CN111549122A - 一种用于检测急性溶血性输血反应的snp位点 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种ABO血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶血性输血反应的SNP位点,通过检测该SNP位点能够确定是否有急性溶血性输血反应危险。本发明所提供的用于检测ABO血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶血性输血反应的SNP位点,为ABO血型基因编码区域由起始密码子起第467位碱基,为C>T的突变;第963位碱基与第964位碱基之间插入1个C。本发明筛选获得了一种ABO血型A型变异型基因的SNP位点,可用于急性溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查。检测结果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行ABO血型A型变异型基因突变位点的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于基因诊断制品技术领域,具体涉及一种用于检测ABO血型系统 中A型变异型血型基因引发的急性溶血性输血反应的SNP位点。
发明背景
ABO血型对临床输血与器官移植有着最重要的意义,ABO血型不相容输 血,几乎毫无例外要发生溶血性输血反应,因此受血者和供血者的ABO相合性 是输血安全的前提。
在实际工作中,我们经常会遇到ABO血型鉴定困难,也就是ABO血型鉴 定时,出现血型正反定不符的情况。而引起ABO疑难血型原因很多,生理性及 病理性原因均可引起患者ABO正反定型不符,造成血型定型困难。目前实际操 作中,人们更关注的是生理因素中ABO亚型引起的正反定型不符。
ABO亚型的漏检,一方面会引起溶血性输血反应,根据美国FDA报告,急 性溶血反应的159死亡例中,139例是ABO血型不合的输血所导致的急性溶血 性输血反应。
急性溶血性输血反应会伴随一些典型的临床表现,例如发热、寒战、胸腹 痛、呼吸短促、心动过速、低血压和血红蛋白尿/胆红素尿等;严重的会出现进 行性肾衰,弥散性血管内凝血甚至死亡。
其中A变异型(A2变异型最为常见)是常见的ABO亚型,患者因免疫性 因素(输血、妊娠或流产)产生抗A1抗体,如果再次输入A1型血液就造成急 性或迟发性免疫性溶血反应;而针对此种情况,必须强调预防的重要性。
A型变异型血型在新生儿溶血病诊断及产前检查中也具有重要意义。A型变 异型孕妇孕育了非同型或非O型胎儿时,如果血清中存在IgG抗-A,会导致胎 儿发生新生儿溶血病。所以正确地判定A型变异型尤为重要。
目前对于A型变异型的判定可以依据血清学试验,其次采用家系调查的方 法,观察弱抗原在家系中传递情况,有时便可推测弱抗原的性质,对鉴定变异 型也有一定帮助。
近年来,基因分型技术已形成一种比较独立简便的分型方法,为确保临床 配血及安全输血提供有力的保障。目前国外各实验室使用的系统基因分型方法 以及文献报道的分型技术各不相同,主要的方法有PCR-SSP,PCR-RFLP, PCR-限制性内切酶内切法、PCR-测序法等。这些分型方法各具优缺点。由于血 清学方法的局限性,许多变异型在血清学分型中可能被误判。
发明内容
本发明的目的是提供一种ABO血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶 血性输血反应的SNP位点,通过检测该SNP位点能够确定是否有急性溶血性 输血反应危险。
申请人对一个呈常染色体9q34.1-9q34.2显性遗传的A型变异型血型基因 的家系成员进行了测序,找到了该家系成员A型变异型基因存在遗传上的致病 突变,该突变造成了A抗原数量和质量的改变,并且可以通过免疫刺激产生抗 -A1抗体,输注A型血会造成急性溶血性输血反应;即使此类个体血清中不含 有抗-A1抗体,如果他们作为献血者,具有引起受血者产生同种免疫的可能性。
本发明所提供的用于检测ABO血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶 血性输血反应的SNP位点,为ABO血型基因编码区域由起始密码子起第467 位碱基,为C>T的突变;第963位碱基与第964位碱基之间插入1个C。
本发明还提供用于检测上述SNP位点的制剂,所述的制剂为直接扩增及测 序引物或单倍型扩增及测序引物;
所述的直接扩增及测序引物,其序列信息如下:
ABO-E7F:5'-CCGCCTGCCTTGCAGATA-3'SEQ ID NO:1
ABO-E7R:5'-TTTACCCGTTCTGCTAAAACCAA-3'SEQ ID NO:2
所述的单倍型扩增及测序引物信息如下:
ABO-E6mo:5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3'SEQ ID NO:3
ABO-E7mo:5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'SEQ ID NO:4;
所提供的检测上述SNP位点的制剂在制备用于检测急性或者迟发性溶血性 输血反应的制品中的应用;所述的制品,优选为分子检测试剂盒。
本发明筛选获得了一种ABO血型A型变异型基因的SNP位点,可用于急 性溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查。检测结果表明本发明所提 供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行ABO血 型A型变异型基因突变位点的快速检测。
附图说明
图1:ABO血型A型变异型基因先证者ABO基因突变位点测序图,其中 正常A型参考序列、参比序列来源于BGMUT(国际血型基因突变库);
图2:先证者直接测序图;
图3:先证者克隆测序图,先证者ABO基因编码区域由起始密码子起第467 位碱基发生了突变、第963位碱基和964位碱基之间插入一个C(nt467C>T; nt963insC964)。
具体实施方式
申请人在一个ABO血型A型变异型基因家系中发现A型变异型基因的突 变位点,并证实该基因的突变是导致A型血型发生变异产生同种抗-A1抗体从 而引发急性溶血性输血反应的致病基因,从而促成了本发明。
A变异型位于染色体9q34.1-9q34.2,可转录成大约1065bp的mRNA(NCBI 登录号为NM_020469.2),直接翻译形成355个氨基酸组成的蛋白质。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1:从ABO血型A型变异型基因先证者基因检测确认A型变异型的 突变位点。
1、提取外周血基因组DNA:
在符合国家相关政策规定,并在取样对象同意的基础上,抽取ABO血型A 型变异型基因家系成员外周静脉血2-5ml,放入EDTA-Na2抗凝管内,-80℃冻 存备用;DNA提取使用LIFE公司的DNA提取试剂盒,具体操作流程如下:
冻存的EDTA抗凝血在室温融化后,取500ul放于离心管,加入等体积的 红细胞裂解液(pH8.0),涡旋混匀5分钟,12000rpm离心5分钟,弃上清。重 复加入红细胞裂解液500ul涡旋混匀5分钟,12000rpm离心5分钟,弃上清。
沉淀物涡旋混匀5分钟,加入核裂解液50ul,涡旋混匀5分钟,置于56℃ 金属浴15分钟。从水浴中取出样品,加入蛋白清除液135ul。涡旋充分混匀, 至于4℃30分钟。
室温下12000rpm离心5分钟,吸取上清液(约200ul)至一新离心管中。加 入冰乙醇500ul,反复震荡离心管,直至白色DNA沉淀物析出。室温12000rpm 离心2分钟,弃上清。向DNA沉淀加入75%乙醇,漂洗一次,室温12000rpm 离心3分钟,弃上清,置于室温中挥发剩余乙醇,最后加入50μL TE(pH8.0), 4℃过夜溶解DNA。
对提取的DNA行琼脂糖胶电泳,并应用紫外分光光度计在260nm和280nm 比色,检测DNA纯度及浓度。
2、直接测序法寻找先证者A型变异型基因的突变位点
PCR扩增目的片段:反应条件与反应体系:
(1)PCR反应条件:95℃预变性10分钟;94℃60秒,63℃90秒,72 ℃60秒,10个循环;94℃60秒,61℃90秒,72℃60秒,25个循环;72 ℃延伸10min,扩增产物10℃保温。
(2)反应体系:(TAKARA Ex-Taq polymerase)
应用该反应体系进行先证者的基因组DNA模板与上述ABO-E7F、ABO- E7R引物的扩增反应。
PCR产物测序:应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序,其中 应用引物对ABO-E7F:5'-CCGCCTGCCTTGCAGATA-3';ABO-E7R:5'- TTTACCCGTTCTGCTAAAACCAA-3'。直接测序显示在先证者发现存在新的A 基因和O基因,基因编码区域由起始密码子起第958位碱基之前全是双峰(图 2)。多次测序结果表明该变化并不是因为扩增或测序错误引进的,考虑有碱基 的插入或缺失,于是进行单倍体测序。
3、对ABO基因第6,7外显子及第6内含子进行单倍型测序,确定先证者A 变异型基因的突变位点
PCR扩增目的片段引物:ABO-E6mo:5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCAC CCTGCCA-3';ABO-E7mo:5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'。
PCR扩增引物也可以选用其它能扩增上述SNP位点的引物对。
PCR扩增目的片段的反应条件与反应体系:
(1)PCR反应条件:95℃预变性5分钟;95℃30秒,60℃30秒,72℃ 50秒,40个循环;72℃延伸5min,扩增产物10℃保温。
(2)反应体系:(TAKARA LA-Taq polymerase)
应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与发明者设计的 克隆测序的引物进行扩增反应。将PCR产物克隆入T载体,挑取多个菌落进行 单倍型序列测定,单倍型测序引物使用ABO-E6mo:5'-CGGGATCCATGTGGGT GGCACCCTGCCA-3';ABO-E7mo:5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'(测序 引物也可以选用从A型变异基因上设计的,能扩增SNP位点的其它引物)确定 样本的单倍型序列(图3)。该突变为一新发现突变。该突变不存在于下面的数 据库中:单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/),血型基 因突变库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.fcgi?cmd=bgmut/systems_info&system=abo)。
该突变导致了编码A血型的蛋白组成的核苷酸发生改变,A基因编码区域 由起始密码子起第467位由C>T,导致了第156位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸; 第963位碱基和964位碱基之间插入一个C,导致了后面的氨基酸发生改变。
具体就是由:
变为如下的序列:
氨基酸的突变从而引起了此A变异型的个体A抗原表位发生缺失,导致这 种个体不需要免疫刺激就能够产生血浆中能够产生同种的抗-A1抗体(天然免 疫),当输注正常人的A型血液时就会发生急性溶血性输血反应,从而危及患者 生命。而在近300多例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的 突变筛查,未发现该突变。
实施例2:SNP位点的检测
在青岛市中心血站输血医学研究所收集的先证者家系成员,提取他们的外周 血基因组DNA,应用上述DNA作为模板与ABO-E7F、ABO-E7R引物进行PCR 目的片段的扩增,常规Sanger测序法应用上述这对引物对PCR产物进行直接 测序,直接测序结果显示存在O基因以及新的A基因,即该先证者的两名家系 成员存在本发明中发现的SNP突变,编码区域由起始密码子起第958位碱基之 前全部为双峰。继续对发现SNP突变的两位家系成员进行ABO基因第6,7外显 子及第6内含子的单倍型测序,应用上述提取的两位家系成员的基因组DNA作为模板与ABO-E6mo、ABO-E7mo引物进行PCR目的片段的扩增,将PCR产 物克隆入T载体,挑取多个菌落进行单倍型序列测定,单倍型测序引物使用上述 引物,确定样本的单倍型序列。单倍型测序发现,此家系成员A基因编码区域由 起始密码子起第467位由C>T,导致了第156位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸;第 963位碱基和964位碱基之间插入一个C,导致了后面的氨基酸发生改变,与先 证者完全一致,而且这两名家系个体血浆中都存在同种抗-A1抗体。
通过上述的分析,证明本发明所筛选的SNP位点及设计的检测引物可以 用来检测个体ABO血型基因是否发生A基因突变,从而预防潜在的发生输血 后急性输血型溶血反应的危险。
序列表
<110> 青岛市中心血站
<120> 一种用于检测急性溶血性输血反应的SNP位点
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgcctgcct tgcagata 18
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttacccgtt ctgctaaaac caa 23
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgggatccat gtgggtggca ccctgcca 28
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggcctaggc ttcagttact c 21
Claims (7)
1.一种用于检测ABO血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶血性输血反应的SNP位点,其特征在于,所述的SNP位点包含有ABO血型基因编码区域由起始密码子起第467位碱基,为C>T的突变;且第963位碱基与第964位碱基之间插入1个C。
2.一种用于检测权利要求1所述的SNP位点的制剂,其特征在于,所述的制剂为直接扩增及测序引物或单倍型扩增及测序引物。
3.如权利要求2所述的制剂,其特征在于,所述的直接扩增及测序引物的序列为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2。
4.如权利要求2所述的制剂,其特征在于,所述的单倍型扩增及测序引物的序列为SEQID NO:3和SEQ ID NO:4。
5.权利要求2所述的制剂在制备用于检测急性或者迟发性溶血性输血反应的制品中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述制品为分子检测试剂盒。
7.一种用于急性溶血性输血反应的PCR检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中包含有权利要求2所述的制剂。
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