JP2003513620A - Ｒｈｄ陰性遺伝子座の分子構造 - Google Patents

Ｒｈｄ陰性遺伝子座の分子構造

Info

Publication number
JP2003513620A
JP2003513620A JP2001535401A JP2001535401A JP2003513620A JP 2003513620 A JP2003513620 A JP 2003513620A JP 2001535401 A JP2001535401 A JP 2001535401A JP 2001535401 A JP2001535401 A JP 2001535401A JP 2003513620 A JP2003513620 A JP 2003513620A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
rhd
acid molecule
gene
rhesus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2001535401A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4620920B2 (ja
JP2003513620A5 (ja
Inventor
フレーゲル，ヴィリー，アー．
ワーグナー，フランツ，エフ．
Original Assignee
デーエルカー ブルーツペンデディーンスト バーデン−ヴュルテンベルク−ヘッセン ゲーゲーエムベーハー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by デーエルカー ブルーツペンデディーンスト バーデン−ヴュルテンベルク−ヘッセン ゲーゲーエムベーハー filed Critical デーエルカー ブルーツペンデディーンスト バーデン−ヴュルテンベルク−ヘッセン ゲーゲーエムベーハー
Publication of JP2003513620A publication Critical patent/JP2003513620A/ja
Publication of JP2003513620A5 publication Critical patent/JP2003513620A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4620920B2 publication Critical patent/JP4620920B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Abstract

(57)【要約】 本発明は、RHD、SMP1及びRHCE遺伝子及び／又は１若しくは複数のRhesusボックス、好ましくは、ハイブリッドRhesusボックス、上流Rhesusボックス及び／又は下流Rhesusボックスを含有したRhesus遺伝子座を示す核酸分子構造に関する。さらに、本発明は、共通のRHD陰性ハプロタイプの特異的検出方法に関する。さらに、本発明は、D陰性個体におけるRHD陽性ハプロタイプの検出に関する。診断ツールの開発可能にしてRHD遺伝子における種々の変異が同定されいる。また、本発明は、前記ハイブリッドボックス、好ましくは、ブレークポイント若しくはブレークポイント領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又は上流及び下流Rhesusボックスに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、本発明の前記化合物を含有又は使用するキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ＲＨＤ、ＳＭＰ１およびＲＨＣＥ遺伝子を含有するＲｈｅｓｕｓ遺
伝子座および／またはＲｈｅｓｕｓボックス（群）、好ましくはハイブリッドＲ
ｈｅｓｕｓボックス、上流Ｒｈｅｓｕｓボックスおよび／または下流Ｒｈｅｓｕ
ｓボックスを提示する核酸分子構造に関する。さらに、本発明は、一般的なＲＨ
Ｄ陰性ハプロタイプの特異的検出のための方法に関する。本発明はさらに、Ｄ陰
性個体におけるＲＨＤ陽性ハプロタイプの検出に関する。診断用ツールの開発を
可能にするＲＨＤ遺伝子における種々の変異が同定されている。本発明はまた、
該ハイブリッドボックス、好ましくはブレークポイント(breakpoint)もしくはブ
レークポイントの領域に、または上流および下流Ｒｈｅｓｕｓボックスに特異的
とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関する。さらにまた、本発明は、上
述の本発明の化合物を含有または使用してなるキットに関する。
【０００２】 いくつかの文献が本明細書の本文中で引用されているが、本明細書に引用され
た文献の各々の開示内容（製造業者の仕様書、指示書などをいずれも含む）は、
参照により本明細書に取り込まれる。
【０００３】 Ｒｈｅｓｕｓ Ｄ抗原（ＩＳＢＴ ００４．００１； ＲＨ１）は、タンパク
質により決定される最も重要な血液型抗原である。抗−Ｄは、なお新生児溶血性
疾患の主な原因である（Filbey, Acta Obstet Gynecol Scand, 74:687,1995； B
owman, J, Semin Perinatol 21:39, 1997）。集団によるが、白色系人種の３％
〜２５％は抗原Ｄをもたない（Mourant, The distribution of the human blood
groups and other polymorphisms, London, Oxford University Press, 1976）
。抗−Ｄ免疫化は、Ｄ−陰性レシピエントにおいて容易に起こり得る（Urbaniak
, Transfusion 21:64, 1981）。
【０００４】 ＲＨ血液型の抗原は、染色体上の位置１ｐ３４．１−１ｐ３６に（Cherif-Zah
ar, Hum. Genet. 86: 398, 1991; MacGeoch, Cytogenet. Cell Genet. 59:261,
1992）、おそらく４５０，０００塩基対（ｂｐ）未満の間隔をあけて（Carritt,
Hum. Mol. Genet. 6:843, 1997）存在するＲＨＤおよびＲＨＣＥの２つの遺伝
子にコードされるタンパク質に保有される。両遺伝子は、１０個のエキソンを含
み、その構造は高度に相同である。両遺伝子の相対方向、間隔および他の遺伝子
が散在する可能性は未知であった（Flegel, Transfus. Med. 8:281, 1998）。ご
く最近になって、Ｏｋｕｄａらにより（Okuda, Biochem. Biophys. Res. Commun
. 263:378, 1999）、ＲＨＤとＲＨＣＥとの間のＤＮＡセグメントを示すと思わ
れる約１１，０００ｂｐの配列が報告された。
【０００５】 白色系人種では、Ｄ−陰性ハプロタイプの大部分は、ＲＨＤ遺伝子の欠失によ
る。エキソン１から３’側非翻訳領域にわたるＲＨＤ−特異的配列は存在しない
ため（Gassner, Transfusion 37:1020, 1997）、この欠失は全ＲＨＤ遺伝子にわ
たる。該欠失の正確な程度は不明確であり、隣接（neighboring）遺伝子もまた
影響される可能性が残ったままである。
【０００６】 Ｄ抗原の分子根拠としてのＲＨＤ遺伝子の同定により、ＤＮＡタイピングによ
るＲｈＤ表現型の予測が可能となった（Flegel, Transfus. Med. 8:281, 1998；
Lo, Lancet 341:1147, 1993）。しかしながら、優勢（prevalent）Ｄ−陰性ハ
プロタイプの構造は未知であるため、ＲＨＤ欠失の特異的検出は不可能なままで
あり、ＲＨＤ+／ＲＨＤ+ホモ接合性個体とＲＨＤ+／ＲＨＤ-ヘテロ接合性個体と
の区別は間接的な方法に依存した。この区別は、抗−Ｄを有するＤ−陰性の母親
において、父親がＲＨＤ+／ＲＨＤ+である子が影響を受けるリスクは１００％で
あるが、父親がＲＨＤ+／ＲＨＤ-では５０％だけであるであるため、特に臨床的
に重要である。
【０００７】 いくつかの間接的なアプローチが接合体構造を決定するために適用されている
。（ｉ）表現型に基づく単純な推測は症例の約９５％において正確である、（ｉ
ｉ）Ｃ抗原の存在などのファクターにより撹乱（confound）されうるＤ抗原密度
の決定、および（ｉｉｉ）ＲＨＤ−およびＲＨＣＥ−特異的配列の同時（parall
el）定量的増幅を含むいくつかの方法（Cossu, Electrophoresis 17:1911, 1996
； Doescher, Infusionsr. Transfusionsmed. 26 (suppl 1): 31, 1999 （abstr
.））。これらの精巧な技術は、通常の研究所では実用的でないことがある。ま
た、何人かの研究者により、ＲＨＤ遺伝子の欠損に遺伝的に連鎖した、ＲＨＣＥ
遺伝子または隣接配列における多型が同定された（Carritt, Hum. Mol. Genet.
6:843, 1997; Huang, Am. J. Hum. genet. 58: 133, 1996; Fujiwara, Hum. gen
et. 104:301, 1999; Onda, Gene 159:225,1995）。この間接的アプローチは、Ｒ
ＨＤ欠失を多型と関連づける連鎖不平衡に依存する。
【０００８】 さらに、ＲＨＤ ＰＣＲの有用性は、ＲｈＤ−陰性においておそらく稀なＲＨ
Ｄ陽性対立遺伝子に関する不完全な知識によって制限される。ＲｈＤ陰性におけ
るＲＨＤ陽性対立遺伝子は、ＲＨＤ−ＣＥ−Ｄハイブリッド遺伝子（Huang, Blo
od 88:2326-33, 1996; Faas, Transfusion 37:38-44, 1997, Faas, Transfusion
36:506-11, 1996）、ナンセンス−変異（Avent, Blood 89:2568-77, 1997）、
フレームシフト（Andrews, Blood 92:1839-40, 1998； Cherif-Zahar Br. J. Ha
ematol. 102:1263-70, 1998）または偽遺伝子（Singleton, Blood 95:12-8, 200
0）により引き起こされる。かかる対立遺伝子は、アフリカ系人種（Faas, Trans
fusion 37:38-44, 1997, Singleton, Blood 95:12-18, 2000）およびアジア系人
種（Okuda, J. Clin. Invest. 100:373-9,1997）には頻繁にみられるが、白色系
人種では稀である。それにもかかわらず、最近の解析（Avent, Blood 89:2568-7
7, 1997； Flegel, Transfus. Med. 8:281-302, 1998）では、白色人種において
さえ、これらの対立遺伝子が、おそらく、不正確なＲｈ表現型予測の主な原因で
あることが示唆された。白色人種におけるいくつかの観察（Avent, Blood 89:25
68-77, 1997； Hyland, Blood 84:321-4, 1994）は、これらの対立遺伝子が、Ｃ
ｄｅおよびｃｄＥハプロタイプ内に集中発生（cluster）していることを示した
。
【０００９】 分子レベルでＲＨＤ遺伝子座を解析するための最も直接的なアプローチは、Ｒ
ＨＤ欠失部位にまたがる部位（spanning）のＰＣＲ増幅であろう。このようなア
ッセイは、ＲｈＤ陽性およびＲｈＤ陰性におけるＲＨＤ遺伝子座の構造の理解が
不完全であったため、これまで利用可能ではなかった。
【００１０】 したがって、本発明の下地となる技術的課題は、信頼性のある、核酸に基づい
た、Ｒｈｅｓｕｓ Ｄ遺伝子座の解析のための手段および方法を提供することで
あった。これらの手段および方法は、ＲＨＤ+／ＲＨＤ+個体およびＲＨＤ+／Ｒ
ＨＤ-個体の検出および／または区別に特に好適であるはずである。
【００１１】 前述の技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴づけられる実施態様
を提供することにより達成される。
【００１２】 したがって、本発明は、ＲＨＤ、ＳＭＰ１およびＲＨＣＥ遺伝子を含有するＲ
ｈｅｓｕｓ遺伝子座および／またはＲｈｅｓｕｓボックス、好ましくはハイブリ
ッドＲｈｅｓｕｓボックス、上流Ｒｈｅｓｕｓボックスおよび／または下流Ｒｈ
ｅｓｕｓボックス（これらの配列を図８〜１０に示す）を提示する核酸分子構造
に関する。
【００１３】 本発明の文脈において、用語「核酸分子構造」は、広義において、上述の遺伝
子、すなわち、順に５’側から３’側に配列されたＲＨＤ、ＳＭＰ１およびＲＨ
ＣＥ遺伝子、および／または前述のＲｈｅｓｕｓ遺伝子座を同時に規定（co-det
ermine）するＲｈｅｓｕｓボックスの組合せをを含有してなる線状ＤＮＡ−セグ
メントと定義する。本発明の分子構造を生じる、ＤＮＡ配列には、以下のものが
含まれ、該ヌクレオチド配列構造は、Ｒｈｅｓｕｓボックス５’フランキング領
域、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックス、または介在ＲＨＤ遺伝子を有する２つ
のＲｈｅｓｕｓボックス、およびＲｈｅｓｕｓボックス３’フランキング領域か
らなる。
【００１４】 以下の構造は、本発明の核酸分子構造に含まれる好ましい態様を示す。
【００１５】 Ｒｈｅｓｕｓボックス５’フランキング領域は、ゲノムクローンＨＳ４６５Ｎ
２４（GenBank 寄託番号AL031432.1）、塩基１〜１２０，１５６で表される(rep
resent)。
【００１６】 ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスは、GenBank 寄託番号AL252313、塩基３３
〜９，１８０に代表される。
【００１７】 介在ＲＨＤ遺伝子を有する２つのＲｈｅｓｕｓボックスは、GenBank 寄託番号
AL252311 塩基３４〜９，１７５に表される上流ＲｈｅｓｕｓボックスとＲＨＤ
遺伝子とGenBank 寄託番号AL252312塩基２３〜９，１７７で表される下流Ｒｈｅ
ｓｕｓボックスとからなる（図８〜１０参照のこと）。
【００１８】 Ｒｈｅｓｕｓボックス３’フランキング領域は、下流またはハイブリッドＲｈ
ｅｓｕｓボックスとＳＭＰ１遺伝子、ＳＭＰ１遺伝子およびＲＨＣＥ遺伝子との
間の小ＤＮＡセグメントからなる。
【００１９】 ＲＨＤ遺伝子は、ゲノムクローンHS469Ｄ22（GenBank 寄託番号AL031284.9）
塩基５６，０１２〜５１，４７２に相同であり、「スタッファー（stuffer）断
片」（GenBank 寄託番号AB029152）とも称する塩基７，７１６〜１１，００５の
ヌクレオチドセグメントで示されるＲＨＤ５’側領域；ＲＨＤプロモーター（Ge
nBank 寄託番号AJ252314）塩基１〜１，２４６（図１１参照）、およびＲＨＤ
ｃＤＮＡ（GenBank 寄託番号X63097）塩基１〜１，３７１およびそのイントロン
配列により規定されるＲＨＤ遺伝子からなる。
【００２０】 小ＤＮＡセグメントは、好ましくは、下流またはハイブリッドＲｈｅｓｕｓボ
ックスとＳＭＰ１遺伝子との間の１５ヌクレオチドを含有し、AL252312塩基９，
１７８〜９，１９２で表される。
【００２１】 ＳＭＰ１遺伝子は、GenBank 寄託番号AF0811282およびそのイントロン配列で
表されるＳＭＰ１ ｃＤＮＡにより規定される。
【００２２】 ＲＨＣＥ遺伝子は、GenBank 寄託番号X63095およびそのイントロン配列で表さ
れ、さらに一部がゲノムクローンHS469D22 （GenBank 寄託番号AL031432.1）塩
基１〜５１，４７１で表されるＲＨＣＥ ｃＤＮＡ、およびゲノムクローンHS46
9D22 塩基５１，４７２〜８４，８１１で表されるＲＨＣＥ５’フランキング領
域により規定される。
【００２３】 本発明のこの構造内において、上流Ｒｈｅｓｕｓボックスは、ＲＨＤ遺伝子の
５’側に位置するが、下流Ｒｈｅｓｕｓボックスは、ＲＨＤ遺伝子とＳＭＰ１遺
伝子との間に位置する。あるいはまた、用語「核酸分子構造」は、ここで述べる
（referenced）Ｒｈｅｓｕｓボックスのみを含有してなるＤＮＡセグメントに関
する。あるいはまたさらに、この用語は、ＲＨＤ、ＳＭＰ１およびＲＨＣＥ遺伝
子と２つのＲｈｅｓｕｓボックス、すなわち上流Ｒｈｅｓｕｓボックスおよび下
流ＲＨＤボックスとを含有してなるＤＮＡセグメントに関する。あるいはまたさ
らに、この用語は、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックス、ＳＭＰ１遺伝子とＲＨ
ＣＥ遺伝子とを含有してなるＤＮＡセグメントを含む。あるいはまた、該用語は
、ＳＭＰ１遺伝子およびハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスを含有してなるＤＮ
Ａセグメントに関する。あるいはまた、この用語は、上流Ｒｈｅｓｕｓボックス
とＲＨＤと下流ＲｈｅｓｕｓボックスとＳＭＰ１とを含有してなるＤＮＡセグメ
ントに関する。
【００２４】 あるいはまた、この用語は、下流ＲｈｅｓｕｓボックスとＳＭＰ１とを含有し
てなるＤＮＡセグメントに関する。特許請求の範囲に記載された主題をより充分
に理解するために、後に図１および７で言及する。
【００２５】 本発明では、用語「核酸分子構造」はまた、核酸プローブがハイブリダイズし
うる、上述の核酸構造の任意の可能な誘導体を含む。換言すれば、本発明の構造
は、合成または半合成的手段により調製してもよく、したがって、ペプチド核酸
からなるか、ペプチド核酸を含有してなる。該用語はまた、核酸分子の意味合い
ももつ。
【００２６】 本発明では、用語「Ｒｈｅｓｕｓボックス」は、５’および３’末端でＲＨＤ
遺伝子をフランキングする上流および下流ＤＮＡセグメントをいう。３つのＲｈ
ｅｓｕｓボックスが、そのヌクレオチド配列により規定される。ハイブリッドＲ
ｈｅｓｕｓボックスは、一態様においてGenBank 寄託番号AL252313 塩基３３〜
９，１８０で表される。介在ＲＨＤ遺伝子を有する２つのＲｈｅｓｕｓボックス
は、一態様においてGenBank 寄託番号AL252311 塩基３４〜９，１７５で表され
る上流Ｒｈｅｓｕｓボックス、および一態様においてGenBank 寄託番号AL252312
塩基２３〜９，１７７で表される下流Ｒｈｅｓｕｓボックスからなる。添付の
実施例において例示するように、前記Ｒｈｅｓｕｓボックスは、好ましくは、約
９０００ｂｐ長であり、９８．６％同一性を有し、同一方向である。本発明では
、上流および下流Ｒｈｅｓｕｓボックスは、少なくとも９５％相同である。これ
らのＲｈｅｓｕｓボックスの長さはさまざまでありうる。他の構造的特徴のうち
、多数の反復エレメントのいくつかが縦列に配列されて（tandem array）構成さ
れており、（配列の）伸長および欠失事象が生じやすいことが知られているため
、Ｒｈｅｓｕｓボックスの長さはさまざまでありうることが期待される。かかる
事象が起こると、Ｒｈｅｓｕｓボックスの長さは、１，０００ヌクレオチド長未
満まで縮小されうるか、または２０，０００ヌクレオチド長を超えるまで伸長さ
れうる。
【００２７】 本発明では、用語「同一性」は、ＢＬＡＳＴなどの適切なアラインメント・プ
ログラムを用いて同定される配列の決定をいう。
【００２８】 先に指摘したように、分子レベルでのＲＨＤ陰性の診断的解析は、これまで、
ＲＨＤ／ＲＨＣＥ遺伝子座の全体構造が未知であるという事実により妨げられて
いた。ここで、驚くべきことに、２つの遺伝子、ＲＨＤおよびＲＨＣＥが正反対
の方向であり、３’末端で互いに対向していることがわかった。本発明では、Ｒ
ＨＤ遺伝子が２つの高度に相同なＲｈｅｓｕｓボックスにより囲まれていること
がさらにわかった。ＲＨＤとＲＨＣＥとの間の物理的距離は、約３０，０００ｂ
ｐであり、その間にＲｈｅｓｕｓボックスおよびＳＭＰ１遺伝子が存在する。優
勢ＲＨＤ陰性ハプロタイプにおけるＲＨＤ欠失のブレークポイントは、Ｒｈｅｓ
ｕｓボックスの１，４６３ｂｐ同一性領域に位置する。類似のＲＨＤ欠失事象は
、高度に相同なＲｈｅｓｕｓボックス内の任意の他の領域を伴いうる。したがっ
て、一般的なＲＨＤ欠失以外のＲＨＤ欠失を含有するブレークポイントの領域は
、先に定義したＲｈｅｓｕｓボックス内の任意の位置に生じうることが予測され
る。
【００２９】 ２つのＲＨ遺伝子が正反対の方向であることは、ＭＮＳおよびＲＨ血液型にお
けるハイブリッド遺伝子特徴の違いの説明となる。ＭＮＳ抗原をコードするグリ
コホリン遺伝子は同じ向きで存在し（Onda, Gene 159:225, 1995）、多くの組換
えが、単一のハイブリッド遺伝子をもたらす不等乗り換えとして説明されうる（
Blumenfeld, Hum. Mutat. 6:1999, 1995）。上述した驚くべき所見に基づき、Ｒ
ＨＤ陰性をもたらす分子レベルでの事象は、今ではより完全に理解することがで
きる。ＲＨ遺伝子座では、互いに逆方向の配列は、不等乗り換えを誘起しにくく
、この事象が起こった場合は、機能性ハイブリッド遺伝子は生じ得ない。ＲＨ遺
伝子座での不等乗り換えがほとんどないという結論は、先に知得された（note）
ように（Wagner, Blood 91:2157, 1998）、ほとんどのＲＨハイブリッド遺伝子
がＲＨＤ−ＣＥ−ＤまたはＲＨＣＥ−Ｄ−ＣＥ型であり、cisに位置する相同Ｄ
ＮＡのストレッチ（stretches）を含むという説明となる。現在、ＲＨ遺伝子シ
ステムは、２つの遺伝子が反対方向である唯一充分に調査された遺伝子座であり
、ゲノム全体において頻度に存在する、隣接する逆方向遺伝子（neighboring, o
ppositely oriented genes）の進化のモデルシステムとなっている。
【００３０】 ＲＨ遺伝子座の構造（図１）に基づいて、ＲＨＤ遺伝子欠失事象の節減（pars
imonious）モデルを提案する（図７）。出願人は、理論に拘束されることを望ま
ないが、ＲｈＤ陰性の発生に関して以下のことが信じられている。ＲＨＤ欠失は
、ＲＨＤ遺伝子を囲む（embracing）高度に相度なＲｈｅｓｕｓボックスにより
引き起こされる不等乗り換えにより説明されうる。上流および下流Ｒｈｅｓｕｓ
ボックスの同一性領域内のブレークポイントの領域が関与する欠失事象をもたら
す乗り換えがおこると、ＲＨＤ−陰性のハイブリッド型Ｒｈｅｓｕｓボックスが
生じる。したがって、ハイブリッドＲＨＤボックスは、下流ＲＨＤボックス由来
３’側部分に融合した上流ＲＨＤボックス由来５’側部分を特徴とする。好まし
い一態様では、ブレークポイントの領域は９０３ｂｐ長である。この好ましいハ
イブリッドＲｈｅｓｕｓボックスの配列を図５に示す。実施例に記載した具体的
な態様では、Ｒｈｅｓｕｓボックス内の該９０３ｂｐブレークポイントの領域は
、相同性９９．９％の１，４６３ｂｐストレッチに位置し、ＴＨＥ−１Ｂヒト転
位因子およびＬ２反復ＤＮＡエレメント（図４）に類似する。興味深いことに、
ＲＨＤ陰性ハプロタイプにおいて欠失している＞６０，０００ｂｐのＤＮＡセグ
メントは、ＲＨＤ陽性ハプロタイプにおいて重複するすべての配列のみからなる
か、または該配列を含んでいた。
【００３１】 本明細書において上述した本発明の所見は、ＲＨ遺伝子座に関して個体の遺伝
子型の解析のための実施しやすい、または洗練された方法をいくつか確立するこ
とを可能にする。かかる方法の例を本明細書において以下に提供する。
【００３２】 優勢ＲＨＤ陰性ハプロタイプをもたらす分子機構は、今や明らかであるが、ど
の程度古い重複事象が、ＲＨＤ陽性におけるＲＨ遺伝子の構造を生じたのかはあ
まり明確でない。２つのＲｈｅｓｕｓボックス全体の相同性は、ＲＨ遺伝子のも
のと非常に類似しているため、ＲｈｅｓｕｓボックスおよびＲＨ遺伝子の重複は
、おそらく、単独事象として起こった。理論に拘束されないが、ＲＨＤ重複が、
ほぼ（near）完全長の重複ＴＨＥ−１Ｂトランスポゾン様ヒトエレメントの挿入
片との因果関係に由来すると推測することは興味深い。しかしながら、ＴＨＥ−
１Ｂエレメントのオープン・リーディング・フレームは、おそらく重複の時点で
は非機能性であった。
【００３３】 本発明の好ましい態様では、該核酸分子構造は、一般的なＲＨＤ陰性ハプロタ
イプの代表例である。
【００３４】 本発明では、用語「表す」は、配列上および構造上の特徴を共有する一群の分
子構造に構造を関連させるために、該特徴のすべてを含有する核酸分子構造に関
する。上述の好ましい態様では、該特徴により一般的なＲＨＤ陰性ハプロタイプ
が生じる。本文脈において、これは、好ましくは、上流Ｒｈｅｓｕｓボックスと
下流Ｒｈｅｓｕｓボックスとの間に位置する全ＲＨＤ遺伝子およびその５’側領
域を含むＲＨＤ遺伝子の欠失を意味する。
【００３５】 本文脈において、これはまた、ＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物の発現を終結ま
たは消去する、ＲＨＤ遺伝子内の例えばナンセンス変異、ミスセンス変異、スプ
ライス部位変異、部分欠失、部分挿入、部分逆位またはその組合せを共有するす
べての構造がＲＨＤ陰性ハプロタイプの代表例であることを意味しうる。
【００３６】 用語「ハプロタイプ」は、母方または父方の単一の染色体上の規定領域内の一
連の連鎖対立遺伝子に関する。
【００３７】 用語「一般的なＲＨＤ陰性ハプロタイプ」は、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボッ
クスを含有してなる任意のＲｈＤ抗原陰性ハプロタイプをいう。好ましくは、上
流Ｒｈｅｓｕｓボックスと下流Ｒｈｅｓｕｓボックスとの間に位置する全ＲＨＤ
遺伝子およびその５’側領域を含むＤＮＡセグメントが欠失している。
【００３８】 別の態様では、本発明は、一般的なＲＨＤ陰性ハプロタイプにおけるＲＨＤ欠
失のブレークポイントの領域にフランキングする２つのＲｈｅｓｕｓボックスで
ある核酸分子構造に関する。
【００３９】 本発明では、用語「ＲＨＤ欠失のブレークポイントの領域」は、ＲＨＤ欠失に
関与する異なるＤＮＡセグメントをいう。先に示したように、該欠失は、上流お
よび下流Ｒｈｅｓｕｓボックスの両方が関与する不等乗り換え事象、散在配列の
欠失および最終的な核酸分子構造の発生の結果であり得（上流および下流Ｒｈｅ
ｓｕｓボックスからよりよく範囲規定するために、記載のＲｈｅｓｕｓボックス
をハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスともよぶ）、ここで、上流ＲＨＤボックス
の５’側部分は、下流ＲＨＤボックスの３’側部分に空間的に隣接している。上
述し、かつ図７および４に示すように、この領域は、好ましくは、９０３ｂｐ長
であり、Ｒｈｅｓｕｓボックス内の１，４６３ｂｐストレッチ内に位置し、この
セグメントにおいて９９．９％相同性を有しうる。別の好ましい代替例では、該
領域は、該９０３ｂｐ断片より下流に位置するが、なお該１４６３ｂｐストレッ
チ内に含まれる。好ましくは、該断片は、５５６〜５６０ｂｐ長である。実際の
ブレークポイントは、上流Ｒｈｅｓｕｓボックスおよび下流Ｒｈｅｓｕｓボック
スがそれぞれの個体において異なるように変わり得る。しかしながら、本発明で
は、任意の場合のブレークポイントが上流および下流Ｒｈｅｓｕｓボックスに存
在しうる。
【００４０】 ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスは、ＲＨＤ−陰性ハプロタイプの解析に特
に有用である。例えば、ＲＨＤ欠失の結果生じた、ブレークポイントを含有する
核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用しうる。かかるオリゴ
ヌクレオチドは、欠失事象を示すために実際のブレークポイントの領域の５’側
および３’側に位置する、好ましくは２０ヌクレオチドを含む有意な（signific
ant）部分とハイブリダイズする必要があることが理解される。例えば、かかる
オリゴヌクレオチドが０．２×ＳＳＣ、０．１ ＳＤＳ、６５℃、プローブが９
４３ヌクレオチド長などのストリンジェント条件下でハイブリダイズする場合、
ハイブリダイズ領域は、ブレークポイントの３’側および５’側とハイブリダイ
ズする部分を含むべきである。
【００４１】 例えば、Ｒｈｅｓｕｓボックスまたはブレークポイントの領域を含むその部分
を増幅する。その後、増幅産物を、約６ヌクレオチド長以上のオリゴヌクレオチ
ドとのハイブリダイゼーションにより、配列特異的にアッセイする。
【００４２】 好ましくは、Ｒｈｅｓｕｓボックスまたはブレークポイントの領域を含むその
部分を表すＤＮＡのストレッチを２種類のプライマーを用いて増幅する。一方の
プライマーは、Ｒｈｅｓｕｓボックス内の同一性領域の５’側に位置し得、上流
ＲｈｅｓｕｓボックスおよびハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスの両方に特異的
である。他方のプライマーは、Ｒｈｅｓｕｓボックス内の同一性領域の３’側に
存在し得、下流ＲｈｅｓｕｓボックスおよびハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックス
の両方に特異的である。この適用（application）では、期待する大きさの増幅
産物の存在は、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスの存在を示し、したがってＲ
ＨＤ欠失を示す。
【００４３】 プライマーの別の可能な組合せは以下の通りである。一方のプライマーは、Ｒ
ｈｅｓｕｓボックス内の同一性領域の５’側に位置し得、上流Ｒｈｅｓｕｓボッ
クスおよびハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスの両方に特異的である。他方のプ
ライマーは、Ｒｈｅｓｕｓボックス内の同一性領域の３’側に位置し得る。この
適用では、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスの存在は、Ｒｈｅｓｕｓボックス
の同一性領域の３’側のＤＮＡストレッチに関する増幅産物の部分の特異性を調
べることにより決定される。これは、例えば、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボック
スおよび下流Ｒｈｅｓｕｓボックスとハイブリダイズするが、上流Ｒｈｅｓｕｓ
ボックスとはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーシ
ョンにより、またはハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスおよび下流Ｒｈｅｓｕｓ
ボックスを切断するが上流Ｒｈｅｓｕｓボックスは切断しない制限酵素での消化
により、またはハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスおよび下流Ｒｈｅｓｕｓボッ
クスを切断しないが上流Ｒｈｅｓｕｓボックスは切断する制限酵素での消化によ
り、または塩基配列決定により行ないうる。
【００４４】 プライマーの別の可能な組合せは以下の通りである。一方のプライマーは、Ｒ
ｈｅｓｕｓボックス内の同一性領域の５’側に位置し得る。他方のプライマーは
、Ｒｈｅｓｕｓボックス内の同一性領域の３’側に位置し得、下流Ｒｈｅｓｕｓ
ボックスおよびハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスの両方に特異的である。この
適用では、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスの存在は、Ｒｈｅｓｕｓボックス
の同一性領域の５’側のＤＮＡストレッチに関する増幅産物の部分の特異性を調
べることにより決定される。これは、例えば、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボック
スおよび上流Ｒｈｅｓｕｓボックスとハイブリダイズするが、下流Ｒｈｅｓｕｓ
ボックスとはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーシ
ョンにより、またはハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスおよび上流Ｒｈｅｓｕｓ
ボックスを切断するが下流Ｒｈｅｓｕｓボックスは切断しない制限酵素での消化
により、またはハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスおよび上流Ｒｈｅｓｕｓボッ
クスを切断しないが下流Ｒｈｅｓｕｓボックスは切断する制限酵素での消化によ
り、または塩基配列決定により行ないうる。
【００４５】 ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスはまた、ハイブリッドボックスの１種以上
の態様に特異的な抗−ＤＮＡ抗体、ｓｃＦｖＦａｂまたはＦ(ａｂ’)2断片など
の該抗体の断片もしくは誘導体またはアプタマーなどを用いて解析した場合のＲ
ＨＤ欠失の存在の診断用ツールとして役立ち得る。したがって、抗体、その断片
もしくは誘導体またはかかるアプタマーは、従来技術に従って当業者により作製
されうる（例えば、 HarlowおよびLane, "Antibodies, A Laboratory Manual",
CSH Press 1988, Cold Spring Harborを参照のこと）。
【００４６】 好ましい態様では、本発明は、上流Ｒｈｅｓｕｓボックス、下流Ｒｈｅｓｕｓ
ボックスまたはその両方が関与するＲＨＤ遺伝子欠失を含有する、ＲＨＤ陰性ハ
プロタイプを表す核酸分子構造に関する。
【００４７】 本発明は、さらに、一般的なＲＨＤ陰性ハプロタイプにおいてＲｈｅｓｕｓボ
ックスにフランキングする核酸分子構造に関する。これらの構造または配列は、
ＲＨＤ遺伝子座の分子解析のためのロングレンジ（long range）ＰＣＲなどの増
幅反応のためのプライマーを誘導するのに使用しうる。
【００４８】 例えば、Ｒｈｅｓｕｓボックスおよびそのフランキング領域の部分またはブレ
ークポイントの領域を含むその部分の代表的なＤＮＡのストレッチは、２種類の
プライマーを用いて増幅する。一方のプライマーは、Ｒｈｅｓｕｓボックスの５
’フランキング領域内に位置し得る。あるいはまた、このプライマーは、Ｒｈｅ
ｓｕｓボックス内の同一性領域の５’側に位置し得、上流Ｒｈｅｓｕｓボックス
およびハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスの両方に特異的である。他方のプライ
マーは、Ｒｈｅｓｕｓボックス内の３’フランキング領域内に存在し得る。ある
いはまた、このプライマーは、Ｒｈｅｓｕｓボックス内の同一性領域の３’側に
位置し得、下流ＲｈｅｓｕｓボックスおよびハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックス
の両方に特異的である。この適用では、期待する大きさの増幅産物の存在は、ハ
イブリッドＲｈｅｓｕｓボックスの存在を示し、したがってＲＨＤ欠失を示す。
【００４９】 プライマーの別の可能な組合せは以下の通りである。一方のプライマーは、Ｒ
ｈｅｓｕｓボックスの５’フランキング領域内に位置し得る。他方のプライマー
は、Ｒｈｅｓｕｓボックス内の同一性領域の３’側に位置し得る。この適用では
、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスの存在は、Ｒｈｅｓｕｓボックスの同一性
領域の３’側のＤＮＡストレッチに関する増幅産物の部分の特異性を調べること
により決定される。これは、例えば、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスおよび
下流Ｒｈｅｓｕｓボックスとハイブリダイズするが、上流Ｒｈｅｓｕｓボックス
とはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによ
り、またはハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスおよび下流Ｒｈｅｓｕｓボックス
を切断するが上流Ｒｈｅｓｕｓボックスは切断しない制限酵素での消化により、
またはハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスおよび下流Ｒｈｅｓｕｓボックスを切
断しないが上流Ｒｈｅｓｕｓボックスは切断する制限酵素での消化により、また
は塩基配列決定により行ないうる。
【００５０】 プライマーの別の可能な組合せは以下の通りである。一方のプライマーは、Ｒ
ｈｅｓｕｓボックス内の同一性領域の５’側に位置し得る。他方のプライマーは
、Ｒｈｅｓｕｓボックスの３’フランキング領域内に位置し得る。この適用では
、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスの存在は、Ｒｈｅｓｕｓボックスの同一性
領域の５’側のＤＮＡストレッチに関する増幅産物の部分の特異性を調べること
により決定される。これは、例えば、ハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスおよび
上流Ｒｈｅｓｕｓボックスとハイブリダイズするが、下流Ｒｈｅｓｕｓボックス
とはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによ
り、またはハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスおよび上流Ｒｈｅｓｕｓボックス
を切断するが下流Ｒｈｅｓｕｓボックスは切断しない制限酵素での消化により、
またはハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスおよび上流Ｒｈｅｓｕｓボックスを切
断しないが下流Ｒｈｅｓｕｓボックスは切断する制限酵素での消化により、また
は塩基配列決定により行ないうる。
【００５１】 好ましい態様では、核酸分子構造は、ＲＨＤ陽性ハプロタイプを表す。
【００５２】 用語「ＲＨＤ陽性ハプロタイプ」は、ＲＨＤ遺伝子に特異的なＤＮＡ配列を含
有する任意のハプロタイプをいう。
【００５３】 好ましい態様では、本発明は、一般的なＲＨＤ陽性ハプロタイプを表す核酸分
子構造に関する。
【００５４】 別の好ましい態様では、核酸分子構造は、血清学的にはＲｈＤ陰性に分類され
るＲＨＤ陽性ハプロタイプを含有する試料に由来する。
【００５５】 本発明の文脈において、用語「血清学的にＲｈＤ陰性に分類される」とは、例
えば常套的な血清学的アッセイを用い、ＲｈＤ抗原の存在について試験した結果
が陰性であった試料をいう。
【００５６】 特に好ましい態様では、ＲｈＤ陰性に分類される試料は、カフカス人(Caucasi
an)集団から得られる。
【００５７】 別のより好ましい態様では、核酸分子構造は部分ＲＨＤ欠失を含有する。
【００５８】 通常ＲＨＤ陽性であると診断される対立遺伝子がＲｈＤ−陰性表現型を生じる
ことの説明の１つは、ＲＨＤ遺伝子の部分の欠失、またはＰＣＲなどの標準的診
断方法により検出されないＲＨＣＥ遺伝子由来の対応ＤＮＡセグメントによるＲ
ＨＤ遺伝子の部分の置換である。
【００５９】 好ましい態様では、該欠失または置換は、ＣｃｄｄＥｅ表現型を生じるＲＨＤ
エキソン３〜７もしくは４〜７、または１〜９を含有する。
【００６０】 最も好ましい態様では、該置換は、ＲＨＤ−ＣＥ（３〜７）−Ｄハイブリッド
遺伝子、ＣｃｄｄＥｅ表現型を生じる。ＲＨＤ−ＣＥ（４〜７）−Ｄハイブリッ
ド遺伝子、またはＲＨＣＥ（１〜９）−Ｄ（１０）ハイブリッド遺伝子（これら
はすべてＲｈＤ陰性表現型と相関する）を含有する。
【００６１】 別の最も好ましい態様では、本発明の核酸分子構造は、ＣｄｅSハプロタイプ
に代表的であるが他のＲｈｅｓｕｓハプロタイプにも存在するＲＨＤ−ＣＥ−Ｄ
ハイブリッド対立遺伝子を含有し、イントロン３に位置する５’側ブレークポイ
ント領域（該ブレークポイント領域の配列を図１２に示す）および/またはイン
トロン７に位置する５’側ブレークポイント領域（該ブレークポイント領域の配
列を図１３に示す）または両方のブレークポイント領域を保有する。
【００６２】 ｒ'Sとしても知られるＣｄｅSは、最初に、抗原ｅの代わりに抗原ｅSを発現し
、抗原ｃを発現し、低減および改変された抗原Ｃを発現するとして特徴付けられ
た、Ｃｄｅに類似するＲＨハプロタイプである（Issitt, P.D. Aplied Blood Gr
oup Serology, Miami: Montgomery Scientific Publications, 1985, 239頁）。
このハプロタイプの下地となる分子構造は最近明らかにされた（Blunt, T., Ｄa
niels, G.およびCarritt, B. Serotype switching in a partially deleted RHD
gene. Vox Sang. 67:397-401, 1994； Faas, B.H.W., Becker, E.A.M., Wildoe
r, P., Ligthart, P.C., Overbeeke, M.A.M., Zondervan, H.A., von dem Borne
, A.E.G.K.およびvan der Schoot, C.E. Molecular background of VS and weak
C expression in blacks. Transfusion 37:38-44, 1997; Daniels, G.L., Faas
, B.H., Green, C.A., Smart, E., Maaskant-van Wijk, P.A., Avent, N.D., Zo
ndervan, H.A., von dem Borne, A.E., and van der Schoot, C.E. The VS and
V blood group polymorphisms in Africans: a serologic and molecular analy
sis. Transfusion 38:951-958, 1998.）。ＣｄｅSハプロタイプは、抗原Ｃ免疫
反応性をコードするＲＨＤ−ＣＥ−Ｄハイブリッド遺伝子を含み、ここでエキソ
ン４〜７はＲＨＣＥに由来し、エキソン３はＲＨＤ様構造を有するがＲＨＣＥ特
異的Ｔｈｒをコドン１５２に保持する。
【００６３】 ＲｈＤ陰性個体に存在するいくつかのさらなるＲＨＤ陽性対立遺伝子が、これ
までに部分的または完全に特性付けされている（表１０）。公表されたこれらの
１０個のＲＨＤ対立遺伝子のうち３個が、ＲＨＣＥ特異的ストレッチが少なくと
もエキソン４〜７を含むＲＨＤ−ＣＥ−Ｄハイブリッド対立遺伝子であった。こ
れらの３個のハイブリッドＲＨＤ対立遺伝子の各々について、パートナーが適合
性でありうる対立遺伝子が見出された（表１０）。本研究で観察された７個のＲ
ｈＤ陰性パターンのうち、６個がかかるタイプのハイブリッドＲＨＤ対立遺伝子
と適合性であった。公表された１０個のＲＨＤ対立遺伝子のうち７個が、欠失、
ナンセンス変異または偽遺伝子を提示した。これらの対立遺伝子は本研究におい
て存在せず、これは、それらが白色系人種に稀であることを示す。別の態様では
、本発明は、これまでＲＨＤエキソン９陰性といわれており（Gassner, Transfu
sion 37:1020ff, 1997）、好ましくは、イントロン７およびイントロン８の部分
におけるＲＨＤ特異的配列の欠失によりハイブリッドＲＨＤ−ＣＥ（９）−Ｄハ
イブリッド対立遺伝子を提示するＲＨＤ対立遺伝子の検出または決定を提供する
。本方法で実施される具体的な工程は、本明細書に記載される本発明のさらなる
方法で言及される任意の工程の単独または組み合せでありうる。
【００６４】 特に好ましい態様では、本発明の核酸分子構造における本発明のＲＨＤ−ＣＥ
−Ｄハイブリッドが、抗原Ｃ反応性を有するポリペプチドをコードする。
【００６５】 抗原Ｃは、当該技術分野において公知のＲＨ血液型にシステムに属する血液型
抗原であり、ＩＳＢＴ命名法にしたがって００４．００２で指定される。免疫血
液学に関する多くのテキストブック、例えば、Reid, M.E.およびLomas-Francis,
C. The Blood Group Antigen Facts Book, San Diego: Academic Press, 1997
に記載がある。
【００６６】 さらに、本発明の好ましい態様では、本発明の核酸分子構造、またはＲＨＤ遺
伝子に由来する核酸分子は、ＲＨＤ遺伝子のコード領域内または５’または３’
スプライス部位内に一塩基置換を含有する。
【００６７】 用語「ＲＨＤ遺伝子に由来する核酸分子」は、この核酸分子が、ＲＨＤ遺伝子
に由来するが、コード領域、任意のスプライス部位または非コード領域内に変異
、欠失、挿入、置換または重複を含有することを意味するものとする。好ましく
は、該核酸分子は異常型ポリペプチドを生じる。
【００６８】 さらに好ましい態様では、該塩基置換は、コドン１６に終止コドンを生じる。
【００６９】 より好ましい態様では、該置換遺伝子は、ＲＨＤ（Ｗ１６Ｘ）変異を生じる。
【００７０】 さらにより好ましい態様では、該置換はヌクレオチド４８位でのＧ Ａ置換で
ある。
【００７１】 本発明のさらに好ましい態様では、該塩基置換は、コドン３３０に終止コドン
を生じる。
【００７２】 本発明のより好ましい態様では、該置換はＲＨＤ（Ｙ３３０Ｘ）変異を生じる
。
【００７３】 本発明のさらにより好ましい態様では、該置換は、ヌクレオチド９８５位での
ＣからＧへの置換である。
【００７４】 本発明の別の好ましい態様では、該置換はコドン２１２にミスセンス変異を生
じる。
【００７５】 本発明の別の好ましい態様では、該置換は、ＲＨＤ（Ｇ２１２Ｖ）ミスセンス
変異を生じる。
【００７６】 本発明のより好ましい態様では、該置換は、ヌクレオチド６３５位におけるＧ
からＴへの置換である。
【００７７】 本発明の別の好ましい態様では、該置換は、エキソン８／イントロン８境界に
コンセンサススプライス部位を含有する４ヌクレオチド配列、６−ヌクレオチド
配列または８−ヌクレオチド配列内での変異を生じる。
【００７８】 本発明の別のより好ましい態様では、該置換はＲＨＤ（Ｇ１１５３（＋１）Ａ
）変異を生じる。
【００７９】 本発明のさらにより好ましい態様では、該置換は、イントロン８の５’スプラ
イス部位でのＡＧｇｔからＡＧａｔへの置換である。
【００８０】 さらにより好ましい態様では、本発明の核酸分子構造またはＲＨＤ遺伝子に由
来する核酸分子はＲｈＤ−陰性表現型と相関する。
【００８１】 本発明の別の好ましい態様では、該置換は、エキソン３／イントロン３境界の
コンセンサススプライス部位を含有する４−ヌクレオチド、６−ヌクレオチド配
列または８−ヌクレオチド配列内での変異を生じる。
【００８２】 本発明のさらに好ましい態様では、該置換は、ＲＨＤ（Ｇ４８６（＋１）Ａ）
変異を生じる。
【００８３】 本発明のさらにより好ましい態様では、該置換は、イントロン３の５’スプラ
イス部位でのＡＣｇｔからＡＣａｔへの置換である。
【００８４】 本発明のさらに好ましい態様では、該置換は、エキソン９／イントロン９境界
のコンセンサススプライス部位を含有する４−ヌクレオチド配列、６−ヌクレオ
チド配列または８−ヌクレオチド配列内での変異を生じる。
【００８５】 別の好ましい態様では、該置換は、ＲＨＤ（Ｋ４０９Ｋ）変異を生じる。
【００８６】 本発明のさらにより好ましい態様では、該置換は、イントロン９の５’スプラ
イス部位でのＡＧｇｔからＡＡｇｔへの置換である。
【００８７】 本発明のより好ましい態様では、本発明の核酸分子構造またはＲＨＤ遺伝子に
由来する核酸分子はＤel−表現型と相関する。
【００８８】 上述のことを要約して述べると、ＲＨＤ陽性対立遺伝子は、Ｄ−抗原発現の終
結または低減をもたらす一塩基置換を保有しうる。本発明において開示される改
良された検出方法を用い、ＲｈＤ陰性において、これまで記載されていなかった
４個のＲＨＤ陽性対立遺伝子を見出した。２個の対立遺伝子、ＲＨＤ（Ｗ１６Ｘ
）およびＲＨＤ（Ｙ３３０Ｘ）は、完全なＲｈＤタンパク質の発現を妨げる終止
コドンを保有する。３個の対立遺伝子において、正確なスプライシングおよびＲ
ｈＤ発現を妨げ得るスプライス部位変異が見出された。
【００８９】 試験された全RHD PCR法において、これらのアレレは、RHD陽性に分類され、正
確な抗原D予測は、これらのアレレ又はこれらのアレレに連動した多型の特異的
検出を必要とする。
【００９０】 以前、RHD同型接合体とRHD異型接合体との区別化は、困難であった。優勢なRH
D陰性アレレは、特異的に検出されなかった(Flegel, Transfus. Med. 8:281, 19
98; Cossu, Electrophoresis 17:1911, 1996)。本発明により見出された前記規
定された変異は、優勢なRHD陰性ハプロタイプの検出の基礎を提供するため、今
や、真のRHD遺伝子タイピングが、実施できる。
【００９１】 また、本発明は、当該技術分野で公知の技術、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖
反応(PCR)、より好ましくは、PCR-RFLP、PCR-SSP又はロング−レンジ（long ran
ge）PCRなどの増幅反応により、任意の構造的特徴又は塩基配列又は前記核酸配
列分子構造の療法又はそれらの組合せを利用することによる、試料中のRHD陰性
ハプロタイプの特異的検出方法に関する。
【００９２】 前記PCR-RFLP法及びロングレンジPCR法は、Rhesusボックス配列又はRhesusボ
ックス隣接配列のいずれかを利用する。同じDNAストレッチ又はそれらの組合せ
を利用することにより、他の方法、PCR-SSO又はバイオチップなどが開発され、
適用される。
【００９３】 本発明の1つの好ましい態様において、前記共通のRHD陰性ハプロタイプの特異
的検出方法は、下記ステップ： (a) 血液試料又は血液ドナーからDNAを単離するステップ、 (b) PCRを行なうように、ストリンジェントな条件下に、少なくとも２つの逆に
向き合うプライマーをDNAにハイブリダイズさせるステップ、 (c) 標的配列を増幅するステップ、 (d) ゲルで増幅産物を分離するステップ、及び (e) 増幅物(amplicon)を解析するステップ、 を含む。
【００９４】 前記試料は、血液、血清、痰、糞便又は他の体液であってもよく、由来するも
のであってもよい。解析対象の試料は、処理して抽出物としたもの、とりわけ、
核酸であってもよい。好ましくはEDTA凝集血液試料又はクエン酸凝集血液試料か
らのDNAの単離は、改良塩析法、続くGassner, Transfusion 37: 1020, 1997に記
載の標準技術により、行なわれうる。プライマーは、好ましくは、天然に生じた
オリゴヌクレオチド又は精製制限消化物又は合成的に生産されたオリゴヌクレオ
チドのいずれかである。プライマーは、本発明の方法における効率を最大にする
ために、好ましくは、一本鎖であり、好ましくは、オリゴデオキシリボヌクレオ
チドである。当業者に周知の技術である高速液体クロマトグラフィー(HPLC)又は
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を含む前記プライマーの精製は、本発明
の方法における前記プライマーの使用に先立ち、一般的に認識される。PCR又はL
CRなどの増幅方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Flegel, Tran
sfusion Medicine 8 (1998), 281-302; Maaskant, Transfusion 38 (1998), 101
5-1021及びLegler, Transfusion (1996), 426-31に記載される。
【００９５】 本発明によれば、RHD欠失を検出する好ましい方法は、エクスパンドハイフィ
デリティーPCRシステムと、Rhesusボックス同一(identity)領域の5'末端に結合
する非特異的プライマー並びにRhesusボックスの下流に特異的であり、かつRhes
usボックス同一(identity)領域の3'末端に結合するプライマーとを用いたPCR-RF
LPを行なうことである。PCR条件は、好ましくは、65 oCでのアニーリング、68oC
10分間での伸長を含む。その後、PCR増幅物(amplicon)をPstIを用いて37 oCで3
時間消化し、1％アガロースゲルを用いて、断片を分離(resolved)した。実施例1
0及び11に、さらなる好ましい方法がさらに記載される。
【００９６】 本発明の他の態様は、ハイブリッドRhesusボックスの検出を含む、共通のRHD
陰性ハプロタイプの特異的検出方法に関する。
【００９７】 ハイブリッドRhesusボックスの検出は、対応のRHDアレレの性質に関する不明
瞭でない結果を開業医に提供する。前記ハイブリッドrhesusボックスが検出され
れば、ついで、RHD遺伝子が、欠失される。前記ハイブリッドRhesusボックスの
検出は、ブレークポイント(breakpoint)を含有する領域に特異的にハイブリダイ
ズするオリゴヌクレオチドを用いることにより、優先的に行われる。ハイブリダ
イゼーションに用いられるオリゴヌクレオチドは、直接的に、ブレークポイント
のものにハイブリダイズし、かつ、さらに、前記ブレークポイントの5'及び3'の
少なくとも943ヌクレオチドにハイブリダイズする必要がある。ハイブリダイゼ
ーションは、好ましくは、0.2 X SSC、0.1% SDS、65°Cなどのストリンジェント
な条件下に起こる。ハイブリッドRhesusボックス内の実際のブレークポイントは
、推定乗換え事象の正確な性質により変動するであろう。したがって、ハイブリ
ッドRhesusボックスは、ハイブリダイゼーションに用いられる多くのオーバーラ
ップするオリゴヌクレオチド又はオーバーラップしないオリゴヌクレオチドを用
いても検出されるであろう。また、ハイブリッドRhesusボックスは、制限解析（
好ましくは、サザンブロット解析との組合せ）、又は本明細書において前述のよ
うに、PCR技術などの他のプロトコルを用いて検出することもできる。
【００９８】 さらに、本発明の他の態様は、ハイブリッドRhesusボックスとその隣接領域と
を含有した核酸分子構造を評価するステップを含む、共通のRHD陰性ハプロタイ
プの特異的検出方法に関する。
【００９９】 本発明によれば、分子核酸構造の評価は、アガロースゲル又はポリアクリルア
ミドゲルのいずれかを用いるゲル電気泳動、制限酵素による処理、サザン若しく
はノーザンブロッティングなどのブロッティング技術又はハイブリダイゼーショ
ンの蛍光ガイド検出などの関連技術及び当該技術分野で公知の他の技術などの解
析ステップを含む。
【０１００】 また、本発明は、本発明で述べられた任意のブレークポイント領域を検出する
ステップを含む、試料中のRHD陰性ハプロタイプの特異的検出方法に関する。
【０１０１】 好ましい態様では、本発明は、前記検出又は評価が、ハイブリッドRhesusボッ
クス又はその一部を含有した核酸分子の長さの決定を含む、前記方法に関する。
【０１０２】 また、本発明の方法のこの好ましい態様は、ゲル電気泳動若しくはクロマトグ
ラフィーなどの標準分離技術又は当業者に公知の塩基配列決定の標準技術を用い
る。好ましくは、本発明は、この目的のために、実施例５にさらに記載されるよ
うに、市販のシークエンシングキット及びApplied Biosystems (ABI 373A又はAB
I 377)の自動シークエンシングマシーンを用いられる。
【０１０３】 本発明の他の好ましい態様は、前記検出又は評価がPCR-RFLP、PCR-SSP若しく
はロングレンジPCR 又はハイブリッドRhesusボックス、好ましくは、ブレークポ
イント又は図4若しくは5又は図12若しくは13に記載のブレークポイント領域に特
異的にハイブリダイズするプローブあるいは上流又は下流Rhesusボックスにハイ
ブリダイズするプローブを用い、好ましくは、サザンブロット解析、ゲル電気泳
動、バイオチップ解析、分子量測定又は蛍光により、行われる、前記方法に関す
る。
【０１０４】 本発明によれば、用語「〜にハイブリダイズ」とは、ストリンジェント又は非
ストリンジェント条件をいう。条件の設定は、当業者に周知であり、例えば、Sa
mbrook, loc. cit.又は HamesとHiggins、「核酸ハイブリダイゼーション、実用
アプローチ（Nucleic acid hybridization, a practical approach）」、IRC Pr
ess, Oxford (1985)などに記載のプロトコルにしたがって、決定されるべきであ
る。特異的にハイブリダイズする配列の検出は、通常、65oCで0.2 x SSC, 0.1%
SDSなどのストリンジェントなハイブリダイズ及び洗浄条件を必要とするであろ
う。同質及び正確ではないが相補的な配列の検出のための非ストリンジェント条
件は、50°C又は65oCで6x SSC, 1% SDSで設定されてもよい。周知のように、プ
ローブの長さ及び測定対象の核酸の組成は、ハイブリダイゼーション条件のさら
なるパラメータを構成する。
【０１０５】 さらに、本発明は、本発明の核酸分子構造又は核酸分子を含有したベクターに
関する。
【０１０６】 前記ベクターは、増殖及び／又は発現のために用いられてもよく、遺伝子移入
又はターゲティング目的のためにデザインされてもよい。かかるベクターの製造
方法は、当該技術分野において周知である。同様のことが、変異を有する核酸の
前記ベクターへのクローニング、適切な宿主中でのベクターの増殖などにあては
まる。
【０１０７】 前記ベクターは、特に、本発明の核酸分子を含有するものであって、遺伝子工
学に慣用的に用いられるプラスミド、コスミド、ウイルス又はバクテリオファー
ジであってもよい。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス
、ヘルペスウイルス又はウシパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベク
ターは、本発明の核酸分子又はベクターの標的細胞集団への送達に用いられうる
。当業者に周知の方法を用いて、組換ウイルスベクターを構築することができる
；例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory (1989) N.Y. 及びAusubel, Current Protocols in Molecular
Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989
)などを参照のこと。一方、本発明のポリペプチド及びベクターは、標的細胞へ
の送達のために、リポソームに再構成されうる。本発明の核酸分子を含有したベ
クターは、宿主細胞のタイプによって異なる周知の方法により宿主細胞に導入さ
れうる。例えば、塩酸カルシウムトランスフェクションは、原核細胞に慣用的に
用いられるが、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションは、他の宿主
細胞型に用いられうる；例えば、上記Sambrookを参照のこと。
【０１０８】 かかるベクターは、適切な細胞内及び適切な条件下での前記ベクターの選別を
可能にするマーカー遺伝子などの遺伝子をさらに含有してもよい。好ましくは、
本発明の核酸分子は、原核細胞又は真核細胞中での発現を可能にする発現調節配
列に実施可能に連結される。前記ポリヌクレオチドの発現は、翻訳されうるmRNA
へのポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞にお
ける発現を保証する調節エレメントは、当業者に周知である。前記調節エレメン
トは、通常、転写開始を保証する調節配列及び任意に転写の終結と転写産物の安
定化とを保証するポリ-Aシグナルを含む。さらなる調節エレメントは、転写エン
ハンサー、翻訳エンハンサー及び／又は天然に付随する若しくは異質なプロモー
ター領域を含んでもよい。原核宿主細胞における発現を可能にする可能な調節エ
レメントとしては、例えば、大腸菌におけるPL、lac、trp又はtacプロモーター
が含まれ、真核宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例示として
は、酵母におけるAOX1又はGAL1プロモーター、哺乳動物及び他の動物細胞におけ
るCMVプロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター（ラウス肉腫ウイルス
）、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー又はグロブリンイントロンなどが含ま
れる。また、転写開始に応答するエレメントの他に、かかる調節エレメントは、
前記核酸分子の下流にSV40−ポリA部位又はtk−ポリA部位などの転写終結シグナ
ルを含んでもよい。さらに、用いられる発現系に応じて、前記ポリペプチドを細
胞内成分に向けうるリーダー配列又は培地に分泌しうるリーダー配列を、本発明
のポリヌクレオチドのコード配列に付加してもよく、前記リーダー配列は、当該
技術分野に周知である。リーダー配列は、適当な段階で翻訳、開始、終結配列で
組み立てられ、好ましくは、翻訳されたタンパク質又はその一部をペリプラズム
域又は細胞外培地に分泌させうるリーダー配列である。任意に、異質の配列は、
所望の性質、例えば、発現された組換産物の安定化又は単純化精製を与えうるC
末端又はN末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードしてもよい。このよ
うな状況下、適切な発現ベクターは、岡山−バーグcDNA発現ベクターpcDV1(Phar
macia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)、又はpSPORT1(GIBCO
BRL)など、当該技術分野に公知である。
【０１０９】 好ましくは、前記発現調節配列は、真核宿主細胞を形質転換しうるベクター又
はトランスフェクトしうるベクターでの真核プロモーター系であるが原核宿主用
の調節配列も使用されうる。
【０１１０】 また、前記のように、本発明のベクターは、遺伝子伝達又はターゲティングベ
クターであってもよい。治療用遺伝子をエクス・ビボ又はイン・ビボ技術で細胞
に取り込むことに基づく遺伝子治療は、遺伝子伝達の最も重要な応用の1つであ
る。エクス・ビボ又はイン・ビボ遺伝子治療に適したベクター及び方法は、文献
に記載され、当該技術分野に公知である；例えば、Giordano、Nature Medicine
2 (1996)、534-539；Schaper、Circ. Res. 79 (1996)、911-919；Anderson、Sci
ence 256 (1992)、808-813；Isner、Lancet 348 (1996)、370-374；Muhlhauser
、Circ. Res. 77 (1995)、1077-1086；Wang、Nature Medicine 2 (1996)、714-7
16；国際公開第94/29469号パンフレット；国際公開第97/00957号パンフレット又
はSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640及び本明細
書に記載の参考文献などを参照のこと。本発明のポリヌクレオチド及びベクター
は、細胞への直接導入又はリポソーム若しくはウイルスベクター（例えば、アデ
ノウイルス、レトロウイルス）を介する細胞への導入のためにデザインされても
よい。好ましくは、前記細胞は、生殖系細胞、胚性細胞若しくは卵細胞又はそれ
ら由来の細胞であり、最も好ましくは、前記細胞は、幹細胞である。
【０１１１】 さらに、本発明は、本発明のベクターで形質転換された非ヒト宿主に関する。
【０１１２】 適切な宿主は、トランスジェニック動物；細菌、酵母細胞、動物、好ましくは
、哺乳動物細胞、糸状菌細胞又は昆虫細胞などの細胞を含む。トランスフェクシ
ョン、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む形質転換
プロトコルも当該技術分野で周知である。
【０１１３】 さらに、本発明は、適切な条件下に本発明の宿主を培養する工程及びRHD遺伝
子のタンパク質産物を単離する工程を含む、RHD遺伝子のタンパク質産物の製造
方法に関する。
【０１１４】 RHD遺伝子のタンパク質産物は、慣例／方法にしたがって、回収されうる培養
培地に移出することが好ましい。また、本発明において用いられる用語「培養」
は、トランスジェニック動物の創出を含む。適切なベクター、構築及び任意に適
切なフィードを用いて、抗原は、例えば、トランスジェニックウシのミルクから
単離されてもよい。
【０１１５】 本発明は、さらに、本発明の核酸分子にコードされたRHD遺伝子のタンパク質
産物又は本発明の方法により製造されたRHD遺伝子のタンパク質産物に関する。
【０１１６】 好ましくは、タンパク質は、天然の抗原と同様に、翻訳後修飾され、天然の抗
原と同じ化学構造を有する。したがって、本発明の方法により製造される場合、
前記タンパク質は、好ましくは、ヒト細胞において製造される。
【０１１７】 さらに、本発明は、ストリンジェントな条件下に、前記（ミスセンス）変異若
しくは前記終止コドンを含有する本発明の核酸分子構造若しくは核酸分子の一部
、又はその相補的成分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドあるいは本明細
書上記に同定された遺伝子変換のブレークポイントにハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドに関する。
【０１１８】 本発明のこの態様において、オリグヌクレオチドは、変異配列又はブレークポ
イントに直接的にハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件の設定は、例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning, A Laborato
ry Handbook" CSH Press, Cold Spring Harbor 1989又はHames及びHiggins, "Nu
cleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press, Oxford (1985
)によく記載されている。したがって、特異的にハイブリダイズする配列の検出
は、通常、65°で0.2 x SSC, 0.1% SDS などのハイブリダイゼーション及び洗浄
条件を必要とする。周知のように、プローブの長さ及び決定対象の核酸の組成は
、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメータを構成
する。さらに、オリゴヌクレオチドは、12〜50ヌクレオチド、より好ましくは、
15〜24ヌクレオチドを含むことが好ましい。ブレークポイントへのハイブリダイ
ゼーションは、ストリンジェント又は非ストリンジェント条件下であってもよい
。非ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例示は、50°Cで4 x SSC、
0.1% SDSのハイブリダイゼーション及び洗浄である。
【０１１９】 さらに、本発明は、本発明のRHD遺伝子のタンパク質産物に特異的に結合する
抗体又はアプタマーに関する。
【０１２０】 抗体は、試験管、ゲル、固相での凝集技術及び２次抗体の存在若しくは非存在
下での捕獲技術などの当該技術分野に周知のいかなる血清学技術又は免疫蛍光エ
ンハンスメントの存在若しくは非存在下でのフローサイトメトリーで試験され、
用いられてもよい。
【０１２１】 本発明の抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗血清
に由来又は含有される抗体であってもよい。さらに、本発明により用いられる用
語「抗体」は、Fab、F(ab')2、Fv又はscFv断片などの前記抗体の断片を含む；例
えば、Harlow及びLane、"Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988,
Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと。前記抗体又はその断片は、天然起源の
ものであってもよく、（半）合成的に生産されてもよい。また、かかる合成産物
は、本発明の抗体と同じ又は実質的に同じ結合特異性を有する非タンパク質性物
質又は半タンパク質性物質（non-proteinaceous as semi-proteinaceous materi
al）を含む。かかる産物は、例えば、ペプチド模倣物により得られるであろう。
【０１２２】 用語「アプタマー」は、当該技術分野で周知であり、例えば、Osborneら, Cur
r. Opin. Chem. Biol. I (1997), 5-9 or in Stall and Szoka, Pharm. Res. 12
(1995), 465-483に定義される。
【０１２３】 さらに、本発明は、ストリンジェントな条件下に本発明のオリゴヌクレオチド
を、ヒトから得られた試料中に含有される核酸分子にハイブリダイズするステッ
プ、及び前記ハイブリダイゼーションを検出するステップを含む、変異Rhesus D
抗原をコードする核酸分子又は本発明の核酸分子構造若しくは核酸分子により特
徴づけられたRHD遺伝子の欠失を有する核酸分子の試料中における存在の試験方
法に関する。
【０１２４】 好ましくは、本発明の方法は、制限酵素で前記ハイブリダイゼーションの産物
を消化するステップ又は前記ハイブリダイゼーションの産物を制限酵素での消化
に供するステップ、及び前記消化の産物を解析するステップをさらに含む。
【０１２５】 本発明のこの好ましい態様は、慣用の手段により、有効なハイブリダイゼーシ
ョンと無効なハイブリダイゼーションとの差別化を可能にする。例えば、野生型
RHD遺伝子は、制限酵素部位を含有する場合、ハイブリダイズした産物は、適切
な制限酵素により切断され得るであろうが、変異した配列は、二本鎖産物を生じ
ないか、認識されうる制限部位を含有せず、それゆえ、切断されないであろう。
一方、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、変異された配列にハイブリダ
イズするのみであってもよい。この場合、野生型配列でなく、変異配列を含有し
たハイブリッドだけが適切な制限酵素で切断されるであろう。消化産物の解析は
、例えば、臭化エチジウムを用いた核酸の染色と任意に組み合わせてもよいゲル
電気泳動などの慣用の手法により実施されうる。サザンブロッティングなどのさ
らなる技術との組合せも考えられうる。
【０１２６】 前記ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、抗DNA二本鎖抗体により、又
は標識オリゴヌクレオチドの利用により実施されてもよい。慣用的には、本発明
の方法は、サザン又はノーザンブロッティング及び関連技術などのブロッティン
グ技術とともに行われる。標識は、例えば、標準プロトコルにより実施されても
よく、放射活性マーカー、蛍光、リン光、化学発光、酵素標識などによる標識が
挙げられる。
【０１２７】 また、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドとRHDΨ構造にハイブリダイズ
する少なくとも1つの他のオリゴヌクレオチドのいずれかを、ヒトから得られた
試料中に含有された核酸分子にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする
ステップ及び前記ハイブリダイゼーションを検出するステップを含む、本発明の
RHDΨ及びRHD分子構造の存在の同時検出方法に関する。
【０１２８】 さらに、本発明は、前記（ミスセンス）変異、前記ストップコドン又は前記ハ
イブリッド遺伝子のブレークポイントをコードする本発明の核酸分子構造又は核
酸分子の少なくとも一部の核酸配列を決定するステップ、及びRHDΨ構造の少な
くとも一部を決定するステップを含む、試料中の本発明のRHDΨ及びRHD分子構造
の存在の同時試験方法に関する。
【０１２９】 さらに、本発明は、前記（ミスセンス）変異、前記ストップコドン又は前記ハ
イブリッド遺伝子のブレークポイントをコードするものであって、かつ本発明の
核酸分子構造又は核酸分子の少なくとも一部の核酸配列を決定するステップを含
む、変異Rhesus D抗原をコードする核酸の存在又は本発明の核酸分子構造又は核
酸分子により特徴付けられたようにRHD遺伝子の欠失を有する核酸分子の試料中
における存在の同時試験方法に関する。
【０１３０】 好ましくは、本発明の方法は、前記核酸配列を決定するに先立ち、前記核酸分
子構造の少なくとも前記部分の増幅をさらに含む。
【０１３１】 さらに、本発明は、前記配列の少なくとも一部を増幅するプライマーのセット
であって、かつ増幅反応に用いられる前記プライマーの少なくとも1つが、本発
明のオリゴヌクレオチドであり、少なくとも1つのプライマーが、RHDΨ構造を（
例えば、特異的にハイブリダイズすることにより）増幅するものであるプライマ
ーのセットを用いた増幅反応を行うステップ、及び増幅産物を解析するステップ
を含む、RHDΨ及び本発明のRHD分子構造のいずれかの試料中における存在の同時
試験方法に関する。
【０１３２】 RHDΨは、Singletonら(Singleton, B.K., Green, C.A., Avent, N.D., Martin
, P.G., Smart, E., Daka, A., Narter-Olaga, E.G., Hawthorne, L.M.,及びDan
iels, G. Rh D-陰性血液群表現型のアフリカ人における37塩基対重複を含むRHD
偽遺伝子及びナンセンス変異の存在、Blood 95(1):12-18, 2000).によりキャラ
クタライズされているD陰性に検出されたRHDアレレである。
【０１３３】 さらに、本発明は、前記配列の少なくとも一部を増幅するプライマーのセット
であって、かつ増幅反応に用いられる前記プライマーの少なくとも1つが、本発
明のオリゴヌクレオチドであるプライマーのセットを用いて増幅反応を行うステ
ップを含む、変異Rhesus D抗原をコードする核酸分子又は本発明の核酸分子構造
又は核酸分子により特徴付けられたようにRHD遺伝子の欠失を有する核酸分子の
試料中における存在を同時に試験する方法に関する。
【０１３４】 さらに、さらなる態様において、本発明の方法は、前記増幅反応に用いられる
少なくとも1つのプライマーが本発明のオリゴヌクレオチドである方法である。
【０１３５】 好ましくは、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で実施される。リガーゼ連
鎖反応などの他の増幅方法も用いられてもよい。
【０１３６】 本発明の方法の好ましい態様において、前記PCRは、PCR-RFLP、PCR-SSP 又は
ロング−レンジPCRである。
【０１３７】 さらに、本発明の他の好ましい態様において、増幅産物の分子量が解析される
。分子量の前記解析は、アガロースゲル電気泳動SDS-PAGEマススペクトロメトリ
ー、この目的のためには、MALDI-TOFなどの当業者に周知である標準技術などを
用いる。
【０１３８】 本発明の方法の1つの好ましい態様において、RHD陽性アレレの検出方法は、下
記ステップ： (a) 血液試料又は血液ドナーからDNAを単離するステップ； (b) PCRを行なうように、少なくとも２つの対向するプライマーをストリンジェ
ントな条件下にDNAにハイブリダイズさせるステップ、 (c) 標的配列を増幅するステップ、 (d) ゲル上で増幅産物を分離するステップ、及び (e) 増幅物(amplicon)を解析するステップ、 を含む。
【０１３９】 種々のステップにおいて適用されるべき特定の条件に関して、本明細書で前記
の対応の記載に述べられる。
【０１４０】 好ましい態様において、RHD陽性アレレは、血清学的にRhD陰性である集団に由
来する。他の好ましい態様において、RhD陰性試料は、白人(Caucasian)集団から
選ばれる。
【０１４１】 本発明の方法は、標的配列が変異そのものであるか、少なくとも1つの変異を
有する場合、標的配列のみの増幅をもたらすであろう。これは、前記オリゴヌク
レオチドは、好ましくはストリンジェントな条件下に、野生型配列とはハイブリ
ダイズしないが（増幅産物が得られないという結果を伴う）、変異配列にのみハ
イブリダイズするであろうためである。もちろん、2つの変異配列などの1以上の
ものにハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドが、本発明の方法に用
いられるであろう。後者の態様は、変異の組合せが試験される場合に好ましいで
あろう。前記変異がほとんどないか、あるいはないことが、ミスセンス変異に必
要であることに注目することが重要である。これは、他の型の変異が、前記ミス
センス変異との組合せ、又は前記遺伝子変換との組合せで生じる場合にあてはま
るであろう。
【０１４２】 好ましくは、本発明の方法において、前記増幅又は増幅反応があるか、あるい
は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により行われる。リガーゼ連鎖反応などの他の
増幅方法も用いられるであろう。
【０１４３】 さらに、本発明は、本発明の抗体又はアプタマー又はファージへの特異的結合
について、ヒトから得られた試料をアッセイするステップを含む、本発明のRHD
遺伝子のタンパク質産物の試料中における存在の試験方法に関する。
【０１４４】 また、結合に関する試験は、ELISAなどの標準技術の実施を含むであろう；例
えば、Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988,
Cold Spring Harborなどを参照のこと。
【０１４５】 他の好ましい態様において、本発明は、直接凝集法、間接抗グロブリン試験、
モノクローナル抗D抗体及び吸着／溶出技術を用いるステップを含む、本発明の
核酸分子構造又は本発明の核酸分子をコードするRHD遺伝子のタンパク質産物の
存在の試験方法に関する。
【０１４６】 したがって、前記態様は、2つのモノクローナル抗D抗体を用いた直接凝集、他
に、オリゴクローナル抗D抗体を含有したゲルマトリックスを用いた間接抗グロ
ブリン試験、さらに他に、赤血球へのポリクローナル抗D抗体の吸収及びクロロ
ホルム技術を用いた溶出を含んでもよい。本方法のさらなる記載は、実施例１８
に示される。
【０１４７】 好ましくは、本発明の方法において、前記試料は、血液、血清、血漿、胎児組
織、唾液、尿、粘膜組織、粘液、膣組織、膣から得られた胎児組織、皮膚、毛髪
、毛包又は他のヒト組織である。
【０１４８】 さらに、本発明の方法は、好ましくは、胎児細胞を富化するステップを含む。
本富化は、適切な抗体、レクチン若しくは胎児細胞に特異的に結合する他の試薬
を用いること又は母体組織と胎児細胞との区別的分離を試みる任意の技術、例え
ば、密度勾配などにより達成されうる。また、好ましくは、前記方法において、
有利には、慣用の手法にしたがって、末梢血、血清又は血漿などの母体組織から
胎児DNA又はmRNAを抽出することもできる。
【０１４９】 本発明の方法のさらなる好ましい態様において、前記試料由来の前記核酸分子
又はタンパク質加水分解物質を固相に固定化する。
【０１５０】 好ましくは、前記固相は、チップである。
【０１５１】 チップの利点は、当該技術分野で周知であり、本明細書においては、詳細には
、論議される必要がない。これらには、小さいサイズ及び分析対象物のコンピュ
ーターに基づく解析の容易なアクセスを含む。
【０１５２】 さらに、本発明は、陰性又は陽性Rhesus D表現型の解析のための本発明の核酸
分子構造又は核酸分子の使用に関する。
【０１５３】 前記解析は、例えば、本明細書で前記した方法に基づく。
【０１５４】 また、本発明は、モノクローナル抗D若しくは抗C抗体又はポリクローナル抗D
若しくは抗C抗血清又は抗グロブリン又は抗ヒトグロブリン抗血清又はその製剤
のアフィニティー、アビディティ及び／又は反応性の評価のための、本発明の核
酸分子構造又は核酸分子、本発明のベクター又は本発明のRHD遺伝子のタンパク
質産物の使用に関する。
【０１５５】 抗Cは、抗原Cに結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
【０１５６】 また、本発明は、モノクローナル抗D若しくは抗C抗体又はポリクローナル抗D
若しくは抗C抗血清又は抗グロブリン又は抗ヒトグロブリン抗血清又はその製剤
のアフィニティー、アビディティ及び／又は反応性の評価のための、本発明の核
酸分子構造又は核酸分子を保持するプロバンド由来の細胞、好ましくは赤血球細
胞の使用に関する。
【０１５７】 前記製剤は、当業者に周知の技術にしたがって提供されうる。前記製剤は、ア
ルブミンなどの安定化剤、さらには、アジ化ナトリウム、塩イオン、緩衝液など
を含有してもよい。製剤の処方は、当該技術分野に周知のように、抗体の結合特
性に影響を有するであろう。
【０１５８】 例えば、第1のステップにおいて、キャリヤー又は血液ドナーのRhesus D遺伝
子及びそのアレレ状態を解析し、前記遺伝子が本発明により、見出される変異を
含有するかどうかを決定する。第2のステップにおいて、前記変異は、赤血球細
胞の表面における特定のRhD抗原密度に相関する。慣用的には、前記相関は、本
発明により提供されたデータ（変異自体など）及び当該技術分野に周知の技術（
例えば、Jonesら、1996、Flegel及びWagner、1996など）により確立されうる。
第3のステップにおいて、反応性、感度、アフィニティー、アビディティ及び／
又は特異性などの抗体又は抗血清の特徴は、好ましくは、分子的に、及びRhD 抗
原表面密度に関してステップ2で記載のようにキャラクタライズされた赤血球細
胞を用いた適切な血液群血清学的技術で決定されうる。かかるデータは、例えば
、性質調節、標準化などに用いられうる。
【０１５９】 本発明は、モノクローナル及びポリクローナル抗血清、好ましくは、抗Dモノ
クローナル又は抗血清のキャラクタリゼーション、標準化及び性質調節に最も有
用であろう。さらに、例えば、抗グロブリン及び抗ヒトグロブリン抗血清は、本
発明の教示に基づいてキャラクタライズされうる。適切にキャラクタライズされ
た抗Dモノクローナル抗体は、RhD診断に慣用的に用いられうる。例えば、適切に
キャラクタライズされたモノクローナル抗体は、血液細胞の表面のD抗原密度を
決定するのに有用であろう。したがって、診断に有用なモノクローナル抗体カッ
トオフ値が確立されうる。これは、RhD診断に用いられる抗体の性質調節に重要
である。
【０１６０】 したがって、本発明は、 (a) 本発明により決定されたブレークポイント又は変異の存在について、プロ
バンドの試料の核酸を試験するステップ； (b) RHD遺伝子の変異又は欠失状態とアレレ状態とに基づき、該核酸と、該プロ
バンドの赤血球細胞の表面におけるRHD遺伝子のタンパク質産物の密度とを相関
させるステップ； (c) 前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清又はその製剤と、表面
にRHD遺伝子のタンパク質産物を有する細胞とを反応させるステップ； (d) ステップ(c)で得られた結果に基づき、前記モノクローナル抗体又はポリク
ローナル抗血清又はその製剤をキャラクタライズするステップ を含む、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清又はそれらの製剤のキャ
ラクタリゼーション法にも関する。
【０１６１】 用語「アレレ状態」に関して、本用語は、プロバンドにおけるRHDアレレは、
均質、異質又は半均質状態で存在する可能性を述べる。また、2つのアレレが、
本明細書において、上記で規定された2つの異なる変異（変換を含む）を有する
可能性が、本用語により含まれる。
【０１６２】 本発明の方法の好ましい態様において、前記キャラクタリゼーションは、抗体
及び抗血清の反応性、感度、アビディティ、アフィニティー、特異性及び／又は
他の特徴の決定を含む。
【０１６３】 さらに、好ましくは、表面にRHD遺伝子のタンパク質産物を有する細胞が赤血
球細胞である方法である。
【０１６４】 また、本発明は、本発明の1以上の核酸分子構造又は核酸分子の存在について
、患者由来の試料を試験するステップを含み、ここで、2種の前記核酸分子構造
又は核酸分子についての陽性試験が、Rh陰性血液を用いた輸血が必要であること
の指標である、輸血の必要がある患者が、ドナー由来のRhD陰性血液で輸血すべ
きかどうかを決定する方法に関する。他方、前記核酸分子構造又は核酸分子の1
つの同一の2コピーの付随する存在を示す陽性試験が、Rh陰性血液を用いた輸血
の必要の指標である。
【０１６５】 一方、他の本発明のRHD陰性核酸分子構造又は核酸構造を表す1以上の核酸分子
構造又は核酸分子についての陰性試験を行うか、あるいは行わない、共通のRHD
陰性ハプロタイプを表わす核酸分子構造又は核酸分子についての陰性試験は、Rh
D陽性としてタイプづけられた血液の輸血を可能にする。目下、例えば、患者が
、実際にRhD陰性血液を用いた輸血を必要とするかどうか、又はかかる警戒が必
要でないかどうかを簡便に調べることができる。
【０１６６】 また、本発明は、ドナー由来の試料について、本発明の核酸分子構造の存在を
試験するステップを含み、ここで、本発明の核酸分子構造の陽性試験が、ドナー
の血液の輸血を排除する、ドナーの血液が、抗原Cに曝露されるべきでない輸血
の必要がある患者への輸血に適するかどうかを決定する方法に関する。
【０１６７】 さらに、本発明は、ドナー由来の試料について、本発明の1以上の核酸分子構
造又は核酸分子の存在を試験するステップを含み、ここで、他の本発明のRHD陰
性ハプロタイプを表す1以上の核酸分子構造又は核酸分子について陰性試験をと
もなうか、あるいはともなわない共通のRHD陰性ハプロタイプを表す核酸分子構
造の陰性試験が、RhD陰性としてタイプ付けられた患者へのドナーの血液の輸血
を排除する、ドナーの血液が輸血の必要がある患者への輸血に用いてもよいかど
うかを決定する方法に関する。
【０１６８】 また、本発明は、ドナー由来の試料について、1以上の本発明の核酸分子構造
又は核酸分子の存在を試験するステップを含み、ここで、2種の異なる前記核酸
分子構造又は核酸分子が、RhD陰性としてタイプ付けられた患者へのドナーの血
液の輸血の可能性の指標である、ドナーの血液が、RhD陰性としてタイプ付けら
れた患者に輸血してもよいかどうかを決定する方法に関する。
【０１６９】 他方、前記核酸分子構造又は核酸分子の1つの同一の2つのコピーの付随する存
在が、RhD陰性としてタイプ付けられた患者へのドナーの血液の輸血の可能性の
指標である。
【０１７０】 前記方法で述べられた試料は、血液、血清などの明細書を通して述べられた試
料であってもよい。
【０１７１】 前記いずれかの方法に基づき、患者に輸血するガイドラインに関して、次善の
輸血ポリシーが避けられることに、最大級のケアが、払われなけれならない。リ
スク因子は、つねに、受け持つ医者により考慮されるべきである。全ての症例に
おいて、患者の潜在的なリスクを最小化されるべきである。
【０１７２】 本発明はまた、本発明の１つ又はそれ以上の該核酸分子構造又は核酸分子の存
在について胎児の父親から得られた試料を評価する工程を含む、ＲｈＤ陽性胎児
を妊娠するか保有するＲｈＤ陰性の母親の危険性、又は新生児の溶血性疾患を発
生する危険性がある胎児を妊娠するか又は保有する抗Ｄ力価を有する母親の危険
性を評価する方法に関し、ここで通常のＲＨＤ陰性ハプロタイプを表す核酸分子
構造又は核酸分子に関する陰性試験は、本発明の他のＲＨＤ陰性ハプロタイプを
表す１つ又はそれ以上の核酸分子構造又は核酸分子に関する陰性試験のありなし
に関わらず、ＲｈＤ陽性胎児を妊娠している高い危険性を示す。
【０１７３】 本発明の方法の好ましい態様では、該核酸分子構造は、変異又は欠失を有する
。
【０１７４】 本発明はまた、本発明の１つ又はそれ以上の核酸分子構造又は核酸分子の存在
について父親に由来する試料を試験する工程を含む、父親がＲｈＤ陰性であるか
どうかを決定する方法に関し、ここで、２つの異なる該核酸分子構造又は核酸分
子についての陽性試験は、父親がＲｈＤ陰性であることを示す。
【０１７５】 あるいは、ＲＨＤ陰性ハプロタイプを表す該核酸分子構造又は核酸分子の一方
の２つの同一のコピーが同時に存在することを示す陽性試験は、父親がＲｈＤ陰
性であることを示す。
【０１７６】 さらに、本発明は、本発明の１つ又はそれ以上の該核酸分子構造又は核酸分子
の存在について男性から得られた試料をアッセイすることにより男性が子供の父
親である可能性又は尤度を評価する方法に関し、ここで試験結果は、該男性が子
供の父親である可能性又は尤度を推測するために使用される本発明のＲＨＤ陰性
ハプロタイプを表す任意の核酸分子構造又は核酸分子の同型接合性、異型接合性
又は非存在を決定するために使用される。
【０１７７】 製剤は、診断製剤又は医薬製剤であり得る。
【０１７８】 本発明の医薬組成物は、さらに薬学的に許容されうるキャリア及び／又は希釈
剤を含み得る。適切な医薬キャリアの例は、当該分野で周知であり、リン酸緩衝
化生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば、オイル／水エマルジョン、種々
のタイプの湿潤剤、無菌溶液等が挙げられる。かかるキャリアを含有する組成物
は、周知の従来の方法により製剤化されうる。これらの医薬組成物は、適切な用
量で被験体に投与されうる。
【０１７９】 非経口投与のための製剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁物、及
びエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、及びオレイン酸エチルのよう
な注射可能な有機エステルである。水性キャリアとしては、水、アルコール性／
水性溶液、エマルジョン又は懸濁物が挙げられ、生理食塩水及び緩衝化媒体が含
まれる。非経口ベヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、Ringerのデキストロー
ス、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化したRinger、又は不揮発油が挙
げられる。静脈内ベヒクルとしては、流体及び栄養の補充剤、電解質補充剤（例
えば、Ringerのデキストロースに基づくもの）等が挙げられる。例えば、抗菌剤
、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等の保存剤及び他の添加剤もまた存在
し得る。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図される使用に応じて
、インターロイキン又はインターフェロン等のさらなる薬剤を含み得る。
【０１８０】 本発明はまた、女性に抗Ｄを投与することを含む、Rhesus D陰性である妊娠女
性の治療方法に関し、ここで、胎児は、本発明の２つの核酸分子構造又は核酸分
子を保有しないか、又は本発明の任意の核酸分子構造又は核酸分子について同型
接合性でない。
【０１８１】 Rhesus陰性の母親がＲｈＤ陽性の胎児を保有する場合、妊娠女性は、現在、抗
Ｄ予防法で治療され得る。本発明は、本発明のＲｈＤタンパク質を保有する母親
及び/又は胎児の状態に応じて、抗Ｄ予防法の必要の区別を可能にする。本発明
の１つ又はそれ以上のＲｈＤタンパク質は、それらのキャリアーの免疫化を容易
にし得、従って、母親の治療の指標となる。同様に、本発明の１つ又はそれ以上
のＲｈＤタンパク質は、胎児により保有される場合、母親に対して低い免疫原性
を示すことが知られ得、従って、現在の臨床治療とは異なり抗Ｄ予防法の省略を
示す。
【０１８２】 投与は、臨床医により規定されうる標準的な経路及び用量により達成されうる
；Mollison,1993。好ましくは、モノクローナル抗Ｄ又はモノクローナル抗Ｄの
組み合わせ／混合物は、静脈内投与又は筋肉内投与については５０μｇ〜５００
μｇの抗Ｄ抗体／抗血清又はそれ以上の用量で投与される（Bowman,1998）。こ
れらの抗Ｄ抗体／抗血清の質的対照のために、本発明により提供される結果及び
方法が好都合に使用され得る。
【０１８３】 本発明はまた、ＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物の測定に関して本発明において
特徴付けられるファージ、アプタマー、モノクローナル抗体若しくはポリクロー
ナル抗血清又はその製剤の使用に関する。
【０１８４】 該使用の好ましい態様において、ＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物の該測定は、
血液型分類に関連して達成される。
【０１８５】 さらに、本発明は、本発明の抗体又はアプタマー又はファージを含む製剤に関
する。
【０１８６】 本発明はまた、（ａ）本発明のＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物を、ファージの
表面上のＶH鎖若しくはＶL鎖又はその組み合わせを示すファージライブラリー又
はアプタマーと接触させる工程； （ｂ）該ＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物に結合するファージ又はアプタマーを同
定する工程；及び任意に （Ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を１回又はそれ以上繰り返す工程を含む、本発明の
ＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物に特異的に結合する抗体ＶH鎖若しくはＶL鎖又は
その組み合わせあるいはアプタマーを同定する方法に関する。
【０１８７】 ファージライブラリーの調製及び所望の抗体（鎖）のスクリーニング／同定は
、それ自体当該分野で周知であり、例えば、Winterら、Annu.Rev.Immunol. 12(1
994),433-455及びそこに引用される参考文献に総説されている。また、アプタマ
ーは、従来のプロトコルに従って調製され、ファージにクローン化されうる。単
一のＶH鎖又はＶL鎖は、本発明のＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物に結合するので
本発明の方法により同定され得るが、この状況は天然の抗体が結合する状況に似
ているので、ファージにより発現されるＶH−ＶL組み合わせを同定することが好
ましい。工程（ａ）及び（ｂ）を１回又はそれ以上繰り返すことにより、より良
好な結合特異性が同定され得る。結合したファージを取り出す溶出工程を含む、
アフィニティー等の結合特性を最適化するためのプロトコルは当該分野で充分に
確立されている。例えば、好都合な結合能力を有するＶH鎖が見出されれば、例
えば、第一の選択工程においてＶH鎖と会合するＶL鎖をより適切なＶL鎖に置換
することにより、抗体の結合能力を有意に改善するＶL鎖が同定され得る。
【０１８８】 本発明はまた、（ａ）本発明のＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物を１つ又はそれ
以上のモノクローナル抗体と接触させる工程； （ｂ）ＲＨＤ遺伝子の該タンパク質産物に結合するモノクローナル抗体を同定す
る工程；及び任意に （ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を１回又はそれ以上繰り返す工程、 を含む、本発明のＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物に特異的に結合するモノクロー
ナル抗体を同定する方法に関する。
【０１８９】 本発明はまた、（ａａ）ＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物及び （ａｂ）（ａａ）のＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物より高いか、等しいか、又は
低いモル質量で存在する、正常なＤポリペプチドをファージの表面上にＶH鎖あ
るいはＶL鎖又はその組み合わせを示すファージライブラリーあるいはアプタマ
ーと接触させる工程、 （ｂ）（ａ）の該ＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物に結合するファージ又はアプタ
マーを同定する工程；及び任意に （ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を１回又はそれ以上繰り返す工程 を含む、本発明のＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物に特異的に結合する抗体ＶH鎖
若しくはＶL鎖又はその組み合わせあるいはアプタマーを同定する方法に関する
。
【０１９０】 工程（ａｂ）において特に好ましくは、正常なＤポリペプチドのモル質量は、
（ａａ）のＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物よりも高い。
【０１９１】 １回だけの選択が同定に使用される場合（すなわち、工程（ｃ）が適用されな
い場合）、（ａａ）のＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物の数がファージ粒子の数に
対してモル過剰であることが好ましい。本明細書上記の抗体ＶH鎖若しくはＶL鎖
又はその組み合わせあるいはアプタマーの同定方法の好ましい態様は、本発明の
当該態様に等しく適用する。
【０１９２】 本発明はまた、（ａａ）ＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物及び （ａｂ）（ａａ）のＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物より高いか、等しいか、又は
低いモル質量で存在する、正常なＤポリペプチドを１つ又はそれ以上のモノクロ
ーナル抗体と接触させる工程； （ｂ）（ａａ）の該ＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物に結合するモノクローナル抗
体を同定する工程；及び任意に （ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を１回又はそれ以上繰り返す工程 を含む、本発明のＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物に特異的に結合するモノクロー
ナル抗体の同定方法に関する。
【０１９３】 好ましくは、ＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物は、細胞の表面に露出される。適
切な表面は、赤血球の表面である。しかし、他の宿主細胞は、本発明のＲＨＤ遺
伝子のタンパク質産物の発現に適したベクターでトランスフェクトされ、その表
面上に同物を発現し得る。抗体はまた、Ｄ抗原のタンパク質の組換えタンパク質
又は一部及び精製タンパク質に結合し得る。
【０１９４】 ポリペプチド又は宿主細胞が、固相支持体に固定されることがさらに好ましい
。固相支持体の適切な例は、マイクロタイタープレート又はビーズである。
【０１９５】 さらに好ましい抗体においては、工程（ｂ）又は（ｃ）に続いて、以下の工程
が行われる： （ｄ）ＶH鎖又はＶL鎖のアミノ酸配列を同定する工程及び／又は該アミノ酸配列
をコードする核酸配列を同定する工程。
【０１９６】 アミノ酸配列／核酸配列の同定は、従来のプロトコルに従って達成されうる；
例えば、Sambrookら、loc.cit.を参照のこと。
【０１９７】 それゆえ、及び要約すると、本発明は、上記の共通なＲＨＤ陰性ハプロタイプ
、ならびに血清学的にＲｈＤ陰性な集団中のおそらく稀なＲＨＤ陽性アレレを含
む、ＲＨＤハプロタイプの検出のための手段及び方法を提供する。ＲＨＤ配列を
保有し、それゆえＲＨＤ陽性として決定される後者のアレレは、ＲＨＤ／ＲＨＣ
Ｅハイブリッド遺伝子、終止コドン、スプライシング部位変異又は遺伝子欠失の
いずれかを含み、これはＲｈＤ抗原発現を終結又は減少させる。本発明の改善さ
れた検出方法を行うことにより、驚くことに、ルーチンな血清学においてＲｈＤ
陰性であると測定されたいくつかの試料がＲＨＤ陽性アレレを有すると同定され
得ることを見出した。さらに、それらの試料のいくつかは、吸着及び溶出に基づ
く検出アッセイを行った場合にもＲｈＤ抗原陽性であり、ＲｈＤ陰性においてＲ
ＨＤ陽性アレレに基づく分子が、予測されるよりも不均一であることを示す。有
益なことに、本発明の開示内容はいまや、ＲＨＤの特定の配列がＲｈＤ陽性の表
現型を引き起こすかＲｈＤ陰性の表現型を引き起こすかを決定するための新規で
実行可能な核酸増幅技術を提供する。
【０１９８】 特に好ましい態様では、本発明の方法は、１回だけの選択が同定に使用される
場合、（ａ）のＲＨＤ遺伝子のタンパク質分子の数は、ファージ粒子の数に対し
てモル過剰である。
【０１９９】 さらに、本発明は、細胞、好ましくは本発明のＲＨＤ遺伝子のタンパク質産物
を含む赤血球、又は本発明の方法により、本発明のモノクローナル抗Ｄ抗体若し
くは抗Ｃ抗体又はポリクローナル抗Ｄ抗血清若しくは抗Ｃ抗血清又は抗グロブリ
ン抗血清若しくは抗ヒトグロブリン抗血清又はその製剤のアフィニティー、アビ
ディティ及び／又は反応性の評価のためにプロバンドから生産された赤血球の使
用に関する。
【０２００】 さらに、本発明は、ＳＭＰ１多型に遺伝的に関連する特定のＲＨ（ＲＨＤ−Ｒ
ＨＣＥ）−ハプロタイプを決定するためのＳＭＰ１多型の使用に関する。
【０２０１】 本発明の当該態様の基礎は、３つの遺伝子：ＲＨＤ、ＲＨＣＥ、及びＳＭＰ１
を含む、ＲＨ遺伝子座の独特の構造により提供される。後者の遺伝子のヌクレオ
チド配列は、１８ｋＤａ小膜タンパク質ファミリーの推定上のメンバーとしてＧ
ｅｎｂａｎｋに寄託されている。その機能は、未だ不明である。それは、第２１
染色体上のオープンリーディングフレームに相同性を示す（Reboul, Genome res
.9:242,1999）。両方のＲＨ遺伝子の間の位置は、ＳＭＰ１遺伝子の任意の多型
が特定のＲＨハプロタイプに密接に関連しており、ＳＭＰ１遺伝子の機能的に関
連する変異が特定のＲＨハプロタイプについて、又はそれに対して選択圧を引き
起こし得ることが予想される。かかる因子は、欧州においてＲＨ陰性の頻度が高
いことのような、ＲＨハプロタイプ分布の以前には解決されなかったいくつかの
問題を説明する。ＳＭＰ１における多型のスクリーニングは、それゆえ、ＲＨ遺
伝子座の理解ならびにその診断適用のためにかなり興味深い。
【０２０２】 本発明による用語「多型」とは、集団における１より多くの遺伝子構造若しく
はハプロタイプの遺伝子又はＤＮＡセグメントの存在に関する。にもかかわらず
、時には、かかる遺伝的多型は、常に異なる表現型を生じるわけではなく、遺伝
子レベルでのみ検出され得る。
【０２０３】 他の好ましい態様では、本発明は、当該分野で公知の技術、好ましくはＰＣＲ
−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＰ又はロングレンジＰＣＲにより、任意の構造特徴又
はヌクレオチド配列若しくは両方のＲＨ遺伝子座又はその組み合わせを利用する
ことにより、ＳＰＭ１遺伝子におけるＳＭＰ１多型の決定を含む、特定のＲＨ（
ＲＨＤ−ＲＨＣＥ）−ハプロタイプの検出方法に関する。
【０２０４】 さらに、本発明は、（ａ）本発明のオリゴヌクレオチド；及び／又は （ｂ）本発明の抗体； （ｃ）本発明のアプタマー；及び／又は （ｄ）本発明のファージ； （ｅ）本発明の増幅反応を行うために有用なプライマー対 を含んでなるキットに関する。
【０２０５】 キットのパーツは、バイアルに又は容器若しくは多容器単位との組み合わせに
独立してパッケージされうる。本発明のキットは、本発明の方法を行うために好
都合に使用され得、とりわけ上記の種々の適用に使用され得る。キットの製造は
、好ましくは、当業者に公知の標準的な手順に従う。
【０２０６】 本発明はまた、本発明に記載の任意のブレークポイント領域を検出する工程を
含む、ＲＨＤ遺伝子によりコードされる抗原Ｃの存在を決定するためのプロセス
に関する。
【０２０７】 最後に、本発明は、本発明のプロセスの工程を含む、抗原Ｃの存在を決定する
ためのプロセスに関する。
【０２０８】 本明細書中に引用される文献の開示内容は、参考として本明細書に援用される
。
【０２０９】 本実施例は、本発明を説明する。
【０２１０】 実施例１：血液試料およびＤＮＡ単離 白人の血液ドナーからＥＤＴＡ−またはクエン酸−抗凝固血液試料を回収し、
抗−Ｄを用いる抗グロブリン試験を含む通常の分類においてＤ陰性として特徴付
けた（Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅｒ Ｂｅｉｒａｔ ｄｅｒ Ｂｕｎ
ｄｅｓａｅｒｚｔｅｋａｍｍｅｒ；Ｐａｕｌ−Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔ．Ｒｉｃｈｔｌｉｎｉｅｎ ｚｕｒ Ｂｌｕｔｇｒｕｐｐｅｎｂｅｓｔｉｍｍ
ｕｎｇ ｕｎｄ Ｂｌｕｔｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（Ｈａｅｍｏｔｈｅｒａｐｉ
ｅ）．Ｋｏｅｌｎ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ａｅｒｚｔｅ−Ｖｅｒｌａｇ；１９９
６；Ｗａｇｎｅｒ，Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓｔｈｅｒ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓｍ
ｅｄ ２２：２８５−９０，１９９５）。必要な場合、特異的なＣｃＥｅ表現型
に対してランダムに試料を回収した。全部で３１４個のｃｃｄｄｅｅ、４３３個
のＣｃｄｄｅｅ、２７１個のｃｃｄｄＥｅ、１９個のＣｃｄｄＥｅ、２４個のＣ
Ｃｄｄｅｅ、１個のＣｃｄｄＥＥおよび６個のｃｃｄｄＥＥの試料を試験した。
Ｇａｓｓｎｅｒら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３７；１０２０、１９９７に記載
の改変した塩析手順により、ＤＮＡを単離した。
【０２１１】 実施例２：分子研究 ＲＨＤプロモーター、イントロン４、エキソン７、およびエキソン１０の３’
非翻訳領域に位置する４つの異なるＲＨＤ特異的多型の存在に対して、ＰＣＲ−
ＳＳＰにより、全試料を試験した。少なくとも１つの陽性ＰＣＲ反応を用いて４
８試料を検出した（表５）。エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６
、エキソン７、イントロン７およびエキソン９におけるＲＨＤ特異的多型の存在
に対して、それらの試料をさらに調査した。２６試料は、陽性および陰性反応の
混合物を伴う８つの明確なＰＣＲパターンの１つを示した（表６）。２２試料は
、調査された全てのＲＨＤ特異的多型に対して陽性であり、ゲノムＤＮＡ由来の
１０個のＲＨＤエキソンのＲＨＤ特異的配列決定により８個のＲＨＤアレレに割
り当てた（表７）。各ＰＣＲパターンおよび各ＲＨＤアレレに対して、１つの試
料を血清学的に調査した。弱いＤ、部分的にＤ、およびＤelを示すために表現型
を測定するか、吸着／溶出により血清学的にＤ陰性であると確認した（表６およ
び７）。
【０２１２】 実施例３：ＤＮＡデータベース調査および解析 ＢＬＡＳＴプログラムを用いてＲＨＤ（ＲｈＸＩＩＩ、寄託番号Ｘ６３０９７
）およびＲＨＣＥ（ＲｈＶＩ、Ｘ６３０９５）の代表的なｃＤＮＡ配列を用いて
、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
／ＢＬＡＳＴ／）およびＳａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの第１染色体データベース
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｈ
−Ｂｌａｓｔ＿Ｓｅｒｖｅｒ．ｈｔｍｌ）を調査した。８４，８１０ｂｐゲノム
クローンｄＪ４６９Ｄ２２（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＬ０３１２８４）、１２
９，７４７ｂｐゲノムクローンｄＪ４６５Ｎ２４（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＬ
０３１４３２）および２，２３４ｂｐ ＳＭＰ１ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ寄
託番号ＡＦ０８１２８２）を同定した。ｄＪ４６９Ｄ２２は、ＲＨＣＥ開始コド
ンの３３，３４０ｂｐ５’側で始まり、エキソン９の１，１４２ｂｐ３’側で終
わるＲＨＣＥ遺伝子の主要な断片を表した。ｄＪ４６５Ｎ２４において、１２０
，１５８〜１２１，５６８の間に位置する１，４１８ｂｐの内部ストレッチは、
ＲＨＤ ｃＤＮＡの３’末端に９６％相同であった。ＳＭＰ１ ｃＤＮＡの３’
末端は、ＲＨＣＥ ｃＤＮＡの３’末端に相補的であり、５８ｂｐが重複した。
【０２１３】 実施例４：ＰＣＲ 特に記載しないかぎり、拡大したロングテンプレート（expand long template
）または拡大した高度忠実性ＰＣＲシステム（expand high fidelity PCR syste
ms）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）および記載したプライマー(表１)を用いて６０℃のアニーリング、６８
℃で１０分間伸長および９２℃での変性によりＰＣＲ反応を行なった。３つのＰ
ＣＲ反応を用いて、ＲＨ遺伝子の３’隣接領域におけるギャップを埋めた。プラ
イマーｒｅａ７およびｒｅｎｄ３１を用いてＰＣＲ１を行なった（ＰＣＲ２、ｒ
ｅｎｄ３２、ｓｆ１ｃ；ＰＣＲ３、ｒｅａ７、ｓｆ３）。センスプライマーｒｅ
ｎｄ３２、ｒｅｙ１４ａ、ｒｅｙ１５ａおよびアンチセンスプライマーｒｅ０１
１ｄおよびｒｅ０１４を伴うＰＣＲ増幅で５’隣接領域の構造を確認した。ＲＨ
Ｄに対してｒｂ１０ｂおよびｒｒ４（ＲＨＣＥに対してｒｅ９６およびｒｈ７）
を用いるＰＣＲ増幅に基づいてイントロン９のサイズを約９，０００ｂｐである
と見積もった。
【０２１４】 実施例５：ヌクレオチド配列決定 ＤＮＡ配列決定ユニット（Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクル
−シークエンシングレディー反応キット；ＡＢＩ ３７３Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてヌ
クレオチド配列決定を行なった。
【０２１５】 実施例６：ＲＨ遺伝子座の特徴付け ＲＨ遺伝子座の物理的構造を誘導した（図１）。以下の考察からこの構造を推
測した。（ｉ）３’隣接領域。ＲＨＤの３’隣接領域は、ｄＪ４６５Ｎ２４の３
’部分に高度に相同性であった（図１Ｂ、領域ｃ）。ＰＣＲ増幅産物を得ること
ができたという事実により証明されるように、この相同性は、ＲＨＤ ｃＤＮＡ
の末端を越えて続き、少なくとも８，０００ｂｐ伸びた（図１Ｂ、ＰＣＲ１）。
ｄＪ４６５Ｎ２４の３'部分に対して相同な配列は、ＳＭＰ１遺伝子の５'領域に
隣接した（図１Ｂ；ＰＣＲ２）。ＳＭＰ１遺伝子の３'末端は、それぞれのｃＤ
ＮＡの３'末端の相補性により示されるようにＲＨＣＥ遺伝子にすぐ隣接して存
在し、ＰＣＲにより確認した（図１Ｂ、ＰＣＲ３）。ＲＨＤ３'隣接領域（Ｒｈ
ｅｓｕｓボックス）およびＳＭＰ１遺伝子のさらなる詳細を以下に記載する。（
ｉｉ）５'隣接領域。ｄＪ４６９Ｄ２２は、ＲＨＣＥの隣接領域の５'側に３３，
３４０ｂｐを含有した。ＲＨＤに対して、ｄＪ４６５Ｎ２４の３'末端およびｄ
Ｊ４６９Ｄ２２の間での４６６ｂｐ相同性は、ｄＪ４６５Ｎ２４がＲＨＤの５'
隣接配列を表わすことを示した。この仮説をＰＣＲにより証明した（図２）。（
ｉｉｉ）ＹＡＣ ３８Ａ−Ａ１０の解析。ＹＡＣ ３８Ａ−Ａ１０由来のＤＮＡ
（ＵＫ ＨＧＭＰ資源センター、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を、標準法（ｈｔ
ｔｐ：／／ｈｄｋｌａｂ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｌａｂ＿ｍａｎｕａｌ／ｙｅａ
ｓｔ）による単一増殖期間後、単離した。このＹＡＣがＲＨ ＤＮＡを含むこと
を確認した。さらに、ショットガンクローニング実験は、その挿入物のいくつか
がおそらくＸ染色体に由来することを示した（データ示さず）。このＹＡＣは、
ＲＨＣＥエキソン２〜１０およびＲＨＤエキソン１〜１０を含むことが知られて
おり（Ｃａｒｒｉｔｔ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：８４３、１９９７）
、したがってＲＨＤおよびＲＨＣＥの間に散在したＤＮＡセグメントを含むこと
が予期された。このＹＡＣにおけるＲＨ座の異なる部分に代表的なＤＮＡセグメ
ントの存在を観察した（表２）。結果は、図１、パネルＡで示されるＲＨ座の提
案された構造に一致した。
【０２１６】 実施例７：ＲＨＤプロモーターにおけるＲＨＤ特異的配列の同定 染色体ウォーキング（ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、約２，０００ｂｐのＲＨＤプ
ロモーター配列を確立した。プライマーｒｅ０４およびｒｅ１１ｄ（表１）を用
いた、Ｄ−陽性およびＤ−陰性試料を増幅し、内部プライマーを用いた配列決定
により開始コドンの５’側の１，２００ｂｐに対してＲＨＤ−およびＲＨＣＥ−
特異的配列を確立した。ＲＨＤ遺伝子における短い欠失を同定し、ＲＨＤ−特異
的プライマーｒｅ０１１ｄを開発するために使用した。ＲＨＤプロモーターを含
む１，２００ｂｐ配列を寄託番号ＡＪ２５２３１４のもとでＥＭＢＬに寄託した
。
【０２１７】 実施例８：Ｒｈｅｓｕｓボックスの特徴付け ＲＨＤ遺伝子の５’および３’に位置する約９，０００ｂｐの２つのＤＮＡセ
グメントは、高度に相同性であり、同一配向を有し、「Ｒｈｅｓｕｓボックス」
と命名した（図４）。Ｒｈｅｓｕｓボックスを増幅し、ＰＣＲプライマー対のｒ
ｅｚ４／ｒｅｎｄ３１およびｒｅｎｄ３２／ｒｅ０１１ｄ（Ｒｈｅｓｕｓボック
ス上流）、ｒｅａ７／ｒｅｎｄ３１およびｒｅｎｄ３２／ｓｒ９（Ｒｈｅｓｕｓ
ボックス下流）ならびにｒｅｚ４／ｒｅｎｄ３１およびｒｅｎｄ３２／ｓｒ９（
ＲＨＤ−陰性のハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックス）を使用して２つの重複断片
における内部プライマーを用いて配列決定を行なった。Ｒｈｅｓｕｓボックスの
上流（ＲＨＤの５’）は、約９，１４２ｂｐ長であり、ＲＨＤ開始コドンの４，
９００ｂｐ５’側で終了した。Ｒｈｅｓｕｓボックスの下流（ＲＨＤの３’）は
、９，１４５ｂｐ長であり、ＲＨＤ終始コドン後１０４ｂｐで始まった。Ｒｈｅ
ｓｕｓボックスは、ＲＨＣＥに対して相同性を有するＲＨＤの部分を正確に含む
。両方のＲｈｅｓｕｓボックスの中央部分は、トランスポゾン様ヒトエレメント
（ＴＨＥ−１Ｂ）のほとんど完全な残りを含んだ。ＴＨＥ−１Ｂエレメントにお
いて通常見出される単一オープンリーディングフレームは、しかしながら、コド
ン４でのナンセンス以上を含む、両方のＲｈｅｓｕｓボックスにおいて平行で生
じるいくつかのヌクレオチド異常のために除外した。両方のＲｈｅｓｕｓボック
スの間では全部で９８．６％相同であった一方で、５，７０１〜７，１６３位の
間に位置する１，４６３ｂｐ「同一領域」は、ポリＴ区域での４ｂｐＴ挿入の単
一の例外を除き完全に同一であった。
【０２１８】 実施例９：ＳＭＰ１のゲノム構造の評価 内部プライマーを用いるＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定により、ＳＭＰ１
遺伝子のゲノム構造を評価した（図３）。プライマーｒｅｎｄ３２、ｓｒ９、ｓ
ｆ１ｃ、ｓｆ１、ｓｍ１９、ｓｒ４５、ｓｒ４７、ｓｒ４７ｃ、ｓｒ５、ｓｒ５
ｃ、ｓｒ５５、ｓｒ５５ｃ、ｓｒ３、ｓｒ３ｋｐ、ｒｅａ7を用いて得られたＰ
ＣＲ増幅産物により、ＳＭＰ１イントロンのサイズを見積もった。イントロン／
エキソンジャンクションの位置およびさらなるイントロンの不在を、ヌクレオチ
ド配列決定により決定した。６個のイントロンを同定し得た。エキソン１は５’
非翻訳配列のみを含み、Ｒｈｅｓｕｓボックスから１５ｂｐ離れていた。エキソ
ン７のロング３’非翻訳配列は、ＲＨＣＥエキソン１０と重複した。全遺伝子サ
イズは２０，０００ｂｐであると見積もられ、Ｒｈｅｓｕｓボックスの下流と連
結すると、約３０，０００ｂｐのＲＨＤおよびＲＨＣＥの間の距離をもたらした
、（図１）。
【０２１９】 実施例１０：ＲＨＤ陰性ハプロタイプにおけるＲＨＤ遺伝子欠失の局在 ２つのＲｈｅｓｕｓボックスの相同は、共通のＲＨＤ陰性ハプロタイプにおけ
るＲＨＤ欠失の機構の助けになると推論した。ＲＨＤ陰性ＤＮＡにおけるＲｈｅ
ｓｕｓボックスのヌクレオチド配列を決定した（図５）。ＲＨＤ陰性において検
出された単一Ｒｈｅｓｕｓボックスは、ハイブリッド構造を有した。このＲｈｅ
ｓｕｓボックスの５’末端はＲｈｅｓｕｓボックスの上流を表わし、３’末端は
Ｒｈｅｓｕｓボックスの下流を表した。ＲＨＤ欠失の９０３ｂｐブレークポイン
ト領域は、Ｒｈｅｓｕｓボックスの同一領域に位置した（図４、左を指す矢印）
。
【０２２０】 実施例１１：ＰＣＲによるＲＨＤ欠失の特異的検出 優勢なＲＨＤ陰性ハプロタイプに生じるＲＨＤ遺伝子欠失の特異的な検出のた
めに、２つのＰＣＲに基づく方法を開発した（図６）。バッファー３ならびにプ
ライマーｒｅｚ４（Ｒｈｅｓｕｓボックスの上流の５’）およびｓｒ９（ＳＭＰ
１エキソン１）を用いて拡大したロングテンプレートＰＣＲシステムを使用して
、ロングレンジＰＣＲ−ＳＳＰを行なった。アニーリングは６０℃であり、伸長
は２０分間６８℃であった。１％アガロースゲルを用いてＰＣＲ増幅産物を分離
した。拡大した高度忠実性ＰＣＲシステムならびにプライマーｒｅｚ２７（非特
異的、Ｒｈｅｓｕｓボックス同一領域の５’）およびｒｎｂ３１（Ｒｈｅｓｕｓ
ボックスの下流に特異的、Ｒｈｅｓｕｓボックス同一領域の３’）を用いて、Ｐ
ＣＲ−ＲＦＬＰを行なった。アニーリングは６５℃であり、伸長は１０分間６８
℃であった。ＰＣＲ増幅産物を、ＰｓｔＩで３時間３７℃で消化し、断片を１％
アガロースゲルを用いて分離した。これらの技術により、たとえＲＨＤ陰性ハプ
ロタイプがＲＨＤ陽性ハプロタイプに対してトランスであっても、共通のＲＨＤ
陰性ハプロタイプの便利で直接の検出が可能になった。より多くの試料にＰＣＲ
−ＲＦＬＰをさらに適用した（表３）。予期したように、既知の遺伝子型を有す
る全部で３３個の試料を正しく分類した。ごく普通の表現型に代表的な６８個の
さらなる試料において、結果は集団における既知のハプロタイプ頻度と一致した
。
【０２２１】 実施例１２：ＲＨＤ ＰＣＲ−ＳＳＰ ＰＣＲ−ＳＳＰ反応（表４）を、前に記載したＲＨＤエキソン特異的ＰＣＲ−
ＳＳＰ法（Ｇａｓｓｎｅｒ、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３７：１０２０−６、１
９９７）から適合および拡張し、同一のサーモサイクリング条件下で研究するた
めに誘引（trigger）した。エキソン６（０．１μＭ）、イントロン７（０．４
μＭ）およびエキソン９（０．４μＭ）を例外とし、全ての反応に対して特異的
プライマーの濃度は０．２μＭであった。ほとんどの試料に対して、０．２μＭ
のエキソン７（プライマーセットｇａ７１／ｇａ７２）および０．１μＭのイン
トロン４プライマーを含む頻回反応としてイントロン４／エキソン７を試験した
。各反応物は、プロモーター、イントロン４、およびｇａ７１／ｇａ７２を有す
るエキソン７に対して０．０５μＭ；エキソン１０に対して０．０７５μＭ；イ
ントロン７に対して０．１μＭ；エキソン３、エキソン４、ｒｂ２６／ｒｅ７１
を有するエキソン７およびエキソン９に対して０．１５μＭ；エキソン５および
エキソン６に対して０．２μＭの濃度で、内部対照としてＨＧＨプライマー（Ｇ
ａｓｓｎｅｒ、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３７：１０２０−６、１９９７）の１
セットを含んだ。Ｍｇ2+濃度はイントロン７に対して０．４μＭであり、全ての
他の反応物に対して０．１５μＭであった。エキソン６に対して、２０％溶液Ｑ
（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した。
【０２２２】 実施例１３．通常のＤＮＡタイピングのための改良したＲＨＤ ＰＣＲ−ＳＳＰ 本研究で検出され、前記したアレレに基づいて、我々は、単一ＰＣＲ管におけ
るＲＨＤ（Ｗ１６Ｘ）と同様に、本研究で検出されたＲＨＤΨおよびアレレの特
異的な検出を含む通常のＤＮＡタイピングのための改良したＲＨＤ ＰＣＲ−Ｓ
ＳＰを考案した。反応Ａは、０．３μＭのプライマーｇａ７１およびｇａ７２、
０．１μＭのｒｂ１２およびｒｅ４１、ならびに０．１μＭのＨＧＨプライマー
を含んだ。Ｍｇ２＋は、０．１７５μＭであった。反応Ｂは、０．５μＭのプラ
イマーＲｈＰｓｉＦおよびＲｈＰｓｉＢ、０．３μＭのｒｅ１１ｄおよびＲｈＸ
１ｆ１、０．２μＭのｒｅ７２１およびｒｂ９ならびに対照プライマーとして０
．２μＭのｒｅｎｄ９ｂ１およびｒｅｎｄ９ｂ２を含んだ。プライマー配列は、
ｇａ７１，ｇｔｔｇｔａａｃｃｇａｇｔｇｃｔｇｇｇｇａｔｔｃ；ｇａ７２，ｔ
ｇｃｃｇｇｃｔｃｃｇａｃｇｇｔａｔｃ；ｒｂ１２，ｔｃｃｔｇａａｃｃｔｇｃ
ｔｃｔｇｔｇａａｇｔｇｃ；ｒｅ４１，ｃｇａｔａｃｃｃａｇｔｔｔｇｔｃｔｇ
ｃｃａｔｇｃ；ＲｈＰｓｉＦ，ａｇａｃａｇａｃｔａｃｃａｃａｔｇａａｃｔｔ
ａｃ；ＲｈＰｓｉＢ，ｔｃｔｇａｔｃｔｔｔａｔｃｃｔｃｃｇｔｔｃｃｃｔｃ；
ｒｅ１１ｄ，ａｇａａｇａｔｇｇｇｇｇａａｔｃｔｔｔｔｔｃｃｔ；ＲｈＸ１ｆ
１，ｃｇｃｔｇｃｃｔｇｃｃｃｃｔｃｔｇａ；ｒｅ７２１，ｃｔｇｇａｇｇｃｔ
ｃｔｇａｇａｇｇｔｔｇａｇ；ｒｂ９，ａａｇｃｔｇａｇｔｔｃｃｃｃａａｔｇ
ｃｔｇａｇｇ；ｒｅｎｄ９ｂ１，ｃａｃｔｇｃａｃｔｔｇｇｃａｃｃａｔｔｇａ
ｇ；ｒｅｎｄ９ｂ２，ｔｔｃｃｇａａｇｇｃｔｇｃｔｔｔｔｃｃｃであった。Ｐ
ＣＲ反応を２つの管で（図１５）、５つの多型を試験することができ、１：１０
，０００より少ない偽−陽性率を有することを予測した（表１１）。
【０２２３】 実施例１４：ＣｄｅS に対するＰＣＲ反応 ０．３μＭの特異的プライマーＲｈ１５２Ｔｂおよびｇａ３１を用いるＰＣＲ
−ＳＳＰ反応により、ＣｄｅS ハプロタイプに生じるＮ１５２Ｔ置換を有するハ
イブリッドエキソン３を検出した。ＣｄｅS で観察されるＬ２４５Ｖ置換を０．
２μＭの特異的プライマーＲｈ２２３ＶｆおよびＲｈ２４５Ｖｂを用いて検出し
た。ＨＧＨプライマー濃度は０．１μＭであった。他のＰＣＲ条件は、前の段落
で記載したものと同じであった。プライマー配列は、Ｒｈ１５２Ｔｂ，ｇａｔａ
ｔｔａｃｔｇａｔｇａｃｃａｔｃｃｔｃａｔｇｇ；Ｒｈ２２３Ｖｆ，ｔｔｇｔｇ
ｇａｔｇｔｔｃｔｇｇｃｃａａｇｔｇ；およびＲｈ２４５Ｖｂ，ｇｃｔｇｔｃａ
ｃｃａｃｔｃｔｇａｃｔｇｃｔａｃであった。ＣｄｅSハプロタイプは、アフリ
カ人で頻繁であり（Ｆａａｓ、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３７：３８−４４、１
９９７；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、Ｂｌｏｏｄ ９５：１２−８、２０００）、ＲＨ
ＣＥ特異的Ｎ１５２Ｔ置換を有するハイブリッドエキソン３を持つ（Ｆａａｓ、
Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３７：３８−４４、１９９７）。このハイブリッドエ
キソンは、３８３位（コドン１２８）でＡを検出し、ＲＨＤエキソン３特異的Ｐ
ＣＲによりＲＨＤ陽性として分類されることが予期され、集団調査に使用した。
パターン４およびパターン８がＣｄｅSハプロタイプについての既知のデータと
一致するので、エキソン３の３’部分の配列決定およびＣｄｅS を示すエキソン
３ハイブリッドに特異的なＰＣＲ−ＳＳＰにより、ハイブリッドエキソン３の存
在を２つの試料において評価した。パターン４の試料は、通常のＲＨＤエキソン
３を持ち、一方パターン８の試料は、ＣｄｅS ハプロタイプを予測するハイブリ
ッドエキソン３を有した。また、ＣｄｅS ハプロタイプに典型的であり（Ｄａｎ
ｉｅｌｓ、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３８：９５１−８、１９９８）、Ｄカテゴ
リーＩＩＩタイプＩＶにも存在する４１０位のＴ（Ａ１３７Ｖ置換）を検出した
。７３３位でのＧ（Ｌ２４５Ｖ置換）を検出するＰＣＲ−ＳＳＰにより、パター
ン８とＣｄｅS の同一性をさらに確証した。
【０２２４】 実施例１５：イントロン３におけるＣｄｅS の５’ブレークポイント領域 そのｃＤＮＡに基づいて、エキソン３の５’部分がＲＨＤに由来し、コドン１
５２を含むエキソン３の３’部分がＲＨＣＥに由来するＲＨＤ−ＣＥ（３−７）
−Ｄハイブリッド遺伝子として、ＣｄｅS を特徴付けた。我々は、Ｎ１５２Ｔ置
換を有する同様のハイブリッドエキソン３が、ＤカテゴリーＩＩＩタイプＶＩで
（Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．Ｆ．，Ｆｒｏｈｍａｊｅｒ，Ａ．，Ｌａｄｅｗｉｇ，Ｂ．
，Ｅｉｃｈｅｒ，Ｎ．Ｉ．，Ｌｏｎｉｃｅｒ，Ｃ．Ｂ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｔ．
Ｈ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｍ．Ｈ．，およびＦｌｅｇｅｌ，Ｗ．Ａ．弱いＤアレレは
明白な表現型を発現する（Weak D alleles express distinct phenotypes）、Ｂ
ｌｏｏｄ ９５：２６９９−２７０８，２０００）およびＤカテゴリーＩＶａで
（Ｒｏｕｉｌｌａｃ，Ｃ．，Ｃｏｌｉｎ，Ｙ．，Ｈｕｇｈｅｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｎ
．Ｃ．，Ｂｅｏｌｅｔ，Ｍ．，Ｄ'Ａｍｂｒｏｓｉｏ，Ａ．−Ｍ．，Ｃａｒｔｒ
ｏｎ，Ｊ．Ｐ．，およびＬｅ Ｖａｎ Ｋｉｍ，Ｃ．、Ｄカテゴリー表現型の転
写解析はＤエピトープの改変に関連するハイブリッドＲｈ Ｄ−ＣＥ−Ｄタンパ
ク質を予測する（Transcript analysis of D category phenotypes predicts hy
brid Rh D-CE-D proteins associated with alteration of D epitopes）、Ｂｌ
ｏｏｄ ８５：２９３７−２９４４，１９９５）、エキソン４〜７がＲＨＤに由
来する２つの異常型ＲＨＤアレレが見られることに注目した。我々は、Ｎ１５２
Ｔ置換がＣｄｅS におけるＲＨＤエキソン４〜７の置換より前であると推論した
。この場合、５’ブレークポイント領域は、ｃＤＮＡから予測されるようにエキ
ソン３よりもむしろイントロン３に位置すると予期した。我々は、それゆえにＣ
ｄｅS イントロン３におけるＲＨＤ特異的多型の存在を評価した。
【０２２５】 ＥｃｏＲＶ−部位のヌクレオチド７５２位（ＲＨＤ特異的）および２８７２位
（ＲＨＣＥ特異的）ならびにＰｖｕＩＩ−部位のヌクレオチド１７７７位（ＲＨ
ＣＥ特異的）の存在を評価するために、ＲＨＤおよびＲＨＣＥのイントロン３の
５’部分をプライマーｒｂ３およびｒｂ３３を用いて増幅し、ＥｃｏＲＶまたは
ＰｖｕＩＩで消化した。ＳａｃＩ−部位のヌクレオチド７７９７位（ＲＨＣＥ特
異的）およびＡｌｗ４４Ｉ−部位のヌクレオチド８５５０位（ＲＨＤ特異的）の
存在を評価するために、ＲＨＤおよびＲＨＣＥのイントロン３の３’部分をプラ
イマーｒｂ３４およびｒｂ５を用いて増幅し、ＳａｃＩまたはＡｌｗ４４Ｉで消
化した。プライマー配列は、ｒｂ３，ａａｇｇｔｃａａｃｔｔｇｇｃｇｃａｇｔ
ｔｇｇｔｇｇ；ｒｂ３３，ｇｔｇａｇａｃｔｇａｇｔｔｃｔｇｔａｔｔｃｔｇｇ
；ｒｂ３４，ｃｃａｇａａｔａｃａｇａａｃｔｃａｇｔｃｔｃａｃ；ｒｂ５，ｇ
ｇｃａｇａｃａａａｃｔｇｇｇｔａｔｃｇｔｔｇｃであった。
【０２２６】 これらのイントロン３多型のＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析は、ＲＨＤ特異的配列が、
少なくともイントロン３の２８７２位までに存在することを示した。さらに、Ｃ
ｄｅS の５’ブレークポイント領域を決定するために、我々はブレークポイント
領域を含むＤＮＡストレッチを配列決定した。ＤＮＡをプライマーｒｂ３および
ｒｂ３７を用いて増幅し、プライマーｒｂ３３、ｒｂ３４およびＣｄｅｓｆ１を
用いて配列決定した。プライマー配列は、ｒｅ３７，ｇｇｇｔｔａａａｇｔｃａ
ｃａｔａｃａｃａｇａｔｇ；Ｃｄｅｓｆ１，ａｔａｃａｇａａｃｔｃａｇｔｃｔ
ｃａｃａａｃｔｔａｇであった。我々は、図１２に示されるように、ブレークポ
イント領域がイントロン３に位置すると確定した。
【０２２７】 実施例１６：イントロン７におけるＣｄｅS の３’ブレークポイント領域 イントロン７におけるＣｄｅS の３’ブレークポイント領域を決定するために
、我々はイントロン７の部分を配列決定した。センスプライマーｒｂ８、ｒｅ７
７およびｒｅｘ１、ならびにアンチセンスプライマーｒｂ５１およびｒｅ７１１
ｂを使用してＤＮＡを増幅した。プライマーｒｂ４３、ｒｅｘ１９ｃ、ｃｄｅｓ
７ｂ２およびｃｄｅｓ７ｆ２をヌクレオチド配列決定のために用いた。プライマ
ー配列は、ｒｂ８，ｇｔｇｔｔｇｔａａｃｃｇａｇｔｇｃｔｇｇｇｇ；ｒｅ７７
，ｔｃｔｃｃａｃａｇｃｔｃｃａｔｃａｔｇｇｇ；ｒｅｘ１，ｇｇｃｔｇｔａａ
ａａａｔｇｇｃｔｇａａｇｃａｇ；ｒｂ５１，ｇｃａｔｇａｃｇｔｇｔｔｃｔｇ
ｃｃｔｃｔｔｇ；ｒｅ７１１ｂ，ｃｔａｔｃａｇｃａｔｔｃｔｇａｔｃｔｃａａ
ｃｇ；ｒｂ４３，ｇａａｔａｇｃａｇａｇａａａａｃｃｔｃａｇａｃｔｇｃｃ；
ｒｅｘ１９ｃ，ｇｃｔｃｃａｔｔｃｔｔｇａｃａａｔａｃａｇｇｃ；ｃｄｅｓ７
ｂ２，ｇｃｔｔａｔａｃｔａｔａｔａａｇｔｔｇｇｇｔｔｔｔｔｔｇｇ；ｃｄｅ
ｓ７ｆ２，ｇｔｔｔｇａａｔｃｃｃａａｇａｇｃｃａｃｔｃａｔであった。我々
は、図１３に示されるように、ブレークポイント領域を確定した。ＲＨＣＥおよ
びＲＨＤの特異的配列の間に多数のスイッチがあるために、３’ブレークポイン
ト領域の構造は興味深いものであった。これらの特徴はブレークポイント領域に
はまれであり、ＣｄｅS の特異的診断に使用しうる。それらは、親のアレレが標
準のＲＨＣＥまたはＲＨＤ配列と異なったか、または主要な遺伝子変換の後、さ
らなる小さな遺伝子変換が導入されたことを示しうる。
【０２２８】 実施例１７：ＣｄｅS を特異的に検出するためのＰＣＲ−ＳＳＰ 通常、ＣｄｅS の存在は、ＲＨＤエキソン特異的ＰＣＲにおけるＲＨＤ−ＣＥ
−Ｄハイブリッドパターンにより同定される。かかるアプローチは、ＲＨＤ陽性
ハプロタイプがトランスで生じる場合、Ｄ陰性ＣｄｅSハプロタイプの特異的検
出をすることができない。ＣｄｅS はハイブリッドＲｈｅｓｕｓボックスを含ま
ないので、ＲＨＤ／ＣｄｅS 異型接合のヒトが、ＲＨＤ+ ／ＲＨＤ+ 同型接合と
して誤って分類されることが起こりうる。プロモーター、イントロン２、エキソ
ン２およびエキソン３にＣｄｅS のいくつかの明白な特徴があり、それを特異的
な検出に使用しうる。これらの特徴は、しかしながら、Ｄ陽性アレレＤカテゴリ
ーＩＶａによりおよび部分的にＤカテゴリーＩＩＩタイプＩＶにより共有され、
それゆえにかかる検出方法を混乱させうる。
【０２２９】 イントロン７におけるＣｄｅS 特異的ＤＮＡ配列に基づいて、我々は、Ｃｄｅ S を特異的に検出するＰＣＲ−ＳＳＰを開発した。０．４μＭの特異的プライマ
ーＣｄｅｓ７ｆ２およびＣｄｅｓ７ｂ２ならびに０．１５μＭのＨＧＨ対照プラ
イマーを用いるＰＣＲ−ＳＳＰにより、イントロン７におけるＣｄｅS の３’ブ
レークポイント領域を検出した。他のＰＣＲ条件は、実施例１２で記載したもの
と同じであった。プライマー配列は、Ｃｄｅｓ７ｆ２，ｇｔｔｔｇａａｔｃｃｃ
ａａｇａｇｃｃａｃｔｃａｔ；Ｃｄｅｓ７ｂ２，ｇｃｔｔａｔａｃｔａｔａｔａ
ａｇｔｔｇｇｇｔｔｔｔｔｔｇｇであった。我々は、インデックスＣｄｅS 試料
（図１４）、２つのさらなるＣｄｅS 試料およびＲＨＤΨ／ＣｄｅS 異型接合試
料（図１４）を用いて特異的な産物を得た。通常のＲＨＤ陽性およびＲＨＤ陰性
試料ならびにＤカテゴリーＩＩＩタイプＩＶおよびＤカテゴリーＩＶａの試料は
、特異的なＰＣＲ産物を生じなかった（図１４）。我々は、我々のＰＣＲ−ＳＳ
Ｐ法が、ＣｄｅS の特異的な検出を、たとえそれがもう１つのＲＨＤ陽性アレレ
に対してトランスで生じたとしても可能にすると結論付けた。さらに、ＣｄｅS
を有するＮ１５２Ｔ置換を共有するＤカテゴリーＩＩＩタイプＩＶまたはＤカテ
ゴリーＩＶａにより、この検出方法は混乱されなかった。後者のハプロタイプは
、ＣｄｅS が優勢であるアフリカ系民族のバックグラウンドを含む集団で頻繁で
あることに注目すべきである。本実施例で我々が記載した方法は、ＣｄｅS の特
異的な検出を可能にし、他のハプロタイプと混同されることがなく、それゆえに
従来技術に対するかなりの改良を提示する。５’ブレークポイント領域の我々の
特徴付けは（実施例１５）、ＰＣＲ−ＳＳＰ、ＰＣＲ−ＬＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ
、ＰＣＲ−ＳＳＯ、サザンブロットなどのような、当該技術分野で公知の任意の
適切な方法によりＣｄｅS の特異的な検出を同様に可能にする。
【０２３０】 ＣｄｅS の特異的な検出はまた、抗原Ｃの正確な予測に重要である。ＣｄｅS
のＲＨＤ遺伝子は、抗原Ｃの予測のためのＤＮＡに基づく方法においてしばしば
見落とされる抗原Ｃをコードする。
【０２３１】 実施例１８：免疫血液学 各ＲＨＤ陽性アレレの１例を、２つのモノクローナル抗Ｄ（Seraclon 抗Ｄ、
クローンＢＳ２２６；Biotest, Dreieich, GermanyおよびFrekaklon 抗Ｄ、クロ
ーンＭＳ２０１；Gull, Bad Homburg, Germany）を用いた直接凝集により評価し
た。間接的な抗グロブリン試験を、オリゴクローナル抗Ｄ（Seraclon抗Ｄブレン
ド、クローンH41 11B7, BS221およびBS232;Biotest）を用いて、ゲルマトリック
ス試験（LISS-Coombs 37℃、DiaMed-ID Micro Typing System, DiaMed, Cressie
r sur Morat, Switzerland）において行った。ゲルマトリックス技術において反
応性の試料を、モノクローナル抗Ｄ HM10, HM16, P3x61, P3x35, P3x212 11F1,
P3x212 23B10, P3x241, P3x249, P3x290（Diagast, Loos, France）およびH41 1
1B7（Biotest）を用いてさらに調べた。Ｄel表現型の存在を、５００μｌの赤血
球に対する５００μｌのポリクローナル抗Ｄ（ヒト不完全抗Ｄ；Lorne Laborato
ries, Reading,UK）の３７℃で１時間の吸収およびクロロホルム技術（Flegel,
Transfusion 40:428-434,2000）を用いた溶出により決定した。Ｄ陰性であると
通常分類される試料の分析により、１６のＤel試料、および弱いかまたは部分的
なＤを伴った３のＤ陽性試料が明かになった。これらの試料は、ＣまたはＥを有
するＤ陰性であると以前に考えられていた試料中に集まっていた（表９）。通常
の血清学とイントロン４およびエキソン７のＰＣＲ試験との間の２７の内の１９
の不一致は、血清学により見落とされたＤ陽性試料を示し、８つのみが偽陽性Ｐ
ＣＲによるものであった。
【０２３２】 実施例１９：ハプロタイプ頻度 一度より多く観察されたアレレについて、それらのハプロタイプ関連性はわず
かであった。一度だけ観察されたアレレを、ｃｄｅハプロタイプよりむしろＣｄ
ｅまたはｃｄＥハプロタイプに関連すると仮定した。なぜなら、ＲＨＤ陽性アレ
レがいずれのｃｃｄｄｅｅ試料においても検出されなかったからである。単一の
ＣｃｄｄＥｅ試料に存在するアレレは、Ｃｄｅについて２分の１であり、ｃｄＥ
について２分の１であると形式的に計数した。Ｃｃｄｄｅｅ試料は、１つの異常
な、および１つの正常なＣｄｅアレレを保有すると仮定した。そのハプロタイプ
における所定の異常なＲＨＤアレレの頻度を、観察下で対応するハプロタイプの
数で観察された試料の数を割ることにより計算した（５００のＣｄｅ、３０２の
ｃｄＥ）。ＲＨＤアレレの集団頻度を、そのハプロタイプ中の当該アレレの頻度
および地方集団におけるハプロタイプの既知の頻度から計算した（Wagner, Infu
sionsther. Transfusionsmed. 22:285-90, 1995）。各ＰＣＲパターンおよび各
ＲＨＤアレレについてのハプロタイプ頻度を計算した（表８）。Aventらによる
英国における以前の研究（Avent, Blood 89:2568-77,1997）と一致して、４．９
％のＣｄｅハプロタイプおよび１．５％のｃｄＥハプロタイプが、我々の集団に
おいてＲＨＤ陽性であった。ＲＨＤ陽性アレレが３１４のｃｃｄｄｅｅ試料内で
検出されなかったので、ｃｄｅハプロタイプの頻度は０．５％未満であった（片
側の上限、９５％の信頼区間、ポアソン分布）。３つの頻度は互いに統計学的に
有意に異なっていた（ｐ＜０．０５；Bonferoni-Holmにより補正された各々の対
比較法に関する両側フィッシャー正確（検定）。任意のＤ陰性ＲＨＤ陽性ハプロ
タイプの集団頻度は、１：１，６０６であると推定した。Ｄelアレレは、仮定さ
れたＣｄｅハプロタイプでのみ観察され得た。血液バンクの常套手法においてＤ
陰性に分類された抗原Ｃを保有する約３％の試料はＤelを示した。Ｄelアレレの
集団頻度は、１：３，０３０であった。
【０２３３】
【表１】
【０２３４】
【表２】
【０２３５】
【表３】
【０２３６】
【表４】
【０２３７】
【表５】
【０２３８】
【表６】
【０２３９】
【表７】
【０２４０】
【表８】
【０２４１】
【表９】
【０２４２】
【表１０】
【０２４３】
【表１１】
【０２４４】 引用文献 1. Andrews KT, Wolter LC, Saul A, Hyland CA: RHD遺伝子における４ヌクレオ
チド欠損に寄与するRhCCee表現型を有する白人患者におけるRhD形質. Blood 92:
1839, 1998 2. Avent ND, Martin PG, Armstrong-Fisher SS, Liu W, Finning KM, Maddocks
D, Urbaniak SJ: RHD遺伝子の頻回PCR解析により決定されたRhD陰性、弱いD(DU)
および部分的D表現型の根底にある遺伝子多様性の証拠. Blood 89:2568, 1997 3. Avent ND, Liu W, Jones JW, Scott ML, Voak D, Pisacka M, Watt J, Fletc
her A. ＤVI改変体表現型を示す個体に由来するRh転写物およびポリペプチドの
分子解析：RRHD欠損事象は全てのDVIccEe表現型を生じない. Blood 1997;89:177
9-86. 4. Blumenfeld OO, Huang CH:グリコホリン遺伝子ファミリーの分子遺伝学、MNS
s血液型の抗原:スプライス部位使用頻度の多重遺伝子転位および調節は広範な多
様化を生じる. Hum Mutat 6:199, 1995 5. Blunt T, Daniels G, Carritt B:部分的に欠損したRHD遺伝子における血清型
転換. Vox Sang 67:397, 1994 6. Bowman J:胎児および新生児における溶血性疾患の管理. Semin Perinatol 21
:39, 1997 7. Carritt B, Kemp TJ, Poulter M:ヒトＲＨ（rhesus）血液型遺伝子の進化：
（部分的に）満たされた50歳予測. Hum Mol Genet 6:843, 1997 8. Carritt B, Steers FJ, Avent ND.胎児RhD型の出生前決定. Lancet 1994;344
:205-6. 9. Cherif-Zahar B, Mattei MG, Le Van Kim C, Bailly P, Cartron JP, Colin
Y:インサイチュハイブリダイゼーションによるヒトRh血液型遺伝子構造体の染色
体領域1p34.3-1p36.1への局在化. Hum Genet 86:398, 1991 10. Cherif-Zahar B, Bony V, Steffensen R, Gane P, Raynal V, Goosens D, L
aursen JS, Varming K, Jersild C, Cartron JP.慢性骨髄性白血病を有する患者
におけるRHD遺伝子内の体細胞変異により引き起こされるRh陽性からRh陰性表現
型へのシフト. Br J Haematol 1998;102:1263-70. 11. Colin Y, Cherif-Zahar B, Le Van Kim C, Raynal V, van Huffel V, Cartr
on J-P.サザン解析により決定されたRhD陽性およびRhD陰性の血液型多型の遺伝
的基礎. Blood 1991;78:2747-52. 12. Cossu G, Angius A, Gelfi C, Righetti PG: 定量的ポリメラーゼ連鎖反応
およびキャピラリーゾーン電気泳動によるRh D/d遺伝子型決定. Electrophoresi
s 17:1911, 1996 13. Daniels GL, Faas BH, Green CA, Smart E, Maaskant-van Wijk PA, Avent
ND, Zondervan HA, von dem Borne AE, van der Schoot CE. アフリカ人におけ
るVSおよびV血液型多型：血清型および分子解析. Transfusion 1998;38:951-8. 14. Doscher A, Schunter F, Muller TH: RHD接合性を評価するための定量的PCR
. Infusionsther Transfusionsmed 26(suppl 1):31, 1999 (abstr.) 15. Faas BHW, Becker EAM, Wildoer P, Ligthart PC, Overbeeke MAM, Zonderv
an HA, von dem Borne AEGK, van der Schoot CE: 黒人におけるVSおよび弱いＣ
の発現の分子背景. Transfusion 37:38, 1997 16. Faas BHW, Beckers EAM, Simsek S, Overbeeke MAM, Pepper R, van Rhenen
DJ, von dem Borne AEGK, van der Schoot CE:Ｇエピトープ形成におけるRhポ
リペプチドのSer103の改変. Transfusion 36:506, 1996 17. Filbey D, Hanson U, Wesstrom G:新生児の結果に相関した妊娠における赤
血球抗体の罹患率：中央スウェーデンにおける12年の研究. Acta Obstet Gyneco
l Scand 74:687, 1995 18. Flegel WA, Khull SR, Wagner FF.弱いＤ型2RBCによる一次抗Ｄ免疫化. Tra
nsfusion 2000; 40: 428 - 434 19. Flegel WA, Wagner FF, Muller TH, Gassner C:DNA分類によるRh表現型予測
および実践のためのその適用. Transfus Med 8:281, 1998 20. Fujiwara H, Okuda H, Omi T, Iwamoto S, Tanaka Y, Takahashi J, Tani Y
, Minakami H, Araki S, Sato I, Kajii E:イントロン８におけるSTR多型は、RH
ハプロタイプの分子進化に関する情報を提供し得る. Hum Genet 104:301, 1999 21. Gassner C, Schmarda A, Kilga-Nogler S, Jenny-Feldkircher B, Rainer E
, Muller TH, Wagner FF, Flegel WA, Schonitzer D:配列特異的プライマーを用
いたポリメラーゼ連鎖反応によるRhesusD/CE分類. Transfusion 37:1020, 1997 22. Huang CH.ヒトＤVIカテゴリー赤血球：内部欠損RhD遺伝子ではなく新規ハイ
ブリッドRhD-CE-D遺伝子との表現型の相関. Blood 1997;89:1834-9. 23. Huang CH, Reid ME, Chen Y, Coghlan G, Okubo Y:緊密に連鎖したSphI RFL
Pによる赤血球Rhハプロタイプの分子規定. Am J Hum Genet 58:133, 1996 24. Huang CH:ヒトdCCeeおよびDCW-赤血球におけるＲＨ遺伝子構造および発現の
変化：表現型ホモ接合性対遺伝子型ヘテロ接合性. Blood 88:2326, 1996 25. Hyland CA, Wolter LC, Saul A.Rhesus Ccee (r'r')表現型を有する血液ド
ナー間で同定される３つの非関連RhD遺伝子多型. Blood 1994;84:321-4. 26. Kemp TJ, Poulter M, Carritt B:ヒトRHCE遺伝子内のミクロサテライト変化
. Vox Sang 77:159, 1999 27. Lo Y-MD, Bowell PJ, Selinger M, Mackenzie IZ, Chamberlain P, Gillmer
MDG, Littlewood TJ, Fleming KA, Wainscoat JS:rhesus陰性の母親の末梢血の
解析による胎児RhD状態の出生前決定. Lancet 341:1147, 1993 28. Maaskant-van Wijk PA, Hemker MB, Douglas-Berger Lら、Rhesus系の民族
性変化. Transfusion 1999;39:(10S)103S-4S (Abstract). 29. Maaskant-van Wijk PA, Faas BHW, de Ruijter JAM, Overbeeke MAM, von d
em Borne AEGK, van Rhenen DJ, van der Schoot CE.RHD特異的エキソンの頻回
のポリメラーゼ連鎖反応解析によるRHDの遺伝子型分類. Transfusion 1998;38:1
015-21. 30. Maaskant-van Wijk PA, Beckers EAM, van Rhenen DJ, Mouro I, Colin Y,
Cartron J-P, Faas BHW, van der Schoot CE, Apoil PA, Blancher Aら、RHD(VI
)欠損遺伝子型が存在しない証拠. Blood 1997;90:1709-11. 31. MacGeoch C, Mitchell CJ, Carritt B, Avent ND, Ridgwell K, Tanner MJ,
Spurr NK:染色体領域1p36.13----p34へのヒト30kDal Rh(rhesus)血液型-抗原-
関連タンパク質（Rh30A）の染色体座位の割当. Cytogenet Cell Genet 59:261,
1992 32. Mourant AE, Kopec AC, Domaniewska-Sobczak K:ヒト血液型および他の多型
の分布. London, Oxford University Press, 1976 33. Okuda H, Suganuma H, Tsudo N, Omi T, Iwamoto S, Kajii E:RHD遺伝子とR
HCE遺伝子の間のスペーサーの配列解析. Biochem Biophys Res Commun 263:378,
1999 34. Okuda H, Kawano M, Iwamoto S, Tanaka M, Seno T, Okubo Y, Kajii E:RHD
遺伝子は、RhD陰性日本人ドナーにおいて高度に検出可能である. J Clin Invest
100:373, 1997 35. Onda M, Fukuda M:ヒトゲノムＤＮＡを含むP1プラスミドにより示されるグ
リコホリンＡ、ＢおよびＥをコードする遺伝子の詳細な物理マッピング. Gene 1
59:225, 1995 36. Reboul J, Gardiner K, Monneron D, Uze G, Lutfalla G:インターフェロン
／インターロイキン−10レセプター遺伝子クラスターの比較ゲノム解析. Genome
Res 9:242, 1999 37. Salvignol I, Calvas P, Socha WW, Colin Y, Le Van Kim C, Bailly P, Ru
ffie J, Cartron JP, Blancher A:非ヒト霊長類におけるＲＨ様血液型遺伝子産
物の構造解析. Immunogenetics 41:271, 1995 38. Singleton BK, Green CA, Avent ND, Martin PG, Smart E, Daka A, Narter
-Olaga EG, Hawthorne LM, Daniels G:RhD陰性血液型表現型を有するアフリカ人
における37塩基対複製およびナンセンス変異を含むRHD偽遺伝子の存在. Blood 9
5:12, 2000 39. Urbaniak SJ, Robertson AE:凍結／解凍血液を用いた抗Ｄ産生についてのRh
陰性男性ボランティアを免疫化する成功したプログラム. Transfusion 21:64, 1
981 40. Wagner FF, Gassner C, Muller TH, Schonitzer D, Schunter F, Flegel WA
:３つの分子構造は、免疫血液学的特徴をともなったRhesusDカテゴリーVI表現型
を引き起こす. Blood 91:2157, 1998 41. Wagner FF, Kasulke D, Kerowgan M, Flegel WA:南西ドイツにおける、血液
型ABO、Rhesus、ＤカテゴリーVI、Kell、および臨床的に関連した高頻度抗原の頻
度. Infusionsther Transfusionsmed 22:285, 1995 42. Wagner FF, Gassner C, Muller TH, Schonitzer D, Schunter F, Flegel WA
:弱いＤ表現型の分子基礎. Blood 93:385, 1999 43. Wagner FF, Frohmajer A, Ladewig B, Eicher NI, Lonicer CB, Muller TH,
Siegel MH, Flegel WA.弱いＤ対立遺伝子は、異なる表現型を示す. Blood 2000
; 95: 2699 − 2708 44. Wagner FF, Flegel WA.Rhesusボックスで生じたRHD遺伝子欠失. Blood 2000
; 45. Wissenschaftlicher Beirat der Bundesarztekammer; Paul-Ehrlich-Instit
ut. 血液型決定および輸血のガイドライン（血液治療）(Richtlinien zur Blutg
ruppenbestimmung und Bluttransfusion (Hamotherapie)). Koln: Deutscher Ar
zte-Verlag; 1996. 46. Legler TJ, Kohler M, Mayr WR, Panzer S, Ohto H, Fischer GF;頻回のポ
リメラーゼ連鎖反応およびライゲーションベース分類によるヒト血小板抗原系１
〜５の遺伝子型分類. Transfusion 1996 May; 36(5): 426-31
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＲＨ遺伝子座の模式的構造を示す図である。遺伝子及びRhesusボック
スの位置及び方向を、それぞれ白抜きの矢印及び三角で示す（パネルＡ）。エキ
ソンを垂直方向のバーとして示し、エキソン数を示す。２つのＲＨ遺伝子は、反
対の方向を有し、互いに３’末端で向かい合っており、約３０，０００ｂｐ離れ
ている。第３の遺伝子、ＳＭＰ１は、ＲＨＤと同じ方向を有し、ＲＨＤとＲＨＣ
Ｅとの間に位置する。ＲＨＤ遺伝子は、両端で２つの高度に相同的なRhesusボッ
クス（ｂ）に隣接する。全てのエキソンは、ＲＨＤ及びＳＭＰ１の３’末端のエ
キソンを除いて２００ｂｐ未満である。当該構造を確立するために使用されるデ
ータ（パネルＢ）としては、ｃＤＮＡ（水平方向の矢印）において表されるゲノ
ム配列の伸長、ゲノムクローンに対する同一性及び相同性（バーａ：ｄＪ４６５
Ｎ２４と同一；ｂ：ｄＪ４６９Ｄ２２に対するＲＨＤの相同性；ｃ：ｄＪ４６５
Ｎ２４に対するＲＨＤの３’部分の相同性；ｄ：ｄＪ４６９Ｄ２２との同一性）
が挙げられる。３つのブリッジするPCR反応の位置が示されている。ＲＨＤとＲ
ＨＣＥとの間の「スペーサー」配列としてOkudaら（Okuda, Biochem.Biophys.Re
s.Commun.263:378,1999）により以前に報告されたヌクレオチドストレッチの正
確な位置が標識されたバーにより示されている。
【図２】 図２は、ＲＨＤ及びＲＨＣＥ遺伝子の５’に位置するＤＮＡ領域の染色体機構
を示す図である。ＲＨＣＥ及びＲＨＤの５’隣接領域の提案される構造を示す（
パネルＡ）。ＡＴＧ開始コドンのすぐ５’の全４，９４１ｂｐがＲＨＣＥとＲＨ
Ｄ遺伝子との間で相同である（垂直方向に平行線を引いたバー）。当該相同領域
を越えて相同性は存在しない（斜めに平行線を引いたバー）。２つのゲノムクロ
ーン、ｄＪ４６９Ｄ２２及びｄＪ４６５Ｎ２４を、プライマー設計に利用した。
ＤＪ４６９Ｄ２２は、示されたＲＨＣＥ領域の全長を含み、一方でｄＪ４６５Ｎ
２４は、相同領域に４６６ｂｐのみが伸長している。いくつかのＰＣＲプライマ
ーの位置を示す（ａ、rey14a；ｂ、rend32；ｃ、rey15a；ｄ、re014；ｅ、re011
d）。この提案される構造は、いくつかのＰＣＲ反応により支持されている（パ
ネルＢ）。フォワードプライミングは、プライマーａ（ＲＨＣＥ特異的、レーン
１〜３）、プライマーｂ（ＲＨＤ特異的、レーン４〜６）、及びプライマーｃ（
ＲＨＣＥ及びＲＨＤ相同領域、レーン７〜９）を用いて行った。増幅産物は、Ｒ
ＨＤ特異的リバースプライマーｅ（レーン２）でプライマーａについて欠失して
おり、及びＲＨＤ陰性ＤＮＡ（レーン６）でプライマーｂについて欠失していた
。他の７つのＰＣＲ反応は、パネルＡに示されるゲノム構造に従って推定サイズ
の増幅産物を生じた。
【図３】 図３は、ＳＭＰ１遺伝子の染色体機構を示す図である。ＳＭＰ１遺伝子は７つ
のエキソンを有する。イントロンの位置及びおおよそのサイズが示されている。
公開されたｃＤＮＡ（Genbank登録番号ＡＦ０８１２８２）の開始は、Rhesusボ
ックスの下流からの１５ヌクレオチドにより分離されている。エキソン１は、５
’非翻訳配列のみを含み、ＳＭＰ１開始コドンはエキソン２に配置されている。
エキソン７は、１６コドンを含み、１，６５６ｂｐの３’非翻訳配列を含み、Ｒ
ＨＣＥエキソン１０の３’非翻訳配列と近接している。
【図４】 図４は、Rhesusボックスの染色体機構を示す図である。Rhesusボックス上流の
物理的伸長（５’からＲＨＤ）は、９，１４５ｂｐ（黒バー）である。ボックス
のヌクレオチド配列の約６３％が反復ＤＮＡからなる；反復ファミリーのタイプ
が示されている。Rhesusボックスの上流と下流との間の全体の相同性は、９８．
６％であるが、１，４６３ｂｐ同一領域（水平方向の矢印）内では、単一の４ｂ
ｐ挿入が存在するだけである（垂直方向の二重線）。ＣｐＧアイランド（Island
）（２つの矢尻を有する矢印）が、３’末端に配置され、 ＳＭＰ１プロモータ
ーに隣接するRhesusボックスの下流（３’からＲＨＤ）に存在する。
【図５】 図５は、Ｒｈ陰性ハプロタイプ中のＲＨＤ遺伝子欠損を示す図である。Rhesus
ボックスの３つの３，１００ｂｐセグメントが示されている。上部の線は、Ｄ陽
性におけるRhesusボックスの上流のヌクレオチド配列を示し、下部の線は、Ｄ陽
性におけるRhesusボックスの下流のヌクレオチド配列を示す。中央の線は、Ｒｈ
陰性により保有される単一のRhesusボックスのヌクレオチド配列を示す。星印は
、同一のヌクレオチドを示す。ＲＨＤ欠失は、１，４６３ｂｐの同一領域の一部
である完全に同一な９０３ｂｐセグメントで起こった。プライマーｒｅｚ７及び
ｒｎｂ３１の位置を示す（ｍはミスマッチを示す）。ＰｓｔＩ制限部位は、挿入
記号（＾）により示す。３つのRhesusボックスを登録番号ＡＪ２５２３１１（Rh
esusボックス上流）、ＡＪ２５２３１２（Rhesusボックス下流）、及びＡＪ２５
２３１３（ハイブリッドRhesusボックス）の下でＥＭＢＬに寄託されている。
【図６】 図６は、一般的なＲＨＤ陰性ハプロタイプにおけるＲＨＤ欠損の特異的検出の
ための２つの技術的手順を示す図である。非Rhesusボックス配列内に配置された
プライマーを用いたロングレンジＰＣＲ増幅（パネルＡ）及びRhesusボックス内
に配置されたプライマーを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰを示す（パネルＢ）。推定さ
れる遺伝子型を示す。ロングレンジＰＣＲのプライマーをRhesusボックスの上流
の５’（プライマーｒｅｚ４）かつＳＭＰ１エキソン１内（プライマーｓｒ９）
に配置した。ＲＨＤ陰性ハプロタイプを特異的に検出した（パネルＡ、レーン１
〜６）。ＲＨＤ遺伝子についてＤＮＡ同型接合性は陰性であった。なぜなら、Ｐ
ＣＲはＲＨＤ遺伝子の７０，０００ｂｐのＤＮＡストレッチを増幅し得ないから
である。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に関して、ＰＣＲ増幅産物（プライマーｒｅｚ７及
びｒｎｂ３１）をＰｓｔＩで消化した。Ｄ陰性において、増幅産物中に３つのＰ
ｓｔＩ部位が存在し（図５参照）、１，８８８ｂｐ、５６４ｂｐ、３９７ｂｐ、
及び１７９ｂｐの断片を生じる（レーン１〜３）。Ｄ陽性のRhesusボックスの下
流は、１つのＰｓｔＩ部位を欠失し、１，８８８ｂｐ、７４４ｂｐ、及び３９７
ｂｐの断片を生じる（レーン７〜９）。ＲＨＤ+／ＲＨＤ-異型接合性は、７４４
及び５６４ｂｐの両方の断片を示す（レーン４〜６）。ヘテロダイマーがＰｓｔ
Ｉにより切断されないため、５６４ｂｐ断片は弱く現れる。プライマーｒｎｂ３
１は、Ｄ陽性のRhesusボックスの上流を増幅しない。
【図７】 図７は、白人に優勢なＲＨＤ陰性ハプロタイプを引き起こす提案される機構の
モデルを示す図である。ＲＨＤ及びＲＨＣＥ遺伝子の遺伝子座の物理的構造を示
す（パネルＡ）。Rhesusボックスの上流と下流との間にわたる不均一な横断は、
それらの高相同性により引き起こされうる（パネルＢ）。Rhesusボックス内のブ
レークポイント領域は、９０３ｂｐについて１００％相同であることが見出され
た（図５を参照）。染色体をわたる横断（crossed over chromosome）を分離す
ることにより、現存しているＲＨＤ陰性ハプロタイプのＲＨ遺伝子構造が生じる
（パネルＣ）。
【図８】 図８は、ＲＨＤ陰性のハイブリッドRhesusボックスのＤＮＡ配列を示す図であ
る。
【図９】 図９は、Ｄ陽性のRhesusボックスの上流のＤＮＡ配列を示す図である。
【図１０】 図１０は、Ｄ陽性のRhesusボックスの下流のＤＮＡ配列を示す図である。
【図１１】 図１１は、ＲＨＤプロモーターのＤＮＡ配列を示す図である。最後の３つのヌ
クレオチドは、ＲＨＤ遺伝子のコドン１を示す。
【図１２】 図１２は、ＲＨＤイントロン３中のＣｄｅSブレークポイント領域を示す図で
ある。エキソン３／イントロン３ジャンクションの３’の２，９３８〜３，６３
６ｂｐのＣｄｅs、ＲＨＤ及びＲＨＣＥのイントロン３の一部のヌクレオチド配
列を示す。ＲＨＣＥ（GenBank登録番号ＡＬ０３１２８４）の遺伝子の５’部分
を含有する、染色体１ｐ３５．１−３６．１３上のクローンＲＰ３−４６９Ｄ２
２に由来するヒトＤＮＡ配列をリファレンスとして入手した；数字は、ＲＨＣＥ
遺伝子中のイントロン３の最初の塩基と比べたこの配列における位置を示す。対
応するＲＨＤ遺伝子配列は、GenBank登録番号ＡＬ１３９４２６に由来する。Ｃ
ｄｅS配列のＲＨＤ又はＲＨＣＥの起点を示すヌクレオチドを強調する。ＣｄｅS のブレークポイント領域を含む１５４ｂｐのＤＮＡストレッチを星印で示す。
【図１３】 図１３は、ＲＨＤイントロン７中のＣｄｅSブレークポイント領域を示す図で
ある。エキソン７／イントロン７ジャンクションの３’の約２，７２６〜３，７
１９のＣｄｅS、ＲＨＤ及びＲＨＣＥのイントロン７の一部のヌクレオチド配列
を示す。ＲＨＣＥ（GenBank登録番号ＡＬ０３１２８４）の遺伝子の５’部分を
含む染色体１ｐ３５．１−３６．１３上のクローンＲＰ３−４６９Ｄ２２に由来
するヒトＤＮＡ配列をリファレンスとして入手した；数字はＲＨＣＥ遺伝子中の
イントロン７の最初の塩基と比べた当該配列中の位置を示す。対応するＲＨＤ遺
伝子配列は、GenBank登録番号ＡＬ１３９４２６に由来する。ＣｄｅS配列のＲＨ
Ｄ又はＲＨＣＥの起点を示すヌクレオチドを強調する。ＣｄｅSのブレークポイ
ント領域を含む６６６ｂｐのＤＮＡストレッチを星印で示す。
【図１４】 図１４は、ＰＣＲ−ＳＳＰによるＣｄｅSの特異的検出を示す図である。イン
トロン７中のＣｄｅSの３’ブレークポイント領域を検出するＰＣＲ−ＳＳＰを
示す。ＲＨＤ陰性試料（レーン１、ｃｃｄｄｅｅ）及び正常なＲＨＤ陽性試料（
レーン２、ｃｃＤ．ＥＥ）の両方が、４３４ｂｐ対照産物のみを生じ、これはＨ
ＧＨ遺伝子に由来する。対照的に、ＣｄｅS試料（ＣｃｄｄＥｅ、レーン３）は
、４３４ｂｐ対照断片に加えて、３３８ｂｐ特異的産物を生じ、これはイントロ
ン７中のブレークポイント領域に由来する。当該反応は、ＣｄｅSに特異的であ
る；２つの部分的なＤ表現型ＤIVa（レーン４）及びＤIIIタイプＩＶ（レーン５
）は特異的産物を生じない。該反応はまた、ＣｄｅSが、ＲＨＤΨ／ＣｄｅS試料
（レーン６）におけるように、他のＲＨＤアレレにトランスで生じる場合、Ｃｄ
ｅSを特異的に検出する。
【図１５】 図１５は、通常のＤＮＡタイピングのためのＲＨＤ ＰＣＲ−ＳＳＰを示す。
２つの頻回反応、イントロン４／エキソン７頻回ＰＣＲ−ＳＳＰ（パネルＡ）お
よびＲＨＤ（Ｗ１６Ｘ）およびＲＨＤΨの特異的検出により高められたイントロ
ン７ＰＣＲ（パネルＢ）からなるモジュラーシステムとしてＰＣＲを行なう。通
常のＤ陽性試料（レーン１）、通常のＤ陰性試料（レーン２）、数個のまれなＤ
陰性試料（レーン３〜６）および主なＤ陽性ＲＨＤバリアント（レーン７および
８）に対する結果を示す。標準のＤ陽性およびＤ陰性試料ならびにＤカテゴリー
ＩＶおよびＶＩを反応Ａにおいて認識する。イントロン７バンドの不在により反
応ＢでＲＨＤ−ＣＥ（８−９）−Ｄが検出される。ＲＨＤ（Ｗ１６Ｘ）およびＲ
ＨＤΨの存在もまた反応Ｂで検出される。バンドサイズは、パネルＡ、対照、４
３４ｂｐ（ＨＧＨ遺伝子）；イントロン４、２２６ｂｐ；エキソン７、１２３ｂ
ｐであり；パネルＢ、対照、６５９ｂｐ（Ｒｈｅｓｕｓボックスの約９０，００
０ｂｐ５’側の第１染色体ゲノム配列）；イントロン７、３９０ｂｐ；ＲＨＤ（
Ｗ１６Ｘ）、２４８ｂｐ；ＲＨＤΨ、１５４ｂｐである。内部対照増幅産物（am
plicon）は、特異的な増幅産物より大きくなるように工夫され、特異的な産物が
増幅される場合、競合のために抑制されうる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年１月３１日（２００２．１．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 7/00 ４Ｈ０４５ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 21/08 7/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ 21/08 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 1/68 Ｍ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆ 33/566 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA19 AA20 BA80 CA02 CA09 CA20 DA02 GA11 GA25 HA11 HA13 HA14 HA20 4B063 QA01 QA05 QA13 QA18 QQ03 QQ43 QQ79 QR08 QR31 QR32 QR35 QR40 QR42 QR48 QR56 QR62 QR77 QR79 QR84 QS16 QS25 QS34 QS36 QX02 QX10 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CA20 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA93Y AA95X AB01 AC14 AC20 BA01 BA16 CA24 CA44 CA46 4C085 AA13 AA14 BB11 CC07 CC08 CC21 CC31 DD62 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA42 DA75 DA76 EA20 EA50 FA71 FA72 FA74

Claims (100)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 RHD遺伝子、SMP1遺伝子、RHCE遺伝子及び／又は１若しくは
    複数のRhesusボックス、好ましくは、ハイブリッドRhesusボックス、上流Rhesus
    ボックス及び／又は下流Rhesusボックスを含有してなリ、その配列が、図８〜図
    １０に示されてなる、Rhesus遺伝子座を表す核酸分子構造。
  2. 【請求項２】 共通のRHD陰性ハプロタイプを示してなる、請求項１記載の
    核酸分子構造。
  3. 【請求項３】 共通のRHD陰性ハプロタイプにおけるRHD欠失のブレークポイ
    ント領域を隣接してなる、Rhesusボックスと称する(dubbed)核酸分子構造。
  4. 【請求項４】 上流Rhesusボックス、下流Rhesusボックス又は両方が関与す
    るRHD遺伝子欠失を含有したRHD陰性ハプロタイプを表してなる、請求項１記載の
    核酸分子構造。
  5. 【請求項５】 共通のRHD陰性ハプロタイプにおけるRhesusボックスを隣接
    してなる核酸分子構造。
  6. 【請求項６】 共通のRHD陽性ハプロタイプを表してなる、請求項１記載の
    核酸分子構造。
  7. 【請求項７】 血清学的にRhD陰性に分類されたRHD陽性ハプロタイプを含有
    した試料に由来する、請求項１記載の核酸分子構造。
  8. 【請求項８】 該試料が、カフカス人集団から選ばれたものである、請求項
    ７記載の核酸分子構造。
  9. 【請求項９】 部分RHD-欠失又は置換を含有してなる、請求項７又は８記載
    の核酸分子構造。
  10. 【請求項１０】 RHDエキソン３〜７、又はCcddEe表現型を生じさせるRHDエ
    キソン４〜７、又はRHDエキソン１〜９の欠失又は置換を含有してなる、請求項
    ９記載の核酸分子構造。
  11. 【請求項１１】 イントロン3に局在し、かつ配列が図１２に示される5'ブ
    レークポイント領域、及び／又はイントロン7に局在し、かつ配列が図１３に示
    される5'ブレークポイント領域、又は両方のブレークポイント領域を保持し、Cd
    esハプロタイプを表すが、他のRhesusハプロタイプにも生じるRHD-CE-Dハイブリ
    ッドアレレを含有してなる、請求項９記載の核酸分子構造。
  12. 【請求項１２】 RHD-CE(3-7)-Dハイブリッドアレレ、CcddEe表現型を生じ
    させるRHD-CE(4-7)-Dハイブリッドアレレ又はRHCE(1-9)-D(10)ハイブリッドアレ
    レを含有してなる、請求項１、6、７、又は８記載の核酸分子構造。
  13. 【請求項１３】 請求項１１記載のRHD-CE-Dハイブリッドアレレが、抗原C
    反応性を有するポリペプチドをコードする、請求項１１記載の核酸分子構造。
  14. 【請求項１４】 RHD遺伝子のコード領域内又は5'若しくは3'スプライス部
    位内に一塩基置換を含有してなる、請求項６〜８いずれか１項に記載の核酸分子
    構造又はRHD遺伝子由来の核酸分子。
  15. 【請求項１５】 該塩基置換が、コドン１６において終止コドンを生じさせ
    る、請求項１４記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  16. 【請求項１６】 該置換遺伝子が、RHD(W16X)変異を生じさせる、請求項１
    ５記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  17. 【請求項１７】 該置換が、４８位のヌクレオチドにおけるGからAへの置換
    である、請求項１６記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  18. 【請求項１８】 該塩基置換が、コドン３３０において、終止コドンを生じ
    させる、請求項１４記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  19. 【請求項１９】 該置換が、RHD(Y330X)変異を生じさせる、請求項１８記載
    の核酸分子構造又は核酸分子。
  20. 【請求項２０】 該置換が、９８５位のヌクレオチドにおけるCからGへの置
    換である、請求項１９記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  21. 【請求項２１】 該置換が、コドン２１２においてミスセンス変異を生じさ
    せる、請求項１４記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  22. 【請求項２２】 該置換が、RHD(G212V)ミスセンス変異を生じさせる、請求
    項２１記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  23. 【請求項２３】 該置換が、６３５位におけるGからTへの置換である、請求
    項２２記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  24. 【請求項２４】 該置換が、エキソン8/イントロン8境界におけるコンセン
    サススプライス部位を含有した4-ヌクレオチドの配列内、6-ヌクレオチドの配列
    内又は8-ヌクレオチドの配列内に変異を生じさせる、請求項１４記載の核酸分子
    構造又は核酸分子。
  25. 【請求項２５】 該置換が、RHD(G1153(+1)A)変異を生じさせる、請求項２
    ４記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  26. 【請求項２６】 該置換が、イントロン８の5'スプライス部位におけるAGgt
    からAGatの置換である、請求項２５記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  27. 【請求項２７】 RhD陰性表現型に相関する、請求項１５〜２６いずれか１
    項に記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  28. 【請求項２８】 該置換が、エキソン3/イントロン3境界におけるコンセン
    サススプライス部位を含有した4-ヌクレオチドの配列内、6-ヌクレオチドの配列
    内又は8-ヌクレオチドの配列内に変異を生じさせる、請求項１４記載の核酸分子
    構造又は核酸分子。
  29. 【請求項２９】 該置換が、RHD(G486(+1)A)変異を生じさせる、請求項２８
    記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  30. 【請求項３０】 該置換が、イントロン3の5'スプライス部位におけるACgt
    からACatの置換である、請求項２９記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  31. 【請求項３１】 該置換が、エキソン9/イントロン9境界にコンセンサスス
    プライス部位を含有した4-ヌクレオチドの配列内、6-ヌクレオチドの配列内又は
    8-ヌクレオチドの配列内の変異を生じさせる、請求項１４記載の核酸分子構造又
    は核酸分子。
  32. 【請求項３２】 該置換が、RHD(K409K)変異を生じさせる、請求項３１記載
    の核酸分子構造又は核酸分子。
  33. 【請求項３３】 該置換が、イントロン9の5'スプライス部位でのAGgtからA
    Agtの置換である、請求項３２記載の核酸分子構造又は核酸分子。
  34. 【請求項３４】 Del-表現型と相関する、請求項２８〜３３記載の核酸分子
    構造又は核酸分子。
  35. 【請求項３５】 当該技術分野で公知の技術、好ましくは、PCR-RFLP、PCR-
    SSP又はロング−レンジPCRにより、RHD遺伝子、SMP1遺伝子及び／又は１若しく
    は複数のRhesusボックス、好ましくは、配列が、図８〜１０に示されるものであ
    って、ハイブリッドRhesusボックス、上流Rhesusボックス及び／又は下流Rhesus
    ボックス、、あるいは請求項２〜３４のいずれかの構造的特徴若しくは塩基配列
    又は両方、あるいはそれらの組合せを用いることによる、試料中のRHD陰性ハプ
    ロタイプの特異的検出方法。
  36. 【請求項３６】 下記ステップ： (a) 血液試料又は血液ドナーからDNAを単離するステップ (b) PCRを行うように、少なくとも２つの逆に向き合うプライマーとDNAとをス
    トリンジェントな条件下にハイブリダイズさせるステップ、 (c) 標的配列を増幅するステップ、 (d) ゲル上で増幅産物を分離するステップ、及び (e) 増幅産物（the amplicons）を解析するステップ を含む、共通のRHD陰性ハプロタイプの特異的検出方法。
  37. 【請求項３７】 ハイブリッドRhesusボックスを検出するステップを含む、
    試料中の共通のRHD陰性ハプロタイプの特異的検出方法。
  38. 【請求項３８】 ハイブリッドRhesusボックスとその隣接領域とを含有した
    分子核酸構造を評価するステップを含む、試料中の共通のRHD陰性ハプロタイプ
    の特異的検出方法。
  39. 【請求項３９】 請求項１１記載のブレークポイント領域のいずれかを検出
    するステップを含む、試料中のRHD陰性ハプロタイプの特異的検出方法。
  40. 【請求項４０】 該検出又は評価が、ハイブリッドRhesusボックス又はその
    一部を含有した核酸分子の長さの決定を含む、請求項３７又は３８記載の方法。
  41. 【請求項４１】 該検出又は評価が、PCR-RFLP、PCR-SSP若しくはロング−
    レンジPCR、あるいはサザンブロット解析で、ハイブリッドRhesusボックス、ブ
    レークポイント又は図４若しくは５若しくは１２若しくは１３に示されたブレー
    クポイント領域に特異的にハイブリダイズするプローブあるいは上流若しくは下
    流Rhesusボックスに特異的にハイブリダイズするプローブにより行われる、請求
    項３７〜４０いずれか１項に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 該プローブが、ブレークポイント又は図４若しくは５若し
    くは１２若しくは１３に示されたブレークポイント領域にハイブリダイズする、
    請求項４１記載の方法。
  43. 【請求項４３】 該ハイブリダイゼーションの検出が、サザンブロット解析
    、ゲル電気泳動、バイオチップ解析、蛍光又は分子量決定により行われる、請求
    項４１又は４２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 請求項１〜３４いずれか１項に記載の核酸分子構造又は核
    酸分子を含有してなるベクター。
  45. 【請求項４５】 請求項４４記載のベクターにより形質転換されてなる非ヒ
    ト宿主。
  46. 【請求項４６】 請求項４５記載の宿主を適切な条件下に培養する工程、及
    び産生されたRhesusタンパク質を単離する工程を含む、RHD遺伝子のタンパク質
    産物の製造方法。
  47. 【請求項４７】 請求項１〜３４いずれか１項に記載の核酸分子又は構造に
    よりコードされるもの又は請求項４６記載の方法により製造されるものである、
    RHD遺伝子のタンパク質産物。
  48. 【請求項４８】 請求項１〜３４いずれか１項に記載の核酸分子構造若しく
    は核酸分子の部分であって、かつ該(ミスセンス)変異若しくは該終止コドンを含
    有した部分、又はその相補的な部分にストリンジェントな条件下にハイブリダイ
    ズするか、あるいは該ハイブリッド遺伝子のブレークポイントを含む領域にハイ
    ブリダイズするオリゴヌクレオチド。
  49. 【請求項４９】 請求項４７のRHD遺伝子のタンパク質産物に特異的に結合
    する抗体又はアプタマー又はファージ。
  50. 【請求項５０】 ストリンジェントな条件下に、請求項４８記載のオリゴヌ
    クレオチド及びRHDΨ構造にハイブリダイズする少なくとも１つの他のオリゴヌ
    クレオチドを、ヒトから得られた試料に含有された核酸分子にハイブリダイズす
    るステップ及び、該ハイブリダイゼーションを検出するステップを含む、RHDΨ
    及び請求項１〜３４のいずれか１項に記載のRHD分子構造のいずれかの存在の同
    時検出方法。
  51. 【請求項５１】 ストリンジェントな条件下に、請求項４８記載のオリゴヌ
    クレオチドを、ヒトから得られた試料に含有された核酸分子にハイブリダイズす
    るステップ、及び該ハイブリダイゼーションを検出するステップを含む、変異Rh
    esus D抗原をコードした核酸分子の試料中における存在、又はRHD遺伝子の欠失
    を保持し、請求項１〜３４いずれか１項に記載の核酸分子構造又は核酸分子によ
    り特徴付けられた核酸分子の試料中における存在の試験方法。
  52. 【請求項５２】 該ハイブリダイゼーションの産物を制限酵素で消化するス
    テップ、及び該消化の産物を解析するステップをさらに含む、請求項５１記載の
    方法。
  53. 【請求項５３】 請求項１〜３４いずれか１項に記載の核酸分子構造又は核
    酸分子の少なくとも一部分で、かつ該(ミスセンス)変異、該終止コドン又は該ハ
    イブリッド遺伝子のブレークポイントをコードする部分の核酸配列を決定するス
    テップ、及びRHDΨ構造の少なくとも一部分を決定するステップを含む、試料中
    のRHDΨ及び請求項１〜３４いずれか１項に記載のRHD分子構造のいずれかの存在
    の同時試験方法。
  54. 【請求項５４】 請求項１〜３４のいずれか１項に記載の核酸分子構造又は
    核酸分子の少なくとも一部分で、かつ該(ミスセンス)変異、該終止コドン又は該
    ハイブリッド遺伝子のブレークポイントをコードする部分の核酸配列を決定する
    ステップを含む、変異Rhesus D抗原をコードする核酸分子の試料中における存在
    又はRHD遺伝子の欠失を保持し、請求項１〜３４いずれか１項に記載の核酸分子
    構造又は核酸分子により特徴付けられた核酸分子の試料中における存在の試験方
    法。
  55. 【請求項５５】 該核酸配列を決定する前に、該核酸分子又は構造の少なく
    とも前記部分を増幅するステップをさらに含む、請求項５４記載の方法。
  56. 【請求項５６】 RHDΨ及び請求項１〜３４いずれか１項に記載のRHD分子構
    造のいずれかの試料中における存在の同時試験方法であって、前記配列の少なく
    とも 一部分を増幅するプライマーのセットであり、かつ増幅反応で用いられる
    少なくとも１つのプライマーが、請求項４８記載のオリゴヌクレオチドであり、
    かつ少なくとも１つのプライマーが、RHDΨ構造を増幅するプライマーであるプ
    ライマーのセットを用いた増幅反応を行うステップ、及び１若しくは複数の増幅
    産物を解析するステップを含む方法。
  57. 【請求項５７】 変異Rhesus D抗原をコードする核酸分子の試料中における
    存在又はRHD遺伝子の欠失を保持し、請求項１〜３４いずれか１項に記載の核酸
    分子構造又は核酸分子により特徴付けられた核酸分子の試料中における存在の試
    験方法であって、前記配列の少なくとも一部分を増幅するプライマーのセットで
    あり、かつ増幅反応で用いられる少なくとも１つのプライマーが、請求項４８記
    載のオリゴヌクレオチドであるプライマーのセットを用いた増幅反応を行うステ
    ップを含む、試験方法。
  58. 【請求項５８】 該増幅反応に用いられた少なくとも１つのプライマーが、
    請求項４８記載のオリゴヌクレオチドである、請求項５７記載の方法。
  59. 【請求項５９】 該増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により行われるか
    、あるいは該増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である、請求項５５〜５
    ８いずれか１項に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 該PCRが、PCR-RFLP、PCR-SSP又はロング−レンジPCRであ
    る、請求項５９記載の方法。
  61. 【請求項６１】 増幅産物の分子量を解析する、請求項５５〜６０いずれか
    １項に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 下記ステップ： (a) 血液試料又は血液ドナーからDNAを単離するステップ； (b) PCRを行うように、ストリンジェントな条件下に、少なくとも２つの逆に向
    き合うプライマーを、DNAにハイブリダイズするステップ； (c) 標的配列を増幅するステップ； (d) ゲル上で増幅産物を分離するステップ；及び (e) 増幅産物（the amplicons）を解析するステップ を含む、RHD 陽性アレレをコードする請求項７〜３４いずれか１項に記載の核酸
    分子構造又は核酸分子の存在の試験方法。
  63. 【請求項６３】 該RHD陽性アレレが、血清学的にRhD陰性試料に由来するも
    のである、請求項６２記載の方法。
  64. 【請求項６４】 該試料が、カフカス人集団から選ばれる、請求項６２又は
    ６３記載の方法。
  65. 【請求項６５】 請求項４９記載の抗体又はアプタマー又はファージへの特
    異的結合について、ヒトから得られた試料を評価するステップを含む、請求項４
    ７記載のRHD遺伝子のタンパク質産物の試料中における存在の試験方法。
  66. 【請求項６６】 直接凝集法、間接抗グロブリン試験、モノクローナル抗D
    抗体及び／又は吸着／溶出技術を用いるステップを含む、請求項７〜３４いずれ
    か１項に記載の核酸分子構造又は核酸分子をコードするRHD遺伝子のタンパク質
    産物の試料中における存在の試験方法。
  67. 【請求項６７】 該試料が、血液、血清、血漿、胎児組織、唾液、尿、粘膜
    組織、粘液、膣組織、膣から得られた胎児組織、皮膚、毛髪、毛包又は他のヒト
    組織である、請求項３５〜６６いずれか１項に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 胎児細胞を富化すること又は末梢血、血清若しくは血漿な
    どの母体組織から胎児DNA若しくはmRNAを抽出することを含む、請求項６７記載
    の方法。
  69. 【請求項６９】 該核酸分子又は該試料由来のタンパク質性物質を固体支持
    体に固定する、請求項３５〜６８いずれか１項に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 該固体支持体が、チップである、請求項６９記載の方法。
  71. 【請求項７１】 陰性又は陽性Rhesus D表現型の解析のための、請求項１〜
    ３４いずれか１項に記載の核酸分子構造又は核酸分子の使用。
  72. 【請求項７２】 モノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清、好ましく
    は、抗D抗血清、抗C抗血清、抗グロブリン若しくは抗ヒトグロブリン抗血清のア
    フィニティー、アビディティー及び／又は反応性の評価のための、請求項１〜３
    ４いずれか１項に記載の核酸分子構造若しくは核酸分子、請求項４４記載のベク
    ター又は請求項４７記載のRHD遺伝子のタンパク質産物の使用。
  73. 【請求項７３】 モノクロナール抗D若しくは抗C抗体又はポリクローナル抗
    D若しくは抗C抗血清又は抗グロブリン又は抗ヒトグロブリン抗血清又はそれらの
    製剤のアフィニティー、アビディティー及び／又は反応性の評価のための、請求
    項１〜３４いずれか１項に記載の核酸分子構造若しくは核酸分子を保持した発端
    者由来の細胞、好ましくは、赤血球細胞の使用。
  74. 【請求項７４】 (a) 請求項１〜３４いずれか１項に規定されたブレーク
    ポイント又は変異の存在について、発端者の試料の核酸分子構造を試験するステ
    ップ； (b) RHD 遺伝子の変異又は欠失状態とアレレの状態とに基づき、該核酸と該発
    端者の赤血球細胞の表面におけるRHD 遺伝子のタンパク質産物の密度とを関連付
    けるステップ； (c) モノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清又はそれらの製剤と表面にR
    HD遺伝子のタンパク質産物を保持した細胞とを反応させるステップ； (d) ステップ (c)で得られた結果に基づき、該モノクローナル抗体又はポリク
    ローナル抗血清又はそれらの製剤を特徴付けるステップ； を含む、モノクロナール抗体又はポリクローナル抗血清又はそれらの製剤を特徴
    付ける方法。
  75. 【請求項７５】 該特徴付けが、抗体及び抗血清の反応性、感度、アビディ
    ティー、アフィニティー、特異性及び／又は他の特徴の決定を含む、請求項７４
    記載の方法。
  76. 【請求項７６】 表面にRHD遺伝子のタンパク質産物を保持した細胞が、赤
    血球細胞である、請求項７４又は７５記載の記載の方法。
  77. 【請求項７７】 請求項２〜５及び７〜３４いずれか１項に記載の１以上の
    核酸分子構造又は核酸分子の存在について、患者由来の試料を試験するステップ
    を含み、ここで、２つの異なる該核酸分子構造に対する陽性試験が、Rh陰性血液
    の輸血を必要とすることを示す、血液輸血の必要がある患者が、ドナーのRhD陰
    性血液を輸血されるべきかどうかを決定する方法。
  78. 【請求項７８】 請求項１１記載の核酸分子構造の存在について、ドナー由
    来の試料を試験するステップを含み、ここで、請求項１１記載の核酸分子構造に
    対する陽性試験が、ドナーの血液の輸血を排除する、ドナーの血液が、抗原Cに
    曝露されるべきでない輸血の必要がある患者への輸血に適するかどうかを決定す
    る方法。
  79. 【請求項７９】 請求項１〜３４いずれか１項に記載の１以上の核酸分子構
    造又は核酸分子の存在について、ドナー由来の試料を試験するステップを含み、
    ここで、請求項７〜３４記載の１以上の核酸分子構造又は核酸分子に対する陰性
    試験を行うか、あるいは行わないものである請求項２〜５記載の核酸分子構造に
    対する陰性試験が、RhD陰性にタイプ分けされる患者へのドナーの血液の輸血を
    排除する、ドナーの血液が、輸血を必要とする患者への輸血に用いてもよいかど
    うかを決定する方法。
  80. 【請求項８０】 請求項１〜３４いずれか１項に規定された１以上の核酸分
    子構造又は核酸分子の存在について、胎児の父から得られた試料を評価するステ
    ップを含む、RhD陰性母が、RhD陽性胎児を妊娠若しくはもつリスク又は抗D力価
    をもつ母が、新生児の溶血性疾患を発症するリスクをもって胎児を妊娠若しくは
    もつリスクの評価方法。
  81. 【請求項８１】 該核酸分子構造が、変異又は欠失を保持する、請求項８０
    記載の方法。
  82. 【請求項８２】 請求項１〜３４いずれか１項に記載の１以上の核酸分子構
    造又は核酸分子の存在について、男性から得られた試料をアッセイすることによ
    る男性が子供の父である可能性又は見込みの評価方法であり、ここで、試験結果
    は、該男性が、子供の父である可能性又は見込みを推量するのに用いられた請求
    項２〜５及び７〜３４記載の核酸分子構造若しくは核酸分子(a nucleic molecul
    e)のいずれかのホモ接合、ヘテロ接合又は非存在を決定するために用いられる、
    男性が子供の父である可能性又は見込みの評価方法。
  83. 【請求項８３】 抗Dを妊婦に投与するステップを含み、ここで、胎児が、
    請求項２〜５及び７〜３４いずれか１項に記載の２つの核酸分子構造又は核酸分
    子を保持しないか、あるいは請求項２〜５及び７〜３４いずれか１項に記載のい
    ずれかの核酸分子構造に対してホモ接合である、Rhesus D陰性妊婦の治療方法。
  84. 【請求項８４】 RHD遺伝子のタンパク質産物の決定のための、請求項４９
    で特徴付けられたアプタマー、ファージ、モノクローナル抗体若しくはポリクロ
    ーナル抗血清又はそれらの製剤の使用。
  85. 【請求項８５】 RHD遺伝子のタンパク質産物の決定が、血液型タイピング
    に関連して行われる、請求項８４記載の使用。
  86. 【請求項８６】 請求項４９記載の抗体又はアプタマー又はファージを含有
    してなる製剤。
  87. 【請求項８７】 (a) 請求項４７記載のRHD遺伝子のタンパク質産物とVH若
    しくはVL鎖又はその組合せをファージ表面に提示するファージライブラリー又は
    アダタマーとを接触させるステップ； (b) 該タンパク質産物に結合するファージ又はアプタマーを同定するステップ
    ；及び、任意に (c) ステップ(a)及び (b)を１回以上繰り返すステップ を含む、請求項４７記載のRHD遺伝子タンパク質産物に特異的に結合する抗体VH
    若しくはVL鎖又はその組合せ又はアプタマーの同定方法。
  88. 【請求項８８】 (a) 請求項47記載のタンパク質産物と１以上のモノクロ
    ーナル抗体とを接触させるステップ； (b) 該タンパク質に結合するモノクローナル抗体を同定するステップ；及び任
    意に (c) ステップ(a)及び(b)を１回以上繰り返すステップ を含む、請求項４７記載のRHD遺伝子のタンパク質産物に特異的に結合するモノ
    クローナル抗体の同定方法。
  89. 【請求項８９】 請求項４７記載のRHD遺伝子のタンパク質産物に特異的に
    結合する抗体VH若しくはVL鎖又はその組合せ又はアプタマーの同定方法であって
    、 (aa) 該タンパク質産物；及び (ab) (aa)のRHD遺伝子のタンパク質産物よりも高い、等しい、又は低いモル質
    量で存在する正常Dポリペプチド とVH若しくはVL鎖又はその組合せをファージ表面に提示するファージライブラリ
    ー又はアダタマーとを接触させるステップ； (b) RHD遺伝子のタンパク質産物に結合するファージ又はアプタマーを同定する
    ステップ；及び任意に (c) ステップ(a)及び (b)を１回以上繰り返すステップ を含む、同定方法。
  90. 【請求項９０】 (aa) RHD遺伝子のタンパク質産物; 及び (ab) (a)のRHD遺伝子のタンパク質産物よりも高い、等しい、又は低いモル質量
    で存在する正常Dポリペプチド と１以上のモノクローナル抗体とを接触させるステップ； (b) (a)のRHD遺伝子のタンパク質産物に結合するモノクローナル抗体を同定す
    るステップ；及び任意に (c) ステップ (a)及び (b)を１回以上繰り返すステップ を含む、請求項４７記載のRHD遺伝子のタンパク質産物に特異的に結合するモノ
    クローナル抗体の同定方法。
  91. 【請求項９１】 RHD遺伝子のタンパク質産物が、細胞の表面に露出される
    、請求項８７〜９０いずれか１項に記載の方法。
  92. 【請求項９２】 ポリペプチド又は宿主細胞を固体支持体に固定する、請求
    項８７〜９１いずれか１項に記載の方法。
  93. 【請求項９３】 ステップ(b)又は(c)の後、下記ステップ： (d) VH又はVL鎖のアミノ酸配列を同定及び／又は該アミノ酸配列をコードする
    核酸配列を同定するステップ を行う、請求項８７〜９２いずれか１項に記載の方法。
  94. 【請求項９４】 １回の選別のみが同定のために行われる場合、(a)のRHD遺
    伝子のタンパク質分子の数が、ファージ粒子の数を超えるモル過剰である、請求
    項８７〜９０いずれか１項に記載の方法。
  95. 【請求項９５】 請求項４９記載のモノクローナル抗D若しくは抗C抗体又は
    ポリクローナル抗D若しくは抗C抗血清又は抗グロブリン又は抗ヒトグロブリン抗
    血清又はその製剤のアフィニティー、アビディティー及び／又は反応性を評価す
    るための、請求項４７記載のRHD遺伝子のタンパク質産物又は請求項４６記載の
    方法により製造されたタンパク質産物を含有した発端者の細胞、好ましくは、赤
    血球細胞の使用。
  96. 【請求項９６】 SMP1-多型に遺伝学的に連動した特異的RH(RHD-RHCE)-ハプ
    ロタイプを決定するための、該多型の使用。
  97. 【請求項９７】 SPM1遺伝子内のSMP1-多型を決定するステップを含む、特
    異的RH (RHD-RHCE)-ハプロタイプの検出方法。
  98. 【請求項９８】 (a) 請求項４８記載のオリゴヌクレオチド；及び／又は
    (b) 請求項４９記載の抗体；及び／又は (d) 請求項４９記載のアプタマー；及び／又は (e) 請求項４９記載のファージ；及び／又は (e) 請求項５４〜６１いずれか１項に記載の増幅反応を行うに有用な一対のプ
    ライマー を含有してなるキット。
  99. 【請求項９９】 請求項１１に記載のブレークポイント領域のいずれかを検
    出するステップを含む、RHD遺伝子によりコードされた抗原Cの存在の決定方法。
  100. 【請求項１００】 請求項３９記載の方法のステップを含む、抗原Cの存在
    の決定方法。
JP2001535401A 1999-11-02 2000-10-31 Ｒｈｄ陰性遺伝子座の分子構造 Expired - Lifetime JP4620920B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99121686.2 1999-11-02
EP99121686 1999-11-02
EP00111696.1 2000-05-31
EP00111696 2000-05-31
PCT/EP2000/010745 WO2001032702A2 (en) 1999-11-02 2000-10-31 Molecular structure of rhd negative locus

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2003513620A true JP2003513620A (ja) 2003-04-15
JP2003513620A5 JP2003513620A5 (ja) 2007-12-06
JP4620920B2 JP4620920B2 (ja) 2011-01-26

Family

ID=26071006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001535401A Expired - Lifetime JP4620920B2 (ja) 1999-11-02 2000-10-31 Ｒｈｄ陰性遺伝子座の分子構造

Country Status (9)

Country Link
US (2) US9034573B1 (ja)
EP (2) EP1226169B1 (ja)
JP (1) JP4620920B2 (ja)
CN (1) CN100475842C (ja)
AT (2) ATE356828T1 (ja)
AU (2) AU784319B2 (ja)
DE (2) DE60044105D1 (ja)
ES (2) ES2283324T3 (ja)
WO (1) WO2001032702A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8173370B2 (en) * 2007-02-08 2012-05-08 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for RHD typing, gender determination and nucleic acid quantification

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001242507A1 (en) * 2000-04-20 2001-11-07 Adnagen Ag Method, diagnostic kit and microarray for determining the rhesus factor
US20080261205A1 (en) 2004-02-06 2008-10-23 Canadian Blood Services Method for the Simultaneous Determination of Blood Group and Platelet Antigen Genotypes
CN1570148B (zh) * 2004-03-25 2010-08-18 深圳市血液中心 个体rhd基因合子型测定的pcr引物及试剂盒及测定方法
MX2011000566A (es) * 2008-07-18 2011-03-15 Novartis Ag Genotipificacion no invasora de rhd fetal a partir de sangre completa materna.
US20110070590A1 (en) 2009-09-22 2011-03-24 Jan Rohozinski Primers and Methods for Determining RhD Zygosity
EP2721171A1 (en) * 2011-06-17 2014-04-23 Progenika Biopharma, S.A. Discrimination of blood type variants
US9359643B2 (en) 2013-03-08 2016-06-07 Progenika Biopharma S.A. Discrimination of blood type variants
CN103966228B (zh) * 2014-04-25 2015-12-09 无锡市第五人民医院 一种Rh血型DEL型RHD93T＞A等位基因及其检测方法
US11549137B2 (en) 2016-11-23 2023-01-10 Christoph Gassner Determination of the genotype underlying the S-s-U-phenotype of the MNSs blood group system
TWI709188B (zh) 2018-09-27 2020-11-01 財團法人工業技術研究院 基於機率融合的分類器、分類方法及分類系統

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
WO1995006137A1 (en) * 1993-08-27 1995-03-02 Australian Red Cross Society Detection of genes
US5654419A (en) * 1994-02-01 1997-08-05 The Regents Of The University Of California Fluorescent labels and their use in separations
EP0974058A2 (en) * 1997-04-08 2000-01-26 Human Genome Sciences, Inc. 20 human secreted proteins
US7005276B1 (en) * 1998-01-23 2006-02-28 DRK Blutspendedienst Baden-Württember GGmbH Nucleic acid molecules correlated with the Rhesus weak D phenotype
WO1999047555A1 (en) * 1998-03-20 1999-09-23 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US6821724B1 (en) * 1998-09-17 2004-11-23 Affymetrix, Inc. Methods of genetic analysis using nucleic acid arrays

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6010036984, Ｂｌｏｏｄ， ｖｏｌ． ９３， ｐａｇｅｓ ３８５−３９３ （１９９９） *
JPN6010036985, Ｂｌｏｏｄ， ｖｏｌ． ８９， ｐａｇｅｓ ２５６８−２５７７ （１９９７） *
JPN6010036986, Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．， ｖｏｌ． ６７， ｐａｇｅｓ ３９７−４０１ （１９９４） *
JPN6010036987, Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ｖｏｌ． ２６３， ｐａｇｅｓ ３７８−３８３ （１９９９） *
JPN6010036988, Ａｎｎ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ｖｏｌ． ５７， ｐａｇｅｓ ２７３−２７９ （１９９３） *
JPN6010036989, Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ｖｏｌ． ６， ｐａｇｅｓ ８４３−８５０ （１９９７） *
JPN6010036990, Ｂｌｏｏｄ， ｖｏｌ． ９５， ｐａｇｅｓ ３６６２−３６６８ （Ｊｕｎｅ ２０００） *
JPN7010002006, Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ． ８９， ｐａｇｅｓ １０９２５−１０９２９ （１９９２） *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8173370B2 (en) * 2007-02-08 2012-05-08 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for RHD typing, gender determination and nucleic acid quantification
US8551707B2 (en) 2007-02-08 2013-10-08 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for RhD typing, gender determination and nucleic acid quantification

Also Published As

Publication number Publication date
US9034573B1 (en) 2015-05-19
JP4620920B2 (ja) 2011-01-26
WO2001032702A3 (en) 2002-02-28
ATE462722T1 (de) 2010-04-15
DE60033954D1 (de) 2007-04-26
AU2006202359A1 (en) 2006-06-29
WO2001032702A2 (en) 2001-05-10
DE60033954T2 (de) 2008-04-17
CN100475842C (zh) 2009-04-08
ES2342837T3 (es) 2010-07-15
EP1226169A2 (en) 2002-07-31
US20110172406A1 (en) 2011-07-14
ATE356828T1 (de) 2007-04-15
CN1413219A (zh) 2003-04-23
AU1145501A (en) 2001-05-14
EP1780217A1 (en) 2007-05-02
WO2001032702B1 (en) 2002-03-28
DE60044105D1 (de) 2010-05-12
AU784319B2 (en) 2006-03-09
US9217181B2 (en) 2015-12-22
WO2001032702A9 (en) 2001-10-11
EP1226169B1 (en) 2007-03-14
EP1780217B1 (en) 2010-03-31
ES2283324T3 (es) 2007-11-01
AU2006202359B2 (en) 2008-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9217181B2 (en) Molecular structure of RHD negative
CA2458207A1 (en) Determination of a genetic predisposition for behavioural disorders
JP2008513036A (ja) マルチプレックスｐｃｒによるｒｈｄ及びａｂｏの遺伝子型決定
US7005276B1 (en) Nucleic acid molecules correlated with the Rhesus weak D phenotype
US7252949B2 (en) Nucleic acid molecules correlated with the rhesus weak D phenotype
US7553629B2 (en) Nucleic acid molecules correlated with the Rhesus weak D phenotype
JP2010187556A (ja) 妊孕性診断方法、妊孕性診断キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体
EP2904107B1 (en) Methods for vel blood group typing
EP2501825B1 (en) Methods for diagnosing skin diseases
EP1641937B1 (en) Mutations in the slc40a1 gene associated to impaired iron homeostasis
EP2110441A1 (en) Method and probes for the genetic diagnosis of hemochromatosis
MXPA00007182A (en) Novel nucleic acid molecules correlated with the rhesus weak d phenotype
AU2002250731A1 (en) Determination of a genetic predisposition for behavioural disorders

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20071016

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20071016

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100628

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100928

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20101019

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20101029

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131105

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 4620920

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term