CN110527723B

CN110527723B - 一种与急性溶血性输血反应相关的snp标记

Info

Publication number: CN110527723B
Application number: CN201910876096.0A
Authority: CN
Inventors: 迟晓云; 刘丽; 韩斌; 曲雅慧; 冯智慧
Original assignee: Qingdao Blood Center
Current assignee: Qingdao Blood Center
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2039-09-17
Also published as: CN110527723A

Abstract

本发明的目的是提供一种用于检测ABO血型系统A型变异型引发的急性溶血性输血反应的SNP位点，为新的A型变异型基因编码区域由起始密码子起第467、499、527和1061位碱基。本发明提供了A型变异型基因的新的用途，从而提供了一种有效的对能够引发急性血管内溶血性输血反应的快速基因诊断、基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行新的A型变异型基因突变位点的快速检测。

Description

一种与急性溶血性输血反应相关的SNP标记

技术领域

本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种用于检测ABO血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶血性输血反应的SNP位点。

发明背景

急性溶血性输血反应(Acute Hemolytic Transfusion Reaction；AHTR)一般在输血后24h内发生，多于输血后立即发生，是最严重的输血副反应，一旦发生需立即抢救，否则致死率很高。只要输入5～10ml ABO不相容血液即可出现明显症状；输血量超过200ml，将会造成严重后果。临床上常表现为血管内溶血，患者有发热、寒战、恶心、背痛，随后出现血红蛋白尿，血红蛋白血症，低血压休克，均应考虑为急性血管内溶血性输血反应，应迅速停止输血并进行各项检查。同时这一过程会引起补体激活，启动凝血系统，释放缓激肽和儿茶酚胺，诱发DIC；甚至发生循环与肾功能衰竭；因此通常把低血压休克、DIC、急性肾衰竭称为急性血管内溶血三联症。

无论是在国内或是国外，ABO血型的错误输注是引起急性溶血性输血反应最为常见的因素，根据美国FDA报告，急性溶血反应死亡159例中139例是ABO血型不合的输血所致。针对此种情况，必须强调预防的重要性。因此，在进行临床患者ABO血型鉴定时，需要进行正反定型，只有正反定型相符才能确定患者的ABO血型。往往由于基因突变导致A抗原表达不完全以致难以检测到，而A抗体表达却往往为阳性，使得A变异型极易漏检，从而容易导致血型误判而输注不配合的血液或者输注给不配合的患者，产生急性或迟发性免疫性溶血反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测ABO血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶血性输血反应的SNP位点，从而弥补现有技术的不足。

申请人对一个呈常染色体9q34.1-9q34.2显性遗传的A型变异型血型基因的家系成员进行了测序，找到了该家系成员A型变异型基因存在遗传上的致病突变，造成了A抗原数量和表达的改变，反定型却可检测到A抗体的表达，因此极易导致A抗原漏检。

本发明提供一种用于检测ABO血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶血性输血反应的SNP位点，为ABO血型基因编码区域由起始密码子起第467、499、527和1061位碱基，其中第467位碱基出现CT杂合、第499位碱基出现AG杂合、第527位碱基出现AG杂合序列、第1061位碱基出现C碱基缺失；

其中用于检测上述SNP位点的直接扩增及测序引物信息如下：

ABO-E7F:5'-CGTCCGCCTGCCTTGCA-3'SEQ ID NO:1

ABO-E7R:5'-CAAAGGAAACAGAGTTTACCCGTT-3'SEQ ID NO:2

用于检测上述SNP位点单倍型扩增及测序引物信息如下：

ABO-E6mo：5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3'SEQ ID NO:3

ABO-E7mo：5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'SEQ ID NO:4

本发明提供了ABO血型A型变异型基因检测的新用途，从而提供了一种有效的避免急性溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行ABO血型A型变异型基因突变位点的快速检测。

附图说明

图1，图3，图5，图7是ABO血型A型变异型基因先证者ABO基因突变位点正常A型参考序列，参比序列来源于BGMUT(国际血型基因突变库)；

图2，图4，图6，图8是先证者克隆测序图，先证者ABO基因编码区域由起始密码子起第467、499、527和1061位碱基发生了突变(nt467C＞T、nt499G＞A、nt527G＞A、nt1061delC)。

具体实施方式

申请人在一个ABO血型A型变异型基因家系中发现A型变异型基因的突变位点，并证实该基因的突变导致A型血型发生变异，导致A抗原漏检，如输注不配合的血液会引发急性溶血性输血反应的致病基因。

A变异型位于染色体9q34.1-9q34.2，可转录成1065bp的mRNA(NCBI登录号为NM_020469.2)，直接翻译形成355个氨基酸组成的蛋白质。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：从ABO血型A型变异型基因先证者基因检测确认A型变异型的突变位点。

1、提取外周血基因组DNA：

在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取ABO血型A型变异型基因家系成员外周静脉血2-5ml，放入EDTA-Na₂抗凝管内，-80℃冻存备用；DNA提取使用LIFE公司的DNA提取试剂盒，具体操作流程如下：

冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500ul放于离心管，加入等体积的红细胞裂解液(pH8.0)，涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。重复加入红细胞裂解液500ul涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。

沉淀物涡旋混匀5分钟，加入核裂解液50ul，涡旋混匀5分钟，置于56℃金属浴15分钟。从水浴中取出样品，加入蛋白清除液135ul。涡旋充分混匀，置于4℃30分钟。

室温下12000rpm离心5分钟，吸取上清液(约200ul)至一新离心管中。加入冰乙醇500ul，反复震荡离心管，直至白色DNA沉淀物析出。室温12000rpm离心2分钟，弃上清。向DNA沉淀加入75％乙醇，漂洗一次，室温12000rpm离心3分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。

对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。

2、直接测序法寻找先证者A变异型基因的突变位点

PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：

(1)PCR反应条件：95℃预变性10分钟；94℃60秒，63℃90秒，72℃60秒，10个循环；94℃60秒，61℃90秒，72℃60秒，25个循环；72℃延伸10min，扩增产物10℃保温。

(2)反应体系：(TAKARA Ex-Taq polymerase)

应用该反应体系进行先证者的基因组DNA模板与上述ABO-E7F、ABO-E7R引物的扩增反应。

PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中应用引物对ABO-E7F:5'-CGTCCGCCTGCCTTGCA-3'；ABO-E7R:5'-CAAAGGAAACAGAGTTTACCCGTT-3'在先证者发现ABO血型A基因编码区域由起始密码子起第467、499、527和1061位碱基发生了突变。其中第467位碱基出现CT杂合、第499位碱基出现AG杂合、第527位碱基出现AG杂合序列、第1061位碱基出现C碱基缺失。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引起的。

3、对ABO基因第6,7外显子及第6内含子进行单倍型测序，确定先证者A变异型基因的突变位点

PCR扩增目的片段引物：

ABO-E6mo：5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3'；

ABO-E7mo：5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'。

PCR扩增引物也可以选用其它能扩增上述SNP位点的引物对。

PCR扩增目的片段的反应条件与反应体系：

(1)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃50秒，40个循环；72℃延伸5min，扩增产物10℃保温。

(2)反应体系：(TAKARALA-Taq polymerase)

应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与发明者设计的克隆测序的引物进行扩增反应。将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用

ABO-E6mo：5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3'；

ABO-E7mo：5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'

(测序引物也可以选用从A型变异基因上设计的，能扩增SNP位点的其它引物)确定样本的单倍型序列(图2，4，6，8)。该突变为一新发现突变。该突变不存在于下面的三个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，血型基因突变库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.fcgi？cmd＝bgmut/systems_info&system＝abo)，表明该突变非常罕见，该突变导致了编码A血型的蛋白组成的核苷酸发生改变，A基因编码区域由起始密码子起第467位碱基由C＞T，导致了第156位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸；第499位碱基由G＞A,导致了第167位氨基酸由甘氨酸变为丝氨酸；第527位碱基由G＞A,导致了第176位氨基酸由精氨酸变为组氨酸；第1061位C碱基缺失,导致了第354位氨基酸由脯氨酸变为精氨酸；氨基酸的突变引起了此A变异型的个体A抗原表位发生缺失，同时这种个体血浆中能够产生抗-A抗体(天然免疫)，当输注因A抗原漏检导致的不配合血液时就会发生急性溶血性输血反应，从而危及输血者生命。而在近300例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

在青岛市中心血站输血医学研究所收集的先证者家系成员，提取他们的外周血基因组DNA，应用上述DNA作为模板与ABO-E7F、ABO-E7R引物进行PCR目的片段的扩增，常规Sanger测序法应用上述这对引物对PCR产物进行直接测序，发现该先证者的两名家系成员的ABO血型A基因存在本发明中发现的SNP突变，即编码区域由起始密码子起第467位碱基出现CT杂合、第499位碱基出现AG杂合、第527位碱基出现AG杂合序列、第1061位碱基出现C碱基缺失。继续对发现SNP突变的两位家系成员进行ABO基因第6,7外显子及第6内含子的单倍型测序，应用上述提取的两名家系成员的基因组DNA作为模板与ABO-E6mo、ABO-E7mo引物进行PCR目的片段的扩增，将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用上述引物，确定样本的单倍型序列。单倍型测序发现，两位家系成员A基因编码区域由起始密码子起第467位碱基由C＞T,导致了第156位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸；第499位碱基由G＞A,导致了第167位氨基酸由甘氨酸变为丝氨酸；第527位碱基由G＞A，导致了第176位氨基酸由精氨酸变为组氨酸；第1061位C碱基缺失，导致了第354位氨基酸由脯氨酸变为精氨酸，与先证者完全一致，而且这两名家系个体血浆中都存在抗-A抗体。

通过上述的分析，证明发明者设计的引物可以用来检测个体ABO血型基因是否发生A基因突变，从而有潜在的发生输血后急性输血型溶血反应的危险。

序列表

<110> 青岛市中心血站

<120> 一种与急性溶血性输血反应相关的SNP标记

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtccgcctg ccttgca 17

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caaaggaaac agagtttacc cgtt 24

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatccat gtgggtggca ccctgcca 28

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggcctaggc ttcagttact c 21

Claims

1.用于检测ABO血型A变异型引发的急性溶血性输血反应的SNP位点的试剂的应用，其特征在于，所述的应用是在制备用于检测ABO血型中A变异型基因相关制品中的应用；

所述的SNP位点为A型变异型基因编码区域由起始密码子起第467、499、527和1061位碱基；其中第467位碱基出现CT杂合、第499位碱基出现AG杂合、第527位碱基出现AG杂合序列、第1061位碱基出现C碱基缺失。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测ABO血型A变异型引发的急性溶血性输血反应的SNP位点的试剂为用于PCR目的片段扩增及直接测序的引物对或用于单倍型PCR目的片段扩增及单倍型测序的引物对。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的引物对的序列为SEQ ID NO:1和SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。