CN112063704B - 一种与abo血型系统中a变异型相关的snp位点 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种用于检测ABO血型系统A型变异型的SNP位点，新的A型变异型基因编码区域由起始密码子起第792至794位缺失CTA碱基。本发明提供了一种新的A型变异型基因，从而完善了ABO基因库，提供了一种快速基因诊断、基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的应用于献血员和临床患者外周血进行新的A型变异型基因突变位点的快速检测。

Description

一种与ABO血型系统中A变异型相关的SNP位点
技术领域
本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种用于检测ABO血型系统中A基因突变的SNP位点。
发明背景
ABO血型系统是由奥地利病理学家、免疫学家Karl Landsteiner在1900年发现并命名的人类第一个血型系统，也是目前为止最为重要的血型系统，在临床输血、新生儿溶血病中占有重要地位。ABO血型系统是根据红细胞表面特异性抗原(凝集原)A、B的分布把红细胞分为A、B、AB和O四型。进一步，1924年德国学者F.Bernstein证明ABO血型分别为三个复等位基因所控制，在ABO抗原的生物合成中A、B、O三个等位基因控制着A、B抗原的形成。
目前各地血液中心或临床输血科对献血员和患者均采用血清学实验进行ABO血型鉴定，但血清学实验会受到疾病、药物或者个体情况的干扰，比如肿瘤、白血病等某些疾病会影响血型抗原从而导致正定型不准确；而血清中自身抗体或不规则抗体的干扰，会干扰反定型导致定型困难甚至定型错误。近几年来,ABO基因分型技术克服了血型血清学方法的限制,已是一种比较独立简便的分型方法,为临床解决了一些疑难血型鉴定问题,得到广泛应用。ABO亚型、血型抗原反应减弱、抗体消失、获得性B、Cis-AB、类孟买型、血型嵌合体等正反定型不符的样本,使用DNA分型技术后迎刃而解,在一些情况下可以不必做繁杂的一系列血清学试验。但基因分型技术也有其局限性，因DNA分析一般是检测特定位置的SNP，若在该基因的其它位置存在未知SNP，可能会导致编码抗原不表达，在该SNP纯合子时将产生无效型表型，这时的基因分型结果可能被错误的鉴定为抗原阳性。对于供者来说，假阳性结果意味着将错失有价值的抗原阴性血液，但不会危及受血者。但是对于患者，将无效型表型误定为抗原阳性，接受阳性血液输注可能产生抗体。因此，对SNP位点的充分发掘和完善对基因分型技术的广泛应用提供了安全保障。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测ABO血型系统中A型变异型基因突变的SNP位点，可以完善ABO基因库的数据，从而弥补现有技术的不足。
申请人对一个呈常染色体9q34.1-9q34.2遗传的变异型血型基因家系成员进行测序，找到了该家系成员A型变异型基因存在遗传上的突变，造成了A抗原数量和质量的改变，并且可以通过免疫刺激产生抗-A1抗体，为了避免其通过输血造成急性溶血性输血反应，从而促成了本发明。
本发明首先提供一种与ABO血型系统中A型变异型基因突变相关的SNP位点，为ABO血型基因(NCBI Reference Sequence:NM_020469.3)编码区ATG起始第792位到794位，缺失CTA 3个碱基。
本发明还提供所述的SNP位点的应用，是用于制备用于检测红细胞ABO血型的制品；
本发明的另一个方面提供一种用于检测红细胞ABO血型的制品，所述的制品是用于检测上述的SNP位点；
所述的制品为PCR扩增测序试剂盒，其中包含有检测上述SNP位点的直扩增引物；
其中扩增引物的序列信息如下：
ABO-E7F:5'-AGGAGAACGTGGTGCATCTG-3'SEQ ID NO:1
ABO-E7R:5'-TGTGATTTGAGGTGGGGAC-3'SEQ ID NO:2
所述的制品为单倍型扩增及测序试剂盒，其中用于检测上述SNP位点单倍型扩增及测序引物信息如下：
ABO-E6mo：5'-ATGTGGGTGGCACCCTGC-3'SEQ ID NO:3
ABO-E7mo：5'-ATTTGAGGTGGGGACGGGG-3'SEQ ID NO:4。
本发明通过检测筛选获得的SNP位点，从而提供了一种有效的进行ABO血型基因诊断途径，完善了ABO基因数据库，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行ABO血型A型变异型基因突变位点的快速检测。
附图说明
图1：先证者ABO基因Exon7 PCR产物直接测序结果图，采用ABO-E7R引物对PCR产物进行测序，黑色箭头指向双峰起始位点，提示其中一条链有碱基缺失。蓝色箭头所指为796C>A和803G>C突变，符合另一条DNA链ABO*B.01基因特征。
图2：先证者ABO基因Exon7克隆测序结果图，将PCR产物进行克隆，挑取单克隆测序，测序结果与ABO*O01.01.01进行序列分析比较，黑色箭头指向先证者Exon 7的CTA缺失，结合直接测序结果，证实O基因在792bp至794bp(从ATG起始)缺失CTA 3个碱基。
具体实施方式
申请人在一个ABO血型A亚型家系中进行DNA测序时，发现一例新的SNP突变导致A型变异型基因。
ABO基因位于染色体9q34.1-9q34.2，可转录成1065bp的mRNA(NCBI登录号为NM_020469.2)，直接翻译形成355个氨基酸组成的蛋白质。
对于本发明所涉及SNP标记(single nucleotide polymorphism，SNP，即单核苷酸多态性)是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：SNP标记的筛选
1、提取外周血基因组DNA：
在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取A型变异型基因家系成员外周静脉血2-5mL，放入EDTA-Na2抗凝管内，-80℃冻存备用；DNA提取使用LIFE公司的DNA提取试剂盒，具体操作流程如下：
冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，加入等体积的红细胞裂解液(pH 8.0)，涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。重复加入红细胞裂解液500μL涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。
沉淀物涡旋混匀5分钟，加入核裂解液50μL，涡旋混匀5分钟，置于56℃金属浴15分钟。从水浴中取出样品，加入蛋白清除液135μL。涡旋充分混匀，至于4℃30分钟。
室温下12000rpm离心5分钟，吸取上清液(约200μl)至一新离心管中。加入冰乙醇500μL，反复震荡离心管，直至白色DNA沉淀物析出。室温12000rpm离心2分钟，弃上清。向DNA沉淀加入75％乙醇，漂洗一次，室温12000rpm离心3分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。
对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。
2、直接测序法寻找先证者A变异型基因的突变位点
PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：
(1)PCR反应条件：95℃预变性10分钟；94℃60秒，63℃90秒，72℃60秒，10个循环；94℃60秒，61℃90秒，72℃60秒，25个循环；72℃延伸10min，扩增产物10℃保温。
(2)反应体系：(TAKARA Ex-Taq polymerase)
应用该反应体系进行先证者的基因组DNA模板与上述ABO-E7F、ABO-E7R引物的扩增反应。
PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中应用引物对ABO-E7F:5'-AGGAGAACGTGGTGCATCTG-3'；ABO-E7R:5'-TGTGATTTGAGGTGGGGAC-3'在先证者发现ABO血型基因第七外显子第792位(ATG起始)前存在双峰(使用ABO-E7R测序)(图1)，提示该先证者双链DNA中有一条链存在碱基缺失。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。
3、对ABO基因第7外显子及第6内含子进行单倍型测序，确定先证者O变异型基因的突变位点；
PCR扩增目的片段引物：
ABO-E6mo：5'-ATGTGGGTGGCACCCTGC-3'；
ABO-E7mo：5'-ATTTGAGGTGGGGACGGGG-3'。
PCR扩增引物也可以选用其它能扩增上述SNP位点的引物对。
PCR扩增目的片段的反应条件与反应体系：
(1)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃50秒，40个循环；72℃延伸5min，扩增产物10℃保温。
(2)反应体系：(TAKARA LA-Taq polymerase)
应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与发明者设计的克隆测序引物进行扩增反应。将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用如下引物：
ABO-E6mo：5'-ATGTGGGTGGCACCCTGC-3'；ABO-E7mo：5'-ATTTGAGGTGGGGACGGGG-3'(测序引物也可以选用从A型变异基因上设计的，能扩增SNP位点的其它引物)得到单倍型序列，与NCBI参考序列(NM_020469.3)进行比较，发现在第七外显子第792位到794位缺失CTA共3个碱基(图2)，该突变为一新发现突变。该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见，而在近300例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
在青岛市中心血站输血医学研究所收集的先证者家系成员，提取他们的外周血基因组DNA，应用上述DNA作为模板与ABO-E7F、ABO-E7R引物进行PCR目的片段的扩增，常规Sanger测序法应用上述引物对PCR产物进行直接测序，发现该先证者的两名家系成员的ABO血型A基因存在本发明中发现的SNP突变，即编码区域由起始密码子起第792至794位删失CTA碱基。继续对发现SNP突变的两位家系成员进行ABO基因第6,7外显子及第6内含子的单倍型测序，应用上述提取的两名家系成员的基因组DNA作为模板与ABO-E6mo、ABO-E7mo引物进行PCR目的片段的扩增，将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用上述引物，确定样本的单倍型序列均存在起始密码子起第792至794位CTA碱基缺失。
通过上述的分析，证明该SNP位点能够精准的确定待测者的ABO血型，对于基因确定ABO血型提供了更加准确的数据背景，对患者制定输血政策具有重要意义。
序列表
<110> 青岛市中心血站
<120> 一种与ABO血型系统中A变异型相关的SNP位点
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggagaacgt ggtgcatctg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtgatttga ggtggggac 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtgggtgg caccctgc 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atttgaggtg gggacgggg 19

Claims (3)

1.检测SNP位点的引物对在制备试剂盒中的应用，所述的试剂盒用于检测红细胞ABO血型系统中A基因突变，其特征在于，所述的SNP位点位于NCBI登录号为NM_020469.2的ABO血型基因编码区ATG起始第792位到794位；缺失CTA 3个碱基。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒为PCR扩增测序试剂盒，其中引物对的序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒为单倍型扩增及测序试剂盒，其中引物对的序列为SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4。
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