CN116411059A - 一种引发溶血性输血反应的类孟买表型的snp位点、应用及试剂 - Google Patents
一种引发溶血性输血反应的类孟买表型的snp位点、应用及试剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其是涉及一种引发溶血性输血反应的类孟买表型的SNP位点、应用及试剂。本发明发现了一种可引发溶血性输血反应的H血型系统血型基因的新的SNP突变位点，产生了该血型系统的一种新的等位基因，可导致产生类孟买表型。提供有关SNP位点及其分子检测试剂，有助于明确个体的H血型基因型，可进一步提高输血安全。本发明还提供了前述SNP位点及等位基因的快速检测方法，从而提供了一种有效的避免溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者以及献血者外周血进行H血型类孟买型FUT1基因突变位点的检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其是涉及一种引发溶血性输血反应的类孟买表型的SNP位点、应用及试剂。
背景技术
H血型系统是人类目前已知的44个红细胞血型系统中的其中一个血型系统，其唯一的血型抗原H抗原与ABO血型、Lewis血型密切相关。H抗原物质是ABO血型抗原的前体物质，直接影响着ABO抗原在红细胞上的表达。同时H抗原存在于HPCs、红细胞、巨核细胞和其他组织中，与细胞黏附、造血分化和多种恶性肿瘤密切有关。
H抗原由a-1,2-岩藻糖基转移酶合成，编码该转移酶的基因是FUT1基因。FUT1基因编码的a-1,2-岩藻糖基转移酶通过催化L-岩藻糖将其连接到前体糖链上从而形成H抗原。因此，当FUT1基因发生变异造成转移酶结构特性发生改变时，无法催化L-岩藻糖连接到前体糖链上而形成H抗原，导致H抗原部分或完全缺失。FUT1基因变异个体可表现为类孟买表型，该表型可表现为红细胞表面ABH抗原的不表达或弱表达，而分泌液可检出ABH抗原(红细胞H缺乏分泌型)。类孟买表型在中国人群中是一种极其罕见的红细胞血型，通常这类表型个体血浆中存在抗H/抗HI抗体，可导致输血后红细胞存活率下降，发生溶血性输血反应。同时，由于H抗原物质作为AB抗原形成的前体物质，其部分或完全缺失表达进一步影响了AB抗原的表达与相关抗体的产生。因此H抗原部分或完全缺失的变异型个体输血时不能用常规的AB抗原正常的血液，只能选择配合性的H缺陷供者的血液。在临床输血前的血型鉴定和抗体筛查过程中，出现ABO正反定型一致，血清抗体筛查结果疑似为抗H或抗HI抗体时，进行类孟买血型的确认，开展血型相容性输血具有重要临床意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，从类孟买表型的先证者出发，确定其FUT1基因上存在的SNP位点，并针对该SNP位点开发对应的检测试剂，期望能够用于明确其他待测个体的H血型基因型，从而提高输血的安全性。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供FUT1基因的SNP位点，所述SNP位点包括(a)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变和第840位c.840G>A突变，或者(b)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变；野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列为:
ATGTGGCTCCGGAGCCATCGTCAGCTCTGCCTGGCCTTCCTGCTAGTCTGTGTCCTCTCTGTAATCTTCTTCCTCCATATCCATCAAGACAGCTTTCCACATGGCCTAGGCCTGTCGATCCTGTGTCCAGACCGCCGCCTGGTGACACCCCCAGTGGCCATCTTCTGCCTGCCGGGTACTGCGATGGGCCCCAACGCCTCCTCTTCCTGTCCCCAGCACCCTGCTTCCCTCTCCGGCACCTGGACTGTCTACCCCAATGGCCGGTTTGGTAATCAGATGGGACAGTATGCCACGCTGCTGGCTCTGGCCCAGCTCAACGGCCGCCGGGCCTTTATCCTGCCTGCCATGCATGCCGCCCTGGCCCCGGTATTCCGCATCACCCTGCCCGTGCTGGCCCCAGAAGTGGACAGCCGCACGCCGTGGCGGGAGCTGCAGCTTCACGACTGGATGTCGGAGGAGTACGCGGACTTGAGAGATCCTTTCCTGAAGCTCTCTGGCTTCCCCTGCTCTTGGACTTTCTTCCACCATCTCCGGGAACAGATCCGCAGAGAGTTCACCCTGCACGACCACCTTCGGGAAGAGGCGCAGAGTGTGCTGGGTCAGCTCCGCCTGGGCCGCACAGGGGACCGCCCGCGCACCTTTGTCGGCGTCCACGTGCGCCGTGGGGACTATCTGCAGGTTATGCCTCAGCGCTGGAAGGGTGTGGTGGGCGACAGCGCCTACCTCCGGCAGGCCATGGACTGGTTCCGGGCACGGCACGAAGCCCCCGTTTTCGTGGTCACCAGCAACGGCATGGAGTGGTGTAAAGAAAACATCGACACCTCCCAGGGCGATGTGACGTTTGCTGGCGATGGACAGGAGGCTACACCGTGGAAAGACTTTGCCCTGCTCACACAGTGCAACCACACCATTATGACCATTGGCACCTTCGGCTTCTGGGCTGCCTACCTGGCTGGCGGAGACACTGTCTACCTGGCCAACTTCACCCTGCCAGACTCTGAGTTCCTGAAGATCTTTAAGCCGGAGGCGGCCTTCCTGCCCGAGTGGGTGGGCATTAATGCAGACTTGTCTCCACTCTGGACATTGGCTAAGCCTTGA(SEQ ID No.1)。
第二方面，本发明提供FUT1基因的等位基因，所述FUT1基因的等位基因包括(a)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变和第840位c.840G>A突变，或者(b)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变；野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
第三方面，本发明提供前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点，或前述实施方式所述FUT1基因的等位基因在(a)或(b)中的应用：
(a)类孟买血型鉴定；
(b)制备鉴定类孟买血型试剂。
第四方面，本发明提供检测前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点的第一试剂，所述第一试剂包括c.575G>C突变的扩增引物对和c.840G>A突变的扩增引物对。
优选地，所述第一试剂还包括内参基因的扩增引物对。
优选地，所述内参基因包括G6PD基因、GAPDH基因或β-actin基因。
优选地，所述c.575G>C突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2(GGTATTCCGCATCACCCTG)和SEQ ID No.3(ACACTCTGCGCCTCTTCCG)所示。
优选地，所述c.840G>A突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4(ATTTGCTGGCGATGGACAGG)和SEQ ID No.5(GATCTTCAGGAACTCAGAGT)所示。
优选地，所述G6PD基因的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6(TCTACCGCATCGACCACTAC)和SEQ ID No.7(ACCTTCTCATCACGGACGTC)所示。
第五方面，本发明提供检测前述实施方式所述FUT1基因的等位基因的第二试剂，所述第二试剂包括FUT1基因的扩增引物对和测序引物，所述FUT1基因的扩增引物对的扩增片段覆盖FUT1基因编码区起始密码子起的第575位和第840位。
优选地，所述FUT1基因的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.8(GCTAATTCGCCTTTCCTCCC)和SEQ ID No.9(CACGTACTGCTGGCTCTAGA)所示。
优选地，所述FUT1基因的测序引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10(CCTTTATCCTGCCTGCCATGCATGC)和SEQ ID No.11(GGATCTCTCAAGTCCGCGTA)所示。
进一步优选地，所述测序引物还包括核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的正向扩增引物和/或核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的反向扩增引物。
第六方面，本发明提供了前述实施方式所述第一检测试剂和/或第二检测试剂在类孟买血型鉴定中的应用。
第七方面，本发明提供类孟买血型鉴定试剂盒，所述类孟买血型鉴定试剂盒包括前述实施方式所述第一试剂和/或前述实施方式所述第二试剂。
第八方面，本发明提供类孟买血型鉴定方法，应用前述实施方式所述试剂盒对待测血样进行扩增，扩增产物中含有前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点，或者前述实施方式所述FUT1基因的等位基因时，确定待测血样的血型为类孟买血型。
在可选的实施方式中，所述类孟买血型鉴定方法包括，分别采用前述实施方式所述的第一试剂中的两对引物对对待测血样进行PCR-SSP检测，根据得到的对应扩增产物结果确定待测血样是否为类孟买血型。
优选地，两对引物对均未得到扩增产物时，确定待测血样不含有前述实施方式所述的SNP位点或前述实施方式所述的等位基因。
在可选的实施方式中，所述类孟买血型鉴定方法包括，采用前述实施方式所述的FUT1基因的扩增引物对对待测血样进行PCR扩增，而后采用前述实施方式所述的FUT1基因的测序引物对对扩增产物进行测序，确定待测血样的是否为类孟买血型。
优选地，所述类孟买血型鉴定方法还包括单倍型分型测序。
本发明发现了一种可引发溶血性输血反应的H血型系统血型基因的新的SNP突变位点，产生了该血型系统的一种新的等位基因，可导致产生类孟买表型。提供有关SNP位点及其分子检测试剂，有助于明确个体的H血型基因型，辅助其红细胞抗原和血清抗体的鉴定，可进一步提高输血安全、加强预防输血引发的溶血性输血反应。
本发明还提供了前述SNP位点及等位基因的快速检测方法，从而提供了一种有效的避免溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者以及献血者外周血进行H血型类孟买型FUT1基因突变位点的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中先证者FUT1基因编码区包括第575位碱基和第840位碱基的直接测序部分序列结果；
图2为本发明实施例1中先证者FUT1基因编码区包括第840位碱基的直接测序部分序列结果；
图3为发明实施例3中血液检测样本FUT1基因575位突变PCR-SSP检测的电泳图；
图4为发明实施例3中血液检测样本FUT1基因840位突变PCR-SSP检测的电泳图；
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
某次具体的实施方式中，第一方面，本发明提供FUT1基因的SNP位点，所述SNP位点包括(a)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变和第840位c.840G>A突变，或者(b)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变；野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
上述两个碱基突变存在于一位H血型类孟买表型先证者的FUT1基因中，并证实该基因的突变是导致类孟买血型产生的原因，导致先证者红细胞H抗原缺失或减弱。H抗原物质作为AB抗原的前体物质，其表达缺失进一步影响其AB抗原的表达，导致该AB型患者与正常AB型个体相比较，其红细胞无法形成A、B抗原，并且血浆中产生同种抗H抗体。一旦输入任何H阳性的AB型或者O正常血液，将会引发溶血性输血反应。
所发现的SNP位点FUT1基因，位于染色体19q13.33，包含4个外显子，编码区起始于第4外显子，可转录成大约1029bp的mRNA序列(NCBI登录号为NM_000148.3)，翻译形成343个氨基酸组成的岩藻糖基转移酶蛋白。
第二方面，本发明提供FUT1基因的等位基因，所述FUT1基因的等位基因包括FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变和第840位c.840G>A突变，或者(b)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变；野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
第三方面，本发明提供前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点，或前述实施方式所述FUT1基因的等位基因在(a)或(b)中的应用：
(a)类孟买血型鉴定；
(b)制备鉴定类孟买血型试剂。
第四方面，本发明提供检测前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点的第一试剂，所述第一试剂包括c.575G>C突变的扩增引物对和c.840G>A突变的扩增引物对。
优选地，所述第一试剂还包括内参基因的扩增引物对。
优选地，所述内参基因包括G6PD基因、GAPDH基因或β-actin基因。
优选地，所述c.575G>C突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2(GGTATTCCGCATCACCCTG)和SEQ ID No.3(ACACTCTGCGCCTCTTCCG)所示。
优选地，所述c.840G>A突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4(ATTTGCTGGCGATGGACAGG)和SEQ ID No.5(GATCTTCAGGAACTCAGAGT)所示。
优选地，所述G6PD基因的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6(TCTACCGCATCGACCACTAC)和SEQ ID No.7(ACCTTCTCATCACGGACGTC)所示。
第五方面，本发明提供检测前述实施方式所述FUT1基因的等位基因的第二试剂，所述第二试剂包括FUT1基因的扩增引物对和测序引物对，所述FUT1基因的扩增引物对的扩增片段覆盖FUT1基因编码区起始密码子起的第575位和第840位。
优选地，所述FUT1基因的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.8(GCTAATTCGCCTTTCCTCCC)和SEQ ID No.9(CACGTACTGCTGGCTCTAGA)所示。
优选地，所述FUT1基因的测序引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10(CCTTTATCCTGCCTGCCATGCATGC)和SEQ ID No.11(GGATCTCTCAAGTCCGCGTA)所示。
进一步优选地，所述测序引物还包括核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的正向扩增引物和/或核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的反向扩增引物。
第六方面，本发明提供了前述实施方式所述第一检测试剂和/或第二检测试剂在类孟买血型鉴定中的应用。
第七方面，本发明提供类孟买血型鉴定试剂盒，所述类孟买血型鉴定试剂盒包括前述实施方式所述第一试剂和/或前述实施方式所述第二试剂。
第八方面，本发明提供类孟买血型鉴定方法，应用前述实施方式所述试剂盒对待测血样进行扩增，扩增产物中含有前述实施方式所述FUT1基因的SNP位点，或者前述实施方式所述FUT1基因的等位基因时，确定待测血样的血型为类孟买血型。
在可选的实施方式中，所述类孟买血型鉴定方法包括，分别采用前述实施方式所述的第一试剂中的两对引物对对待测血样进行PCR-SSP检测，根据得到的对应扩增产物结果确定待测血样是否为类孟买血型。
优选地，两对引物对均未得到扩增产物时，确定待测血样不含有前述实施方式所述的SNP位点或前述实施方式所述的等位基因。
在可选的实施方式中，所述类孟买血型鉴定方法包括，采用前述实施方式所述的FUT1基因的扩增引物对对待测血样进行PCR扩增，而后采用前述实施方式所述的FUT1基因的测序引物对对扩增产物进行测序，确定待测血样的是否为类孟买血型。
优选地，所述类孟买血型鉴定方法还包括单倍型分型测序。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例采集一例无偿献血者，其ABO血型和H血型血清学疑似为类孟买型的先证者进行FUT1基因检测确认其H血型基因的突变位点，采用PCR-SBT的基因分型方法，具体包括以下步骤：
(1)制备人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板
在取样先证者知情同意的基础上，取待检全血200μl，按照Pre-Filled CartridgeReagent试剂盒(货号：101@S4100-22157，RBC Bioscience)说明书提取基因组DNA并测定基因组DNA的浓度和纯度。
合成2条FUT1扩增引物和2条测序引物，具体引物序列如SEQ IDNo.8～11所示，将扩增引物用纯水稀释至50μmol/L。
(2)PCR扩增直接测序法寻找先证者类孟买型FUT1基因的突变位点
准备LA Taq酶(货号：RR02MQ，TaKaRa)、RNase-free H2O，与步骤(1)所制备的PCR扩增模板，按下表1配制PCR反应体系。
表1扩增反应体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| 10×LA PCR buffer | 2 |
| dNTP | 1.8 |
| RNase-free H2O | 补足至20 |
| FUT1-F引物(SEQ ID No.8) | 0.1 |
| FUT1-R引物(SEQ ID No.9) | 0.1 |
| LA-Taq | 0.2 |
| DNA模板 | 2 |
| 总体积 | 20 |
扩增条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，扩增产物4℃保温。PCR扩增结束后，将检测样本所扩增片段各取2μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段的特异性。
扩增产物采用1μl虾碱性磷酸酶(货号：55953500，Roche)和2μl核酸外切酶Ⅰ(货号：AL21979A，TaKaRa)在37℃条件下进行30min酶切反应，80℃下15min酶失活。
将纯化之后的PCR产物加入20μl纯水稀释，混匀，将2条寡核苷酸测序引物(核苷酸序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示)用纯水稀释至浓度为3.2μmol/L，以BigDyeterminator v3.1 sequencing kit(货号：4336699，ABI公司)进行测序反应。应用2条测序引物进行测序。在先证者中发现H血型FUT1基因编码区域由起始密码子起第575和840位碱基发生了杂合性突变，结果如图1所示，其中红色框选标识的为先证者FUT1基因编码区域由起始密码子起第575位碱基G/C杂合突变和第840位碱基G/A杂合突变。
并且经过多次测序结果均表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引起的。由此得到可用于类孟买血型检测的SNP位点。
实施例2
本实施例对FUT1基因编码区的序列进行单倍型分型测序，确定实施例1中先证者基因突变位点的单倍体位置。
将实施例1得到的PCR产物利用TOPO TA Cloning Kit For Sequencing试剂盒(货号：45-0030，Invitrogen by life technologies)通过TA克隆连接入载体中，转染到感受态细胞中。利用氨苄青霉素筛选，挑取多个阳性菌落进行单倍型序列在ABI 3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测定，单倍型测序引物使用实施例1所述的测序引物。所测序结果利用SeqScape V2.5软件进行序列比对，确定FUT1基因的单倍体序列，发现c.575G＞C和c.840G＞A位于同一条单倍体序列上。两个突变均为新发现突变，均不存在于单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)。而两个新突变所形成的等位基因仍未被收录于国际输血协会(ISBT)血型基因突变库(ISBT 018H(FUT1FUT2)blood groupalleles v6.0 30-JUN-2022)，表明由这两个突变组成的等位基因为FUT1基因的一种新的等位基因。FUT1基因由起始密码子起的c.575G＞C突变，导致了第192位氨基酸由精氨酸变为脯氨酸；c.840G＞A突变为同义突变，不引起氨基酸的改变。
目前可以确定的是，上述两个新突变同时存在于同一等位基因时能够导致编码H血型系统FUT1基因编码的岩藻糖基转移酶氨基酸生改变，氨基酸的置换引起了此类孟买型个体H抗原表位发生缺失，进一步导致A、B抗原表达的缺失，同时这种个体血浆中能够产生抗-H抗体与抗A、抗B抗体，当输注不配合血液时就会发生溶血性输血反应，从而危及输血者生命。根据SNP位点突变导致的氨基酸残基的改变能够推断的是，当仅发生FUT1基因由起始密码子起的c.575G＞C突变时，应当能够导致H抗原的缺失，进一步引起A、B抗原表达的缺失。但当仅发生FUT1基因由起始密码子起的c.840G＞A突变时，由于其为同义突变，其突变结果是否会导致A、B、H抗原表达的缺失，还有待进一步验证。
通过上述的分析，证明可以通过检测本发明发现的FUT1基因的SNP位点来检测个体H血型基因是否发生突变，从而确定个体是否为罕见的类孟买型，是否存在潜在的发生输血性溶血反应的危险以及用于筛选相应的类孟买型供者，为患者寻找匹配的配合性血液。
实施例3
本实施例利用实施例1得到的两个SNP位点，进行PCR-SSP检测，验证将两个SNP位点作为标志物进行类孟买血型鉴定的可行性，具体包括以下步骤：
(1)制备人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板。
在符合国家相关政策规定，并在取样先证者知情同意的基础上，取待检全血200μl，按照Pre-Filled Cartridge Reagent试剂盒(货号：101@S4100-22157，RBCBioscience)说明书提取基因组DNA并测定基因组DNA的浓度和纯度，将DNA浓度稀释至30ng/μl。
(2)合成4条FUT1基因对应SNP位点的特异性扩增引物和2条内参对照的G6PD扩增引物，具体引物序列如表2所示，见发明内容和序列表中的基因序列，将扩增引物用纯水稀释至10μmol/L。
表2PCR-SSP检测所用引物序列
(3)PCR-SSP扩增检测该类先证者类孟买型FUT1基因的突变位点
准备Multiplex PCR Assay Kit Ver.2试剂(货号：RR062A，TaKaRa)、RNase-freeH2O，与步骤(1)所制备的PCR扩增模板，按下表3配制PCR反应体系。
表3扩增体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| 2×buffer | 10 |
| RNase-free H2O | 补足至20 |
| FUT-575F(或FUT-840F) | 0.2 |
| FUT-575R(或FUT-840R) | 0.2 |
| G6PD-F | 0.15 |
| G6PD-R | 0.15 |
| DNA模板 | 1.6 |
| Multiplex PCR Enzyme Mix | 0.1 |
| 总体积 | 20 |
上述PCR反应体系混匀后，在美国ABI公司的PCR仪(ABI9700)上按以下程序进行扩增：94℃预变性1min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，60℃退火30s，扩增引物结合到模板上，72℃延伸30s，延长所需扩增片段，反应30个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸。然后冷却至12℃。
PCR扩增结束后，将检测样本所扩增片段各取2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，定性确定目的扩增片段是否存在。结果显示了检测样本是否存在SNP突变位点。图3～4分别为本发明的血液检测样本进行FUT1基因575位和840位突变检测的电泳图。图3中泳道1为DL2000的DNA分子marker，泳道2～8为野生型575核苷酸位点PCR-SSP检测，扩增结果为阴性；泳道9为突变型575核苷酸位点PCR-SSP检测结果，扩增结果为阳性。图4中泳道1为DL2000的DNA分子marker，泳道2～8为野生型840核苷酸位点PCR-SSP检测，扩增结果为阴性；泳道9为突变型840核苷酸位点PCR-SSP检测结果，扩增结果为阳性。所有样本均以G6PD基因作为内参。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.FUT1基因的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点包括(a)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变和第840位c.840G>A突变，或者(b)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变；野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.FUT1基因的等位基因，其特征在于，所述FUT1基因的等位基因包括(a)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变和第840位c.840G>A突变，或者(b)FUT1基因编码区起始密码子起的第575位c.575G>C突变；野生型FUT1基因编码区的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
3.权利要求1所述FUT1基因的SNP位点，或权利要求2所述FUT1基因的等位基因在(a)或(b)中的应用：
(a)类孟买血型鉴定；
(b)制备鉴定类孟买血型试剂。
4.检测权利要求1所述FUT1基因的SNP位点的第一试剂，其特征在于，所述第一试剂包括c.575G>C突变的扩增引物对和c.840G>A突变的扩增引物对；
优选地，所述第一试剂还包括内参基因的扩增引物对；
优选地，所述内参基因包括G6PD基因、GAPDH基因或β-actin基因；
优选地，所述c.575G>C突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；
优选地，所述c.840G>A突变的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；
优选地，所述G6PD基因的扩增引物对的正向扩增引物和反应扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。
5.检测权利要求2所述FUT1基因的等位基因的第二试剂，其特征在于，所述第二试剂包括FUT1基因的扩增引物对和测序引物对，所述FUT1基因的扩增引物对的扩增片段覆盖FUT1基因编码区起始密码子起的第575位和第840位；
优选地，所述FUT1基因的扩增引物对的正向扩增引物和反向扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示；
优选地，所述FUT1基因的测序引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。
6.权利要求4所述第一试剂和/或权利要求5所述第二试剂在类孟买血型鉴定中的应用。
7.类孟买血型鉴定试剂盒，其特征在于，所述类孟买血型鉴定试剂盒包括权利要求4所述第一试剂和/或权利要求5所述第二试剂。
8.类孟买血型鉴定方法，其特征在于，应用权利要求7所述试剂盒对待测血样进行扩增，扩增产物中含有权利要求1所述FUT1基因的SNP位点，或者权利要求2所述FUT1基因的等位基因时，确定待测血样的血型为类孟买血型。
9.根据权利要求8所述的类孟买血型鉴定方法，其特征在于，所述类孟买血型鉴定方法包括，分别采用权利要求4所述的第一试剂中的两对引物对对待测血样进行PCR-SSP检测，根据得到的对应扩增产物结果确定待测血样是否为类孟买血型；
优选地，两对引物对均未得到扩增产物时，确定待测血样不含有权利要求1所述的SNP位点或权利要求2所述的等位基因。
10.根据权利要求8所述的类孟买血型鉴定方法，其特征在于，所述类孟买血型鉴定方法包括，采用权利要求5所述的FUT1基因的扩增引物对对待测血样进行PCR扩增，而后采用权利要求5所述的FUT1基因的测序引物对对扩增产物进行测序，确定待测血样的是否为类孟买血型；优选地，所述类孟买血型鉴定方法还包括单倍型分型测序。
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| CN113667673B (zh) * | 2021-07-15 | 2024-02-06 | 武汉血液中心 | 一种类孟买血型FUT1 236delG等位基因及其检测方法和应用 |
| CN118497328A (zh) * | 2024-07-15 | 2024-08-16 | 浙江省血液中心 | 一种与免疫性溶血反应相关的Rhmod血型的SNP位点、应用及试剂盒 |
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| CN116411059B (zh) | 2024-09-10 |
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