用及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其是涉及一种与免疫性溶血性输血反应相关的H血型系统抗原缺失的SNP位点、应用及试剂。本发明在先证者的FUT1基因中发现了两个可导致氨基酸残基突变的新的SNP突变位点和一个同义SNP突变，其中两个新错义突变位点的组合可引发溶血性输血反应。经过单倍型测序确认其中c.575G>C突变和c.289G>A突变分别位于一对等位基因上会导致氨基酸残基置换。基于此，本发明提供有关SNP位点组合及其分子检测试剂，有助于明确个体的H血型基因型，辅助其红细胞抗原和血清抗体的鉴定，可进一步提高输血安全、加强预防输血引发的溶血性输血反应。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其是涉及一种与免疫性溶血性输血反应相关的H血型系统抗原缺失的SNP位点、应用及试剂。
背景技术
免疫性溶血性输血反应是由于抗原抗体复合物触发，并由免疫系统介导的一系列病理生理变化，严重情况下可危及受血者的生命。临床输血实践中，红细胞血型系统抗原与抗体反应是引起免疫性溶血性输血反应的主要原因。而其中的H血型系统是一个及其重要的血型系统，不仅其自身抗原抗体与溶血性输血反应相关，而且与人类最重要的红细胞血型系统ABO血型密切相关。在O型个体中，H抗原是终末抗原，而在A型和B型个体中，H抗原是A、B血型特异性糖链的前体物质。
H血型系统相关的基因为FUT1和FUT2基因。FUT1基因编码a-1,2-岩藻糖基转移酶，可催化L-岩藻糖连接到前体糖链上从而形成H抗原，当FUT1基因变异造成酶特性改变时，将无法或者减弱其催化能力，导致红细胞表面H抗原部分或完全缺失。而FUT2编码的岩藻糖基转移酶决定了分泌型H抗原物质的表达。因此FUT1和FUT2基因突变可引起红细胞和分泌液中H抗原物质不表达或弱表达的表型，进一步影响AB抗原的表达。ABH抗原的完全缺失被称为孟买表型，弱表达则被称为类孟买表型。中国人群中相对常见的是分泌型的类孟买表型。这种类型的表型通常是由于FUT1基因的突变引起的。类孟买表型具有较复杂的血清学表型，对该表型的不正确识别会导致该血型被错误地鉴定为O型，同时该表型个体的血清中除了ABO血型系统相关的抗体之外，通常还含有抗-H抗体，因此，错误的血型抗原抗体鉴定极易造成不适当的红细胞输注，从而引起严重的免疫性溶血性输血不良反应的发生，危及患者的生命。通过分子诊断技术可以有效的进行类孟买血型的确认，能够佐证补充血清学检验结果，对开展血型的精准检测和相容性输血具有重要临床意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，从类孟买表型的先证者出发，确定其FUT1基因上存在的SNP位点，并针对该SNP位点开发对应的检测试剂，期望能够用于明确其他待测个体的H血型基因型，从而提高输血的安全性。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供FUT1基因的SNP位点组合，所述SNP位点组合包括(a)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变和(b)FUT1基因编码区起始密码子起的第289位c.289G>A突变；野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述SNP位点(a)和SNP位点(b)分别位于同源染色体的一对等位基因上。
野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列为:
ATGTGGCTCCGGAGCCATCGTCAGCTCTGCCTGGCCTTCCTGCTAGTCTGTGTCCTCTCTGTAATCTTCTTCCTCCATATCCATCAAGACAGCTTTCCACATGGCCTAGGCCTGTCGATCCTGTGTCCAGACCGCCGCCTGGTGACACCCCCAGTGGCCATCTTCTGCCTGCCGGGTACTGCGATGGGCCCCAACGCCTCCTCTTCCTGTCCCCAGCACCCTGCTTCCCTCTCCGGCA CCTGGACTGTCTACCCCAATGGCCGGTTTGGTAATCAGATGGGACAGTATGCCACGCTGCTGGCTCTGGCCCAGCTCAACGGCCGCCGGGCCTTTATCCTGCCTGCCATGCATGCCGCCCTGGCCCCGGTATTCCGCATCACCCTGCCCGTGCTGGCCCCAGAAGTGGACAGCCGCACGCCGTGGCGGGAGCTGCAGCTTCACGACTGGATGTCGGAGGAGTACGCGGACTTGAGAGATCCTTTCCTGAAGCTCTCTGGCTTCCCCTGCTCTTGGACTTTCTTCCACCATCTCCGGGAACAGATCCGCAGAGAGTTCACCCTGCACGACCACCTTCGGGAAGAGGCGCAGAGTGTGCTGGGTCAGCTCCGCCTGGGCCGCACAGGGGACCGCCCGCGCACCTTTGTCGGCGTCCACGTGCGCCGTGGGGACTATCTGCAGGTTATGCCTCAGCGCTGGAAGGGTGTGGTGGGCGACAGCGCCTACCTCCGGCAGGCCATGGACTGGTTCCGGGCACGGCACGAAGCCCCCGTTTTCGTGGTCACCAGCAACGGCATGGAGTGGTGTAAAGAAAACATCGACACCTCCCAGGGCGATGTGACGTTTGCTGGCGATGGACAGGAGGCTACACCGTGGAAAGACTTTGCCCTGCTCACACAGTGCAACCACACCATTATGACCATTGGCACCTTCGGCTTCTGGGCTGCCTACCTGGCTGGCGGAGACACTGTCTACCTGGCCAACTTCACCCTGCCAGACTCTGAGTTCCTGAAGATCTTTAAGCCGGAGGCGGCCTTCCTGCCCGAGTGGGTGGGCATTAATGCAGACTTGTCTCCACTCTGGACATTGGCTAAGCCTTGA(SEQ ID No.1)。
第二方面，本发明提供FUT1基因的等位基因对，所述FUT1基因的等位基因对包括同源的第一FUT1基因的等位基因和第二FUT1基因的等位基因，所述第一FUT1基因的等位基因包括SNP位点(a)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变，所述第二FUT1基因的等位基因包括SNP位点(b)FUT1基因编码区起始密码子起的第289位c.289G>A突变；野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
第三方面，本发明提供了前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点组合或者FUT1基因的等位基因对在(a)或(b)中的应用：
(a)类孟买型血型鉴定；
(b)制备鉴定类孟买型血型试剂。
第四方面，本发明提供检测前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点组合的第一试剂，所述第一试剂包括c.575G>C突变的扩增引物对和c.289G>A突变的扩增引物对；
优选地，所述第一试剂还包括内参基因的扩增引物对；
优选地，所述内参基因包括G6PD基因、GAPDH基因或β-actin基因；
优选地，所述c.575G>C突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2(GGTATTCCGCATCACCCTG)和SEQ ID No.3(ACACTCTGCGCCTCTTCCG)所示；
优选地，所述c.289G>A突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4(GCCTTCCTGCTAGTCTGTGT)和SEQ ID No.5所示(TATACTGTCCCATCTGATTACC)；
优选地，所述G6PD基因的扩增引物对的正向扩增引物和反应扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6(TCTACCGCATCGACCACTAC)和SEQ ID No.7(ACCTTCTCATCACGGACGTC)所示。
第五方面，本发明提供检测前述实施方式所述FUT1基因的等位基因对的第二试剂，所述第二试剂包括FUT1基因的扩增引物对和测序引物对，所述FUT1基因的扩增引物对的扩增片段覆盖FUT1基因编码区起始密码子起的第575位和第289位；
优选地，所述FUT1基因的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.8(CCTGGGACTAAGGAGTGCTG)和SEQ ID No.9(CTCAACCTCTCTTCCCCCTG)所示；
优选地，所述FUT1基因的测序引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10(AGGAGTACGCGGACTTGAGA)、 SEQ ID No.11(AGTGCTGCACCCCAGGCGCC)、 SEQ ID No.12(TCCGACATCCAGTCGTGAAG)、和SEQ ID No.13(CAACTAGAATCACTCTGGAT)所示。
第六方面，本发明提供了前述实施方式所述第一试剂和/或前述实施方式所述第二试剂在类孟买型血型鉴定中的应用。
第七方面，本发明提供类孟买型血型鉴定试剂盒，所述类孟买型血型鉴定试剂盒包括前述实施方式所述第一试剂和/或前述实施方式所述第二试剂。
第八方面，本发明提供类孟买型血型鉴定方法，应用前述实施方式所述试剂盒对待测血样进行扩增，并进行单倍型分型测序，扩增产物中含有前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点组合，或者前述实施方式所述FUT1基因的等位基因对时，确定待测血样的H血型为类孟买型。
在可选的实施方式中，所述类孟买型血型鉴定方法包括，分别采用前述实施方式所述的第一试剂中的两对引物对对待测血样进行PCR-SSP检测，根据得到的对应扩增产物结果确定待测血样是否为前述实施方式所述SNP位点组合或前述实施方式所述等位基因对所导致的类孟买型；
优选地，两对引物对均未得到扩增产物时，确定待测血样不含有前述实施方式所述的SNP位点组合或前述实施方式所述的等位基因对。
在可选的实施方式中，所述类孟买型血型鉴定方法包括，采用前述实施方式所述的FUT1基因的扩增引物对对待测血样进行PCR扩增，而后采用前述实施方式所述的FUT1基因的测序引物对扩增产物进行测序，确定待测血样的H血型是否为类孟买型。
本发明在先证者的FUT1基因中发现了两个新的可导致氨基酸残基置换的SNP错义突变位点和一个SNP同义突变，该三个突变位点的组合可引发溶血性输血反应。经过单倍型测序确认其中c.575G>C错义突变和c.289G>A错义突变分别位于一对等位基因上，会导致氨基酸残基发生置换，另一个c.840G>A突变为同义突变。基于此，本发明提供有关SNP位点组合及其分子检测试剂，有助于明确个体的H血型基因型，辅助其红细胞抗原和血清抗体的鉴定，可进一步提高输血安全、加强预防输血引发的溶血性输血反应。
本发明还提供了前述SNP位点组合及等位基因对的快速检测方法，从而提供了一种有效的避免免疫性溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的SNP位点组合及检测引物可以有效的用于临床患者以及献血者外周血进行H血型类孟买型FUT1基因突变位点的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中先证者FUT1基因编码区包括第575位碱基、第840位碱基和第289位碱基的直接测序部分序列结果；
图2为本发明实施例2中先证者FUT1基因编码区包括第575位碱基、第840位碱基和第289位碱基的单倍体测序部分序列结果；
图3为本发明实施例3中血液检测样本FUT1基因575位突变PCR-SSP检测的电泳图；
图4为本发明实施例3中血液检测样本FUT1基因840位突变PCR-SSP检测的电泳图；
图5为本发明实施例3中血液检测样本FUT1基因289位突变PCR-SSP检测的电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在某次具体的实施方式中，第一方面，本发明提供FUT1基因的SNP位点组合，所述SNP位点组合包括(a)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变和(b)FUT1基因编码区起始密码子起的第289位c.289G>A突变；野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述SNP位点(a)和SNP位点(b)分别位于同源染色体的一对等位基因上。
上述两个碱基突变存在于一位H血型类孟买表型先证者的一对等位FUT1基因中，并证实了该等位基因对的突变是导致类孟买血型产生的原因，导致先证者红细胞H抗原缺失或减弱。H抗原物质作为AB抗原的前体物质，其表达缺失进一步影响其AB抗原的表达，导致该AB型患者与正常AB型个体相比较，其红细胞上A、B抗原缺失或减弱，并且血浆中产生同种抗H抗体。一旦输入任何H阳性的AB型或者O型正常血液，将会引发严重的免疫性溶血性输血反应。
其中FUT1基因，位于染色体19q13.33，包含4个外显子，编码区起始于第4外显子，可转录成大约1029bp的mRNA序列(NCBI登录号为NM_000148.3)，翻译形成343个氨基酸组成的岩藻糖基转移酶蛋白。
第二方面，本发明提供FUT1基因的等位基因对，所述FUT1基因的等位基因对包括同源的第一FUT1基因的等位基因和第二FUT1基因的等位基因，所述第一FUT1基因的等位基因包括SNP位点(a)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变，所述第二FUT1基因的等位基因包括SNP位点(b)FUT1基因编码区起始密码子起的第289位c.289G>A突变；野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
第三方面，本发明提供了前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点组合或者FUT1基因的等位基因对在(a)或(b)中的应用：
(a)类孟买型血型鉴定；
(b)制备鉴定类孟买型血型试剂。
第四方面，本发明提供检测前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点组合的第一试剂，所述第一试剂包括c.575G>C突变的扩增引物对和c.289G>A突变的扩增引物对；
优选地，所述第一试剂还包括内参基因的扩增引物对；
优选地，所述内参基因包括G6PD基因、GAPDH基因或β-actin基因；
优选地，所述c.575G>C突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2(GGTATTCCGCATCACCCTG)和SEQ ID No.3(ACACTCTGCGCCTCTTCCG)所示；
优选地，所述c.289G>A突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4(GCCTTCCTGCTAGTCTGTGT)和SEQ ID No.5所示(TATACTGTCCCATCTGATTACC)；
优选地，所述G6PD基因的扩增引物对的正向扩增引物和反应扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6(TCTACCGCATCGACCACTAC)和SEQ ID No.7(ACCTTCTCATCACGGACGTC)所示。
第五方面，本发明提供检测前述实施方式所述FUT1基因的等位基因对的第二试剂，所述第二试剂包括FUT1基因的扩增引物对和测序引物对，所述FUT1基因的扩增引物对的扩增片段覆盖FUT1基因编码区起始密码子起的第575位和第289位；
优选地，所述FUT1基因的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.8(CCTGGGACTAAGGAGTGCTG)和SEQ ID No.9(CTCAACCTCTCTTCCCCCTG)所示；
优选地，所述FUT1基因的测序引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10(AGGAGTACGCGGACTTGAGA)、 SEQ ID No.11(AGTGCTGCACCCCAGGCGCC)、 SEQ ID No.12(TCCGACATCCAGTCGTGAAG)、和SEQ ID No.13(CAACTAGAATCACTCTGGAT)所示。
第六方面，本发明提供了前述实施方式所述第一试剂和/或前述实施方式所述第二试剂在类孟买型血型鉴定中的应用。
第七方面，本发明提供类孟买型血型鉴定试剂盒，所述类孟买型血型鉴定试剂盒包括前述实施方式所述第一试剂和/或前述实施方式所述第二试剂。
第八方面，本发明提供类孟买型血型鉴定方法，应用前述实施方式所述试剂盒对待测血样进行扩增，并进行单倍型分型测序，扩增产物中含有前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点组合，或者前述实施方式所述FUT1基因的等位基因对时，确定待测血样的H血型为类孟买型。
在可选的实施方式中，所述类孟买型血型鉴定方法包括，分别采用前述实施方式所述的第一试剂中的两对引物对对待测血样进行PCR-SSP检测，根据得到的对应扩增产物结果确定待测血样是否为前述实施方式所述SNP位点组合或前述实施方式所述等位基因对所导致的类孟买型；
优选地，两对引物对均未得到扩增产物时，确定待测血样不含有前述实施方式所述的SNP位点组合或前述实施方式所述的等位基因对。
在可选的实施方式中，所述类孟买型鉴定方法包括，采用前述实施方式所述的FUT1基因的扩增引物对对待测血样进行PCR扩增，而后采用前述实施方式所述的FUT1基因的测序引物对对扩增产物进行测序，确定待测血样的H血型是否为类孟买型。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例采集一例无偿献血者，其ABO血型和H血型血清学疑似为类孟买表型的先证者进行FUT1基因检测确认其H血型系统基因的突变位点，采用PCR-SBT的基因分型方法，具体包括以下步骤：
(1)制备人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板
在取样先证者知情同意的基础上，取待检全血200μl，按照Pre-Filled CartridgeReagent试剂盒(货号：101@S4100-22157，RBC Bioscience)说明书提取基因组DNA并测定基因组DNA的浓度和纯度。
合成2条FUT1扩增引物和4条测序引物，具体引物序列如SEQ ID No.8～13所示，将扩增引物用纯水稀释至50μmol/L。
(2)PCR扩增直接测序法寻找先证者类孟买型FUT1基因的突变位点准备LA Taq酶(货号：RR02MQ，TaKaRa)、RNase-free H2O，与步骤(1)所制备的PCR扩增模板，按下表1配制PCR反应体系。
表1扩增反应体系
扩增条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，扩增产物4℃保温。PCR扩增结束后，将检测样本所扩增片段各取2μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段的特异性。
扩增产物采用1μl虾碱性磷酸酶(货号：55953500，Roche)和2μl核酸外切酶Ⅰ(货号：AL21979A，TaKaRa)在37℃条件下进行30min酶切反应，80℃下15min酶失活。
将纯化之后的PCR产物加入20μl纯水稀释，混匀，将4条寡核苷酸测序引物(核苷酸序列如SEQ ID No.10～SEQ ID No.13所示)用纯水稀释至浓度为3.2μmol/L，以BigDyeterminator v3.1 sequencing kit(货号：4336699，ABI公司)进行测序反应。应用4条测序引物进行测序。在先证者中发现H血型FUT1基因编码区域由起始密码子起第575位碱基发生了杂合性突变，结果如图1所示，其中红色框选标识的为先证者FUT1基因编码区域由起始密码子起第575位碱基G/C杂合突变和第840位碱基G/A杂合突变。同时编码区域由起始密码子起第289位碱基发生了杂合性突变，结果如图2所示，其中红色框选标识的为先证者FUT1基因编码区域由起始密码子起第289位碱基G/A杂合突变。
并且经过多次测序结果均表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引起的。由此得到可用于H血型系统的类孟买型检测的SNP位点。
实施例2
本实施例对FUT1基因编码区的序列进行单倍型分型测序，确定实施例1中先证者基因突变位点的单倍体序列。
将实施例1得到的PCR产物利用TOPO TA Cloning Kit For Sequencing试剂盒(货号：45-0030，Invitrogen by life technologies)通过TA克隆连接入载体中，转染到感受态细胞中。利用氨苄青霉素筛选，挑取多个阳性菌落利用质粒抽提试剂盒(货号：B518162-0100，上海生工)提取质粒DNA。质粒DNA进行测序反应之后，在ABI 3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测定，单倍型测序引物和试剂盒使用实施例1所述的测序引物和试剂盒。所测序结果利用SeqScape V2.5软件进行序列比对，确定FUT1基因的单倍体序列，发现c.575G＞C和c.840G＞A位于同一条单倍体序列上，而c.289G>A突变位于另一条单倍体序列上，结果如图2所示。两个错义突变c.575G＞C和c.289G>A均为新发现突变，均不存在于单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)。而三个突变所形成的新等位基因仍未被收录于国际输血协会(ISBT)血型基因突变库(ISBT 018H(FUT1FUT2)bloodgroup alleles v6.0 30-JUN-2022)，表明由这三个突变组成的等位基因为FUT1基因的一种新的等位基因对。FUT1基因由起始密码子起的c.575G＞C突变，导致了第192位氨基酸由精氨酸变为脯氨酸；c.840G＞A突变为同义突变，不引起氨基酸的改变；c.289G>A突变导致了第97位氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸。
目前可以确定的是，上述两个新突变分布于一对同源染色体的两个等位基因中，能够导致编码H血型系统FUT1基因编码的岩藻糖基转移酶氨基酸发生置换，引起了此类孟买表型个体H抗原表位发生缺失，进一步导致A、B抗原表达的缺失，同时这种个体血浆中能够产生抗-H抗体与抗A、抗B抗体，当输注不配合血液时就会发生免疫性溶血性输血反应，从而危及受血者生命。根据SNP位点突变导致的氨基酸残基的改变能够推断的是，当发生FUT1基因由起始密码子起的c.575G＞C突变和c.289G>A突变时，应当能够导致H抗原的缺失，进一步引起A、B抗原表达的缺失。但当仅发生FUT1基因由起始密码子起的c.840G＞A突变时，由于其为同义突变，其突变结果是否会导致A、B、H抗原表达的缺失，还有待进一步验证。
通过上述的分析，证明可以通过检测本发明发现的FUT1基因的SNP位点来检测个体H血型基因是否发生突变，从而确定个体是否为罕见的类孟买型，是否存在潜在的发生免疫性溶血性输血反应的危险以及用于筛选相应的类孟买型供者，为患者寻找匹配的配合性血液。
实施例3
本实施例利用实施例1得到的三个SNP位点，进行PCR-SSP检测，验证将两个SNP位点作为标志物进行类孟买血型鉴定的可行性，具体包括以下步骤：
(1)制备人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板。
在符合国家相关政策规定，并在取样先证者知情同意的基础上，取待检全血200μl，按照Pre-Filled Cartridge Reagent试剂盒(货号：101@S4100-22157，RBCBioscience)说明书提取基因组DNA并测定基因组DNA的浓度和纯度，将DNA浓度稀释至30ng/μl。
(2)合成6条FUT1基因对应SNP位点的特异性扩增引物和2条内参对照的G6PD扩增引物，具体引物序列如表2所示，见发明内容和序列表中的基因序列，将扩增引物用纯水稀释至10μmol/L。
表2PCR-SSP检测所用引物序列
(3)PCR-SSP扩增检测该类先证者类孟买型FUT1基因的突变位点
准备Multiplex PCR Assay Kit Ver.2试剂(货号：RR062A，TaKaRa)、RNase-freeH2O，与步骤(1)所制备的PCR扩增模板，按下表3配制PCR反应体系。
表3扩增体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| 2×buffer | 10 |
| RNase-free H2O | 补足至20 |
| FUT-575F(FUT-289F或FUT-840F) | 0.2 |
| FUT-575R(FUT-289R或FUT-840R) | 0.2 |
| G6PD-F | 0.15 |
| G6PD-R | 0.15 |
| DNA模板 | 1.6 |
| Multiplex PCR Enzyme Mix | 0.1 |
| 总体积 | 20 |
上述PCR反应体系混匀后，在美国ABI公司的PCR仪(ABI9700)上按以下程序进行扩增：94℃预变性1min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，60℃退火30s，扩增引物结合到模板上，72℃延伸30s，延长所需扩增片段，反应30个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸。然后冷却至12℃。
PCR扩增结束后，将检测样本所扩增片段各取2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，定性确定目的扩增片段是否存在。结果显示了检测样本是否存在SNP突变位点。图3～5分别为本发明的血液检测样本进行FUT1基因575位突变、840位突变和289位突变检测的电泳图。图3中泳道1为DL2000的DNA分子marker，泳道2～8为野生型575核苷酸位点PCR-SSP检测，扩增结果为阴性；泳道9为突变型575核苷酸位点PCR-SSP检测结果，扩增结果为阳性。
图4中泳道1为DL2000的DNA分子marker，泳道2～8为野生型840核苷酸位点PCR-SSP检测，扩增结果为阴性；泳道9为突变型840核苷酸位点PCR-SSP检测结果，扩增结果为阳性。所有样本均以G6PD基因作为内参。
图5中泳道1为DL2000的DNA分子marker，泳道2～8为野生型289核苷酸位点PCR-SSP检测，扩增结果为阴性；泳道9为突变型289核苷酸位点PCR-SSP检测结果，扩增结果为阳性。所有样本均以G6PD基因作为内参。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.检测FUT1基因的SNP位点组合的第一试剂，其特征在于，所述SNP位点组合包括(a)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变和(b)FUT1基因编码区起始密码子起的第289位c.289G>A突变；野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SNP位点(a)和SNP位点(b)分别位于同源染色体的一对等位基因上；
所述第一试剂包括c.575G>C突变的扩增引物对和c.289G>A突变的扩增引物对；所述c.575G>C突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示；所述c.289G>A突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。
2.根据权利要求1所述的第一试剂，其特征在于，所述第一试剂还包括内参基因的扩增引物对。
3.根据权利要求2所述的第一试剂，其特征在于，所述内参基因包括G6PD基因、GAPDH基因或β-actin基因。
4.根据权利要求3所述的第一试剂，其特征在于，所述G6PD基因的扩增引物对的正向扩增引物和反应扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。
5.权利要求1所述第一试剂在类孟买型鉴定中的应用。
6.类孟买型血型鉴定试剂盒，其特征在于，所述类孟买型血型鉴定试剂盒包括权利要求1～4任一项所述第一试剂。
7.类孟买型血型鉴定方法，其特征在于，应用权利要求6所述试剂盒对待测血样进行扩增，并进行单倍型分型测序，扩增产物中含有权利要求1中所述FUT1基因的SNP位点组合，确定待测血样的H血型为类孟买型。
8.根据权利要求7所述的类孟买型血型鉴定方法，其特征在于，所述类孟买血型鉴定方法包括，分别采用权利要求1～4任一项所述的第一试剂中的两对引物对对待测血样进行PCR-SSP检测，根据得到的对应扩增产物结果确定待测血样是否为权利要求1中所述SNP位点组合所导致的类孟买型。
9.根据权利要求8所述的类孟买型血型鉴定方法，其特征在于，两对引物对均未得到扩增产物时，确定待测血样不含有权利要求1中所述的SNP位点组合。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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