ES2283324T3 - Estructura molecular del locus rhd negativo. - Google Patents

Abstract

. Estructura molecular de ácido nucleico que representa o bien la caja híbrida Rhesus, o bien la caja Rhesus corriente aguas arriba o bien la caja Rhesus corriente aguas abajo, cuya secuencia se muestra en SEQ ID Nos 18 a 20 respectivamente. .

Description

Estructura molecular del locus RHD negativo.

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La presente invención se refiere a una estructura molecular de ácido nucleico que representa o bien la caja Rhesus híbrida, o bien la caja Rhesus corriente aguas arriba o bien la caja Rhesus corriente aguas abajo. La invención se refiere además a la detección de moléculas de ácido nucleico que llevan una deleción del gen RhD. La invención también se refiere a oligonucleótidos, según se identifican en las reivindicaciones. Adicionalmente, la invención se refiere a kits que comprenden o emplean los compuestos de la invención mencionados anteriormente.

El antígeno Rhesus-D (ISBT 004.001; RH1) es el antígeno de grupo sanguíneo más importante determinado por una proteína. Anti-D sigue siendo la causa principal de enfermedad hemolítica en los recién nacidos (Filbey, Acta Obstet Gynecol Scand, 74:687, 1995; Bowman, J, Semin Perinatol 21:39, 1997). Dependiendo de la población, del 3% al 25% de las personas de raza blanca carecen del antígeno D (Mourant, The distribution of the human sangre groups and other polymorphisms, Londres, Oxford University Press, 1976). Pueden producirse inmunizaciones de anti-D rápidamente en receptores D-negativos (Urbaniak, Transfusion 21:64, 1981).

Los antígenos del grupo sanguíneo RH los portan proteínas codificadas por dos genes, RHD y RHCE, que se ubican en la posición cromosómica 1p34.1 - 1p36 (Cherif-Zahar, Hum. Genet. 86: 398, 1991; MacGeoch, Cytogenet. Cell Genet. 59:261, 1992) probablemente dentro de una distancia inferior a 450.000 pares de bases (pb) (Carritt, Hum. Mol. Genet. 6:843, 1997). Ambos genes engloban diez exones y sus estructuras son altamente homólogas. Se desconocen la orientación relativa de los genes, su distancia, y la posibilidad de otros genes intercalados (Flegel, Transfus. Med. 8:281, 1998). Muy recientemente, Okuda et al. (Okuda, Biochem. Biophys. Res. Commun. 263:378, 1999) notificaron una secuencia de aproximadamente 11.000 pb, que se pensó que representaba el fragmento de ADN entre RHD y RHCE.

En personas de raza blanca, la amplia mayoría de haplotipos D-negativos se debe a una deleción del gen RHD: Esta deleción abarca el gen RHD completo, porque están ausentes secuencias específicas de RHD que se extienden desde el exón 1 hasta la región no traducida en 3’ (Gassner, Transfusion 37:1020, 1997). La extensión exacta de la deleción era incierta, dejando abierta la posibilidad de que también se vieran afectados genes vecinos.

La identificación del gen RHD como la base molecular del antígeno D permitió la predicción del fenotipo de RhD mediante tipificación del ADN (Flegel, Transfus. Med. 8:281, 1998; Lo, Lancet 341:1147, 1993). Sin embargo, puesto que se desconoce la estructura del haplotipo D-negativo prevalente, siguió siendo imposible una detección específica de la deleción de RHD y la discriminación entre individuos homocigóticos RHD^{+}/RHD^{+} y heterocigóticos RHD^{+}/RHD^{-} se basó en métodos indirectos. Esta discriminación es de interés clínico en particular, porque en madres D-negativas con un anti-D, el riesgo de un niño afectado es del 100% con un padre RHD^{+}/RHD^{+}, pero sólo del 50% con un padre RHD^{+}/RHD^{-}.

Se han aplicado varios enfoques indirectos para determinar la cigosidad: (i) una simple conjetura basada en el fenotipo es correcta en aproximadamente el 95% de los casos, (ii) la determinación de la densidad de antígeno D que puede frustrarse por factores tales como la presencia de antígeno C, y (iii) varios métodos que implican la amplificación cuantitativa en paralelo de secuencias específicas de RHD y RHCE (Cossu, Electrophoresis 17:1911, 1996; Döscher, Infusionsther. Transfusionsmed. 26 (supl. 1):31, 1999 (abstr.)). Estas técnicas complicadas pueden no ser prácticas en los laboratorios de rutina. Además, varios investigadores identificaron polimorfismos en el gen RHCE o secuencias vecinas relacionados genéticamente con la carencia del gen RHD (Carritt, Hum. Mol. Genet. 6:843, 1997; Huang, Am. J. Hum. genet. 58: 133, 1996; Fujiwara, Hum. genet. 104:301, 1999; Onda, Gene 159:225, 1995). Este enfoque indirecto se basó en el desequilibrio de ligamiento que asocia la deleción de RHD con un polimorfismo.

Además, la utilidad de PCR de RHD está limitada por el conocimiento incompleto de alelos RHD-positivos presumiblemente raros en RhD-negativo. Los alelos RHD-positivos en RhD-negativo están producidos por genes híbridos RHD^{-}CE-D (Huang, Blood 88:2326-33, 1996; Faas, Transfusion 37:38-44, 1997, Faas, Transfusion 36:506-11, 1996), mutaciones sin sentido (Avent, Blood 89:2568-77, 1997), del marco de lectura (Andrews, Blood 92:1839-40, 1998; Cherif-Zahar Br. J. Haematol. 102:1263-70, 1998), o pseudogenes (Singleton, Blood 95:12-8, 2000). Tales alelos son frecuentes en las personas africanas (Faas, Transfusion 37:38-44, 1997, Singleton, Blood 95:12-18, 2000) y asiáticas (Okuda, J. Clin. Invest. 100:373-9, 1997) pero son raros en personas de raza blanca. No obstante, análisis recientes (Avent, Blood 89:2568-77, 1997; Flegel, Transfus. Med. 8:281-302, 1998) sugieren que incluso para las personas de raza blanca, estos alelos son probablemente la causa principal de predicción incorrecta del fenotipo de Rh. Varias observaciones en personas de raza blanca (Avent, Blood 89:2568-77, 1997; Hyland, Blood 84:321-4, 1994) indicaron que estos alelos se agruparon en los haplotipos Cde y cdE. Se han publicado partes de la presente invención en F.F. Wagner et al. SANGRE 95 (2000), 3662-3668.

El enfoque más directo para analizar el locus de RHD a nivel molecular sería la amplificación por PCR abarcando el sitio de deleción de RHD. Tal ensayo no ha estado disponible, hasta la fecha, debido a que la estructura del locus de RHD en individuos RhD-positivos y RhD-negativos se conocía de forma incompleta.

En consecuencia, el problema técnico subyacente a la invención era proporcionar medios y métodos para un análisis fiable, basado en ácidos nucleicos, del locus Rhesus-D. Estos medios y métodos deben ser, entre otros, adecuados para la detección y/o discriminación entre individuos RHD^{+}/RHD^{+} y RHD^{+}/RHD^{-}.

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La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por tanto, la invención se refiere a una estructura molecular de ácido nucleico que representa o bien la caja Rhesus híbrida, o bien la caja Rhesus corriente aguas arriba o la caja Rhesus corriente aguas abajo, cuyas secuencias se muestran en las figuras 7 a 9.

En el contexto de la presente invención, el término "estructura molecular de ácido nucleico" se define como un segmento de ADN lineal que comprende, en su significado más amplio, la combinación de las cajas Rhesus mencionadas anteriormente que determinan conjuntamente dicho locus del gen de Rhesus. Las secuencias de ADN que dan lugar a la estructura molecular de la invención incluyen las siguientes: la estructura de la secuencia de nucleótidos consiste en la caja Rhesus híbrida o cualquiera de las dos cajas Rhesus.

Las siguientes secuencias representan realizaciones contenidas en la estructura molecular de ácido nucleico de la invención.

La caja Rhesus híbrida está representada con el número de acceso de GenBank AL252313, bases 33 a 9.180.

Las dos cajas Rhesus con gen RHD intermedio consiste en la caja Rhesus corriente aguas arriba, con el número de acceso de GenBank AL252311, bases 34 a 9.175, el gen RHD y la caja Rhesus corriente aguas abajo representada con el número de acceso de GenBank AL252312, bases 23 a 9.177 (véanse las figuras 7 a 9).

Mientras que la caja Rhesus corriente aguas arriba se sitúa en 5’ del gen RHD, la caja Rhesus corriente aguas abajo se sitúa entre los genes RHD y SMP1 en esta estructura de la presente invención. El término "estructura molecular de ácido nucleico" se refiere a segmentos de ADN que comprenden solamente las cajas Rhesus a las que se ha hecho referencia.

Para una mejor compresión del contenido reivindicado, se hace referencia a las figuras 1 a 6, citadas anteriormente.

Según la presente invención, el término "estructura molecular de ácido nucleico" comprende también cualquier derivado factible de la estructura de ácido nucleico a la que se hizo referencia anteriormente, con la que puede hibridarse una sonda de ácido nucleico. En otras palabras, la estructura de la invención puede prepararse mediante medios sintéticos o semisintéticos y, por tanto, consistir en o comprender un ácido nucleico peptídico. Dicho término también porta el significado de una molécula de ácido nucleico.

Según la presente invención, el término "caja Rhesus" describe segmentos de ADN corriente aguas arriba y corriente aguas abajo que flanquean el gen RHD en el extremo 5’ y 3’. Las tres cajas Rhesus están definidas por sus secuencias de nucleótidos. La caja Rhesus híbrida está representada en una realización con el número de acceso de GenBank AL252313, bases 33 a 9.180. Las dos cajas Rhesus con el gen RHD intermedio consisten en la caja Rhesus corriente aguas arriba, representada en una realización con el número de acceso de GenBank AL252311, bases 34 a 9.175 y la caja Rhesus corriente aguas abajo representada en una realización con el número de acceso de GenBank AL252312, bases 23 a 9.177. Tal como se pone como ejemplo en los ejemplos adjuntos, las cajas Rhesus son preferiblemente de aproximadamente 9000 pb de longitud, teniendo una identidad del 98,6% y orientación idéntica. Según la presente invención, las cajas Rhesus corriente aguas arriba y corriente aguas abajo son homólogas en al menos el 95%. La longitud de estas cajas Rhesus puede variar. Se espera que la longitud de estas cajas Rhesus pueda variar, porque, entre otras características estructurales, se sabe que múltiples elementos de repetición, algunos de ellos que están organizados en alineamientos en tándem, son proclives a acontecimientos de elongación y deleción (en alineamiento). Si se producen tales acontecimientos, la longitud de las cajas Rhesus puede disminuir hasta menos de 1.000 nucleótidos de longitud o extenderse hasta más de 20.000 nucleótidos de longitud.

Según la presente invención el término "identidad" se refiere a la determinación de la identidad de secuencia usando programas de alineación adecuados, tales como BLAST.

Tal como se ha señalado anteriormente, el análisis diagnóstico de RHD-negativos a nivel molecular ha estado dificultado hasta la fecha por el hecho de que se desconocía la estructura global de los loci de RHD/RHCE. Ahora se ha descubierto sorprendentemente que los dos genes, RHD y RHCE, tienen una orientación opuesta y se enfrentan entre sí con sus extremos 3’. Según la presente invención, se ha descubierto además que el gen RHD está rodeado por dos cajas Rhesus altamente homólogas. La distancia física entre RHD y RHCE es de aproximadamente 30.000 pb y se llena con una caja Rhesus y el gen SMP1. Los puntos de ruptura de la deleción de RHD en los haplotipos RHD-negativos prevalentes se sitúan en la región de identidad de 1.463 pb de las cajas Rhesus. Acontecimientos de deleción de RHD similares pueden implicar a cualquier otra región dentro de las cajas Rhesus altamente homologas. Así, puede preverse que aparezca una región de punto de ruptura que comprende una deleción de RHD distinta de la deleción de RHD común en cualquier lugar dentro de las cajas Rhesus, según se definieron anteriormente.

La orientación opuesta de los dos genes RH explica el diferente carácter de los genes híbridos en el grupo sanguíneo RH y MNS: Los genes de glicoforina que codifican para los antígenos MNS se producen con la misma orientación (Onda, Gene 159:225, 1995), y muchas recombinaciones pueden explicarse como un sobrecruzamiento desigual que da como resultado genes híbridos individuales (Blumenfeld, Hum. Mutat 6:1999, 1995). Basándose en los hallazgos sorprendentes a los que se hizo referencia anteriormente, los acontecimientos a nivel molecular que conducen a RHD-negativos pueden entenderse más en detalle. En el locus RH, no es probable que las secuencias orientadas de manera inversa desencadenen un sobrecruzamiento desigual, y si este acontecimiento se produce, no resultaría un gen híbrido funcional. La conclusión de que un sobrecruzamiento desigual en el locus génico RH no es probable puede explicar que la mayor parte de los genes híbridos RH son del tipo RHD-CE-D o RHCE-D-CE y suponen tramos de ADN homólogo situados en cis tal como se indicó previamente (Wagner, Blood 91:2157, 1998). Actualmente, el sistema génico RH es el único locus génico investigado a conciencia en el que los dos genes tienen orientación opuesta, convirtiéndolo en un sistema modelo para determinar la evolución de genes vecinos, orientados de forma opuesta que son frecuentes en todos los genomas.

Basándose en la estructura del locus génico RH (figura 1), se propone un modelo escueto para el acontecimiento de deleción del gen RHD (figura 6). Aunque el solicitante no desea restringirse a la teoría, se cree lo siguiente con respecto a la generación de RhD-negativo. La deleción de RHD puede explicarse mediante un sobrecruzamiento desigual desencadenado por las cajas Rhesus altamente homólogas que abarcan el gen RHD. La caja Rhesus de tipo híbrido de individuos RHD-negativos surge, cuando tiene lugar un entrecruzamiento que conduce a un acontecimiento de deleción que implica a una región de punto de ruptura dentro de la región de identidad de las cajas Rhesus corriente aguas arriba y corriente aguas abajo. Por tanto, la caja RHD híbrida se caracteriza por una parte en 5’ derivada de la caja RHD corriente aguas arriba fusionada a una parte en 3’ derivada de la caja RHD corriente aguas abajo. En una realización preferida, la región de punto de ruptura es de 903 pb de longitud. La secuencia de esta caja Rhesus híbrida preferida se representa en la figura 4. En las realizaciones específicas descritas en los ejemplos, dicha región de punto de ruptura de 903 pb en las cajas Rhesus se sitúa en un tramo de 1.463 pb con una homología del 99,9% que se parece a un elemento transponible humano THE-1B y un elemento de repetición de ADN L2 (figura 3). De manera interesante, el segmento de ADN de > 60.000 pb que se deleciona en el haplotipo RHD-negativo consistía sólo en y contenía todas las secuencias que se duplican en el haplotipo RHD-positivo.

Los hallazgos de la presente invención a los que se hizo referencia anteriormente en el presente documento permiten el establecimiento de varios métodos fáciles de llevar a cabo o refinados para el análisis del genotipo de un individuo con respecto al locus génico RH. A continuación en el presente documento, se proporcionan ejemplos de tales métodos.

Aunque ahora es evidente el mecanismo molecular que da como resultado un haplotipo RHD-negativo, está menos claro cómo el acontecimiento mucho más antiguo de duplicación dio lugar a la estructura de los genes RH en RHD-positivos. La duplicación de la caja Rhesus y los genes RH genes se produjo probablemente en un único acontecimiento, debido a que la homología global de las dos cajas Rhesus es muy similar a la de los genes RH. Sin limitarse por la teoría, es tentador especular que la duplicación de RHD se origina en relación causal con la inserción del elemento humano de tipo transposón THE-1B de longitud completa por duplicado. Sin embargo, el marco de lectura abierto del elemento THE-1B probablemente no era funcional en el momento de la duplicación.

En una realización preferida de la presente invención, dicha estructura molecular de ácido nucleico es representativa de los haplotipos RHD-negativos comunes según se define en las reivindicaciones adjuntas.

Según la presente invención, el término "es representativa de" se refiere a una estructura molecular de ácido nucleico que comprende todas las características secuenciales y estructurales para relacionar dicha estructura con un grupo de estructuras moleculares que comparten dichas características. En la realización preferida anterior, dichas características dan lugar al haplotipo RHD-negativo común. En el presente contexto, esto significa preferiblemente la deleción del gen RHD que engloba el gen RHD completo y su región en 5’, que se sitúan entre la caja Rhesus corriente aguas arriba y la caja Rhesus corriente aguas abajo.

En el presente contexto, esto podría significar también, por ejemplo, que todas las estructuras que comparten una mutación sin sentido, mutación de cambio de sentido, mutación del sitio de corte y empalme, deleción parcial, inserción parcial, inversión parcial o una combinación de las mismas dentro del gen RHD, que termina o suprime la expresión de un producto proteico del gen RHD, son representativas del haplotipo RHD-negativo.

El término "haplotipo" se refiere a una serie de alelos ligados dentro de una región definida en un único cromosoma materno o paterno.

El término "haplotipo RHD-negativo común" se refiere a cualquier haplotipo negativo del antígeno RhD que comprende una caja Rhesus híbrida. Preferiblemente, se deleciona el segmento de ADN que engloba el RHD completo y su región en 5’, que se sitúan entre la caja Rhesus corriente aguas arriba y la caja Rhesus corriente aguas abajo.

La invención se refiere a una estructura molecular de ácido nucleico, denominada caja Rhesus, que está flanqueando la región de punto de ruptura de la deleción de RHD en los haplotipos RHD-negativos comunes.

Según la presente invención el término "región de punto de ruptura de la deleción de RHD" describe un segmento de ADN diferenciado que está implicado en una deleción de RHD. Tal como se ha señalado anteriormente, dicha deleción puede ser el resultado de un acontecimiento de sobrecruzamiento desigual que implica a ambas cajas Rhesus corriente aguas arriba y corriente aguas abajo, que deleciona secuencias intercaladas y que da lugar finalmente a una estructura molecular de ácido nucleico (las cajas Rhesus a las que se hace referencia para una mejor delimitación de la caja Rhesus corriente aguas arriba y corriente aguas abajo se denomina también caja Rhesus híbrida) en la que la parte en 5’ de la caja RHD corriente aguas arriba está en gran proximidad espacial con respecto a la parte en 3’ de la caja RHD corriente aguas abajo. Tal como se mencionó anteriormente y se representa en las figuras 6 y 3, esta región puede ser preferiblemente de 903 pb de longitud y situarse en un tramo de 1.463 pb dentro de las cajas Rhesus, teniendo una homología del 99,9% en este segmento. En otra realización alternativa, dicha región está situada corriente aguas abajo de dicho fragmento de 903 pb pero está contenida todavía en el tramo de 1463 pb. Preferiblemente, dicho fragmento es de 556 a 560 pb de longitud. El punto de ruptura real puede variar de tal manera que la contribución de la caja Rhesus corriente aguas arriba y la caja Rhesus corriente aguas abajo son diferentes en individuos diferentes. Sin embargo, según la presente invención, el punto de ruptura se produce en cualquier caso en las cajas Rhesus corriente aguas arriba y corriente aguas abajo.

La caja Rhesus híbrida es particularmente útil para el análisis de los haplotipos RHD-negativos. Por ejemplo, pueden emplearse oligonucleótidos que se hibridan con las secuencias de ácido nucleico que comprenden el punto de ruptura que surge como resultado de la deleción de RHD. Ha de entenderse que es necesario que tales oligonucleótidos se hibriden con una parte significativa que engloba preferiblemente 20 nucleótidos, que está situada en 5’ y 3’ de la región del punto de ruptura real con el fin de ser indicativo de un acontecimiento de deleción. Por ejemplo, cuando un oligonucleótido tal se hibrida en condiciones rigurosas tales como 0,2 x SSC, 0,1 SDS a 65°C y la sonda tendría 943 nucleótidos de longitud, entonces la región de hibridación debe incluir partes que se hibridan en 3’ así como en 5’ del punto de ruptura.

Por ejemplo, se amplifica una caja Rhesus o una parte de la misma que engloba la región del punto de ruptura. Posteriormente, se somete a ensayo el producto de amplificación de una manera específica de la secuencia mediante hibridación con un oligonucleótido de aproximadamente seis o más nucleótidos de longitud.

Preferiblemente, se amplifica un tramo de ADN representativo de una caja Rhesus o parte de la misma que engloba la región del punto de ruptura usando dos cebadores. Un cebador puede estar situado en la caja Rhesus en 5’ de la región de identidad y es específico tanto para la caja Rhesus corriente aguas arriba como para la caja Rhesus híbrida. El otro cebador puede estar situado en la caja Rhesus en 3’ de la región de identidad y es específico tanto para la caja Rhesus corriente aguas abajo como para la caja Rhesus híbrida. En esta solicitud, la presencia de un producto de amplificación del tamaño esperado es indicativa de la presencia de una caja Rhesus híbrida y, por tanto, de la deleción de RHD.

Otra posible combinación de cebadores es la siguiente: Un cebador puede estar situado en la caja Rhesus en 5’ de la región de identidad y es específico tanto para la caja Rhesus corriente aguas arriba y la caja Rhesus híbrida. El otro cebador puede estar situado en la caja Rhesus en 3’ de la región de identidad. En esta solicitud, se determina la presencia de una caja Rhesus híbrida examinando la especificidad de las partes del producto de amplificación perteneciente a un tramo de ADN de la caja Rhesus en 3’ de la región de identidad. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante hibridación con un oligonucleótido que se hibrida con la caja Rhesus híbrida y con la caja Rhesus corriente aguas abajo pero no con la caja Rhesus corriente aguas arriba, o mediante digestión con una enzima de restricción que corta la caja Rhesus híbrida y la caja Rhesus corriente aguas abajo pero no corta la caja Rhesus corriente aguas arriba,o mediante digestión con una enzima de restricción que no corta la caja Rhesus híbrida y la caja Rhesus corriente aguas abajo pero corta la caja Rhesus corriente aguas arriba, o mediante secuenciación de nucleótidos.

Otra posible combinación de cebadores es la siguiente: Un cebador puede estar situado en la caja Rhesus en 5’ de la región de identidad. El otro cebador puede estar situado en la caja Rhesus en 3’ de la región de identidad y es específico tanto para la caja Rhesus corriente aguas abajo como para la caja Rhesus híbrida. En esta solicitud, se determina la presencia de una caja Rhesus híbrida examinando la especificidad de las partes del producto de amplificación perteneciente a un tramo de ADN de la caja Rhesus en 5’ de la región de identidad. Esto puede realizarse, por ejemplo, by hibridación con un nucleótido que se hibrida con la caja Rhesus híbrida y con la caja Rhesus corriente aguas arriba pero no con la caja Rhesus corriente aguas abajo, o mediante digestión con una enzima de restricción que corta la caja Rhesus híbrida y la caja Rhesus corriente aguas arriba pero no corta la caja Rhesus corriente aguas abajo, o mediante digestión con una enzima de restricción que no corta la caja Rhesus híbrida y la caja Rhesus corriente aguas arriba pero corta la caja Rhesus corriente aguas abajo, o mediante secuenciación de nucleótidos.

La caja Rhesus híbrida también puede servir como una herramienta de diagnóstico para determinar la presencia de la deleción de RHD cuando se analiza mediante un anticuerpo anti-ADN específico para una o más realizaciones de la caja híbrida, un fragmento o derivado de la misma tal como un fragmento scFvFab o F(ab’)_{2} o un aptámero etc. Por tanto, pueden generarse anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos o pueden generarse tales aptámeros por el experto en la técnica según la tecnología convencional (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press 1988, Cold Spring Harbor).

En una realización preferida, la invención se refiere a una estructura molecular de ácido nucleico representativa de un haplotipo RHD-negativo que comprende una deleción del gen RHD que implica a la caja Rhesus corriente aguas arriba, la caja Rhesus corriente aguas abajo, o ambas.

Puede usarse una estructura molecular de ácido nucleico que está flanqueando la caja Rhesus en los haplotipos RHD-negativos comunes para derivar cebadores para reacciones de amplificación tales como PCR de largo alcance para el análisis molecular del locus RHD.

Por ejemplo, se amplifica un tramo de ADN representativo de una caja Rhesus y partes de sus regiones flanqueantes o parte de las mismas que engloban la región del punto de ruptura usando dos cebadores. Un cebador puede estar situado en la región flanqueante en 5’ de la caja Rhesus. Alternativamente, este cebador puede estar situado en la caja Rhesus en 5’ de la región de identidad y es específico tanto para la caja Rhesus corriente aguas arriba como para la caja Rhesus híbrida. El otro cebador puede estar situado en la región flanqueante en 3’ de la caja Rhesus. Alternativamente, este cebador puede estar situado en la caja Rhesus en 3’ de la región de identidad y es específico tanto para la caja Rhesus corriente aguas abajo como para la caja Rhesus híbrida. En esta solicitud, la presencia de un producto del tamaño esperado es indicativa de la presencia de una caja Rhesus híbrida y por tanto, de la deleción de RHD.

Otra posible combinación de cebadores es la siguiente: Un cebador puede estar situado en la región flanqueante en 5’ de la caja Rhesus. El otro cebador puede estar situado en la caja Rhesus en 3’ de la región de identidad. En esta solicitud, se determina la presencia de una caja Rhesus híbrida examinando la especificidad de las partes del producto de amplificación perteneciente a un tramo de ADN de la caja Rhesus en 3’ de la región de identidad. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante hibridación con un oligonucleótido que se hibrida con la caja Rhesus híbrida y con la caja Rhesus corriente aguas abajo pero no con la caja Rhesus corriente aguas arriba, o mediante digestión con una enzima de restricción que corta la caja Rhesus híbrida y la caja Rhesus corriente aguas abajo pero no corta la caja Rhesus corriente aguas arriba, o mediante digestión con una enzima de restricción que no corta la caja Rhesus híbrida y la caja Rhesus corriente aguas abajo pero corta la caja Rhesus corriente aguas arriba, o mediante secuenciación de nucleótidos.

Otra posible combinación de cebadores es la siguiente: Un cebador puede estar situado en la caja Rhesus en 5’ de la región de identidad. El otro cebador puede estar situado en la región flanqueante en 3’ de la caja Rhesus. En esta solicitud, se determina la presencia de una caja Rhesus híbrida examinando la especificidad de las partes del producto de amplificación perteneciente a un tramo de ADN de la caja Rhesus en 5’ de la región de identidad. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante hibridación con un oligonucleótido que se hibrida con la caja Rhesus híbrida y con la caja Rhesus corriente aguas arriba pero no con la caja Rhesus corriente aguas abajo, o mediante digestión con una enzima de restricción que corta la caja Rhesus híbrida y la caja Rhesus corriente aguas arriba pero no corta la caja Rhesus corriente aguas abajo, o mediante digestión con una enzima de restricción que no corta la caja Rhesus híbrida y la caja Rhesus corriente aguas arriba pero corta la caja Rhesus corriente aguas abajo, o mediante secuenciación de nucleótidos.

En una realización preferida la estructura molecular de ácido nucleico es representativa de haplotipos RHD-positivos según se define en las reivindicaciones adjuntas.

El término "haplotipo RHD-positivo" se refiere a cualquier haplotipo que comprende secuencias de ADN específicas para el gen RHD.

En una realización preferida la invención se refiere a una estructura molecular de ácido nucleico representativa del haplotipo RHD-positivo común, según se define en las reivindicaciones adjuntas.

En otra realización preferida, la estructura molecular de ácido nucleico se deriva de una muestra que comprende un haplotipo RHD-positivo que se clasifica serológicamente como RhD-negativo, según se define en las reivindicaciones adjuntas.

En el contexto de la invención, el término "se clasifica serológicamente como RhD-negativo" describe una muestra que se ha sometido a prueba para determinar la presencia del antígeno RhD usando, por ejemplo, ensayos serológicos rutinarios en los que el resultado de tales ensayos fue negativo.

En una realización particularmente preferida, la muestra que se clasifica como RhD-negativa se obtiene de una población de raza blanca.

Previamente se han caracterizado parcial o completamente varios alelos RHD-positivos adicionales que se producen en individuos RhD-negativos (tabla 9). Tres de estos diez alelos de RHD publicados representaban alelos híbridos de RHD-CE-D en los que el tramo específico de RHCE englobaba al menos los exones 4 a 7. para cada uno de estos tres alelos de RHD híbridos, se encontraron alelos cuyos patrones serían compatibles (tabla 9). De los siete patrones RhD-negativos observados en el presente estudio, seis eran compatibles con tal tipo de alelo de RHD híbrido. Siete de los diez alelos de RHD publicados representaban deleciones, mutaciones sin sentido o un pseudogén. Ninguno de estos alelos apareció en este estudio, lo que puede indicar que son raros en personas de raza blanca.

En una realización más preferida adicional, la estructura molecular de ácido nucleico de la invención o una molécula de ácido nucleico que se deriva del gen RHD se correlaciona con un fenotipo RHD-negativo.

La invención también se refiere a un procedimiento para detectar específicamente un haplotipo RHD-negativo en una muestra utilizando cualquier característica estructural o secuencia de nucleótidos o ambas de la estructura molecular de ácido nucleico descrita anteriormente o combinaciones de la misma con técnicas conocidas en la técnica, preferiblemente reacciones de amplificación, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), más preferiblemente mediante PCR-RFLP, PCR-SSP o PCR de largo alcance.

Los métodos de PCR-RFLP y PCR de largo alcance descritos utilizan o bien secuencias de caja Rhesus secuencias o bien secuencias flanqueantes de caja Rhesus. Utilizando los mismos tramos de ADN o combinaciones los mismos, pueden desarrollarse o aplicarse otros métodos, como PCR-SSO o biochips.

En una realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para detectar específicamente un haplotipo RHD-negativo que comprende las siguientes etapas:

(a) aislar el ADN de una muestra de sangre obtenida de un donante de sangre;

(b) hibridar al menos dos cebadores orientados de forma opuesta en condiciones rigurosas con el ADN de modo que se lleve a cabo una PCR;

(c) amplificar la secuencia diana;

(d) separar los productos de amplificación en un gel; y

(e) analizar los amplicones.

Dicha muestra puede ser o puede derivarse de sangre, suero, esputo, heces u otro fluido corporal. La muestra que va a analizarse puede tratarse de modo que se extraigan, entre otras cosas, ácidos nucleicos. El aislamiento de ADN a partir de muestras de sangre aglutinadas con citrato o preferiblemente EDTA puede llevarse a cabo mediante métodos modificados de precipitación con sales ("salting out"), siguiendo las técnicas convencionales descritas en Gassner, Transfusion 37: 1020, 1997. Los cebadores son preferiblemente oligonucleótidos que o bien se producen de manera natural o bien están en un digesto de restricción purificado o bien se producen sintéticamente. Los cebadores son preferiblemente monocatenarios para un máximo de eficacia en el método de la presente invención, y son preferiblemente oligodesoxirribonucleótidos. Generalmente, se concibe la purificación de dichos cebadores antes de su uso en los métodos de la presente invención, comprendiendo dicha purificación cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), siendo todas tecnologías conocidas por el experto en la técnica. Los métodos de amplificación tales como PCR o LCR se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo en Flegel, Transfusion Medicine 8 (1998), 281-302; Maaskant, Transfusion 38 (1998), 1015-1021 y Legler, Transfusion (1996), 426-31.

Según la presente invención, un método preferido para detectar la deleción de RHD consiste en realizar una PCR-RFLP usando el sistema de PCR de alta fidelidad y cebadores no específicos que se unen en 5’ del extremo de la región de identidad de la caja Rhesus, así como cebadores específicos para la caja Rhesus corriente aguas abajo y que se unen en 3’ del extremo de la región de identidad de la caja Rhesus. Las condiciones de PCR suponen preferiblemente hibridación a 65°C, extensión durante 10 min. a 68°C. Posteriormente, los amplicones de la PCR se digieren con PstI durante 3 h a 37°C y se resuelven los fragmentos usando gel de agarosa al 1%. Se describen además métodos preferidos adicionales en los ejemplos 8 y 9.

Otra realización de la invención se refiere a un procedimiento para detectar específicamente un haplotipo RHD-negativo común que comprende la detección de la caja Rhesus híbrida.

La detección de la caja Rhesus híbrida proporciona al médico un resultado inequívoco en cuanto a la naturaleza del correspondiente alelo de RHD. Si se detecta la caja Rhesus híbrida, entonces el gen RHD está delecionado. La detección de la caja Rhesus híbrida se realiza preferiblemente utilizando un oligonucleótido que se hibrida específicamente con una región que comprende el punto de ruptura. El oligonucleótido usado para la hibridación debe hibridarse directamente con el del punto de ruptura y, además, hibridarse con al menos 943 nucleótidos en 5’ y 3’ del punto de ruptura. La hibridación se produce preferiblemente en condiciones rigurosas tales como 0,2 X SSC, 0,1% de SDS a 65°C. El punto de ruptura real dentro de la caja Rhesus híbrida puede variar debido a la naturaleza exacta del supuesto acontecimiento de sobrecruzamiento. En consecuencia, también puede detectarse la caja Rhesus híbrida usando varios oligonucleótidos solapantes y no solapantes para la hibridación. También puede detectarse la caja Rhesus híbrida usando otros protocolos tales como análisis de restricción (preferiblemente en combinación con análisis de inmu-
notransferencia de tipo Southern) o tecnología de PCR, según se describió anteriormente en el presente documento.

Además, otra realización de la invención se refiere a un procedimiento para detectar específicamente un haplotipo RHD-negativo común que comprende evaluar la estructura molecular de ácido nucleico que comprende la caja Rhesus híbrida y las regiones flanqueantes de la misma.

Según la presente invención, la evaluación de la estructura molecular del ácido nucleico comprende etapas de análisis tales como electroforesis en gel usando o bien geles de agarosa o bien geles de poliacrilamida, tratamiento con enzimas de restricción, técnicas de inmunotransferencia, tales como inmunotransferencia de tipo Southern o de tipo Northern o técnicas relacionadas, tales como detección de la hibridación guiada por fluorescencia y otras técnicas conocidas en la técnica.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para detectar específicamente un haplotipo RHD-negativo en una muestra que comprende la etapa de detectar cualquiera de las regiones de punto de ruptura mencionadas en la presente invención.

En una realización preferida, la invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente en el que dicha detección o evaluación comprende la determinación de la longitud de una molécula de ácido nucleico que comprende la caja Rhesus híbrida o partes de la misma.

De nuevo, esta realización preferida del método de la invención utiliza técnicas de separación convencionales, tales como electroforesis en gel o cromatografía o técnicas convencionales de secuenciación de nucleótidos tal como conoce un experto en la técnica. Preferiblemente la presente invención utiliza un kit de secuenciación disponible comercialmente y una máquina de secuenciación automática de Applied Biosystems (ABI 373A o ABI 377), tal como se describe adicionalmente en el ejemplo 5, para este fin.

Otra realización preferida de la invención se refiere al procedimiento mencionado anteriormente en el que dicha detección o evaluación se realiza usando PCR-RFLP, PCR-SSP o PCR de largo alcance o una sonda que se hibrida específicamente con la caja Rhesus híbrida, preferiblemente con el punto de ruptura o la región de punto de ruptura representada en la figura 3 ó 4, o que se hibrida con la caja Rhesus en sentido de 5’ o en sentido de 3’, preferiblemente mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Southern, electroforesis en gel, análisis de biochip, determinación del peso molecular o fluorescencia.

Según la presente invención, el término "que se hibrida con" se refiere a condiciones rigurosas o no rigurosas. El establecimiento de las condiciones está dentro de los conocimientos del experto y han de determinarse según los protocolos descritos, por ejemplo, en Sambrook, loc. cit. o Hames y Higgins, "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRC Press, Oxford (1985). La detección de secuencias que se hibridan específicamente normalmente requerirá condiciones rigurosas de hibridación y lavado tales como 0,2 x SSC, 0,1% de SDS a 65°C. Las condiciones de hibridación no rigurosas para la detección de secuencias homólogas y no exactamente complementarias pueden establecerse en 6x SSC, 1% de SDS a 50°C o 65°C. Como se sabe bien, la longitud de la sonda y la composición del ácido nucleico que va a determinarse constituyen parámetros adicionales de las condiciones de hibridación.

Además, la invención se refiere a un vector que comprende la estructura molecular de ácido nucleico de la invención.

El vector puede usarse para la propagación y/o expresión o puede diseñarse para fines de direccionamiento o transferencia génica. Los métodos de producción de tales vectores se conocen bien en la técnica. Los mismo sigue siendo cierto para la clonación de los ácidos nucleicos de la mutación en dichos vectores, así como la propagación de vectores en huéspedes adecuados, etc.

El vector puede ser particularmente un plásmido, un cósmido, un virus o un bacteriófago usado convencionalmente en ingeniería genética que comprenden la molécula de ácido nucleico de la invención. Pueden usarse vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes, o virus del papiloma bovino, para la administración de las moléculas de ácido nucleico o vector de la invención en poblaciones de células diana. Pueden usarse métodos que se conocen bien por los expertos en la técnica para construir vectores virales recombinantes; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternativamente, pueden reconstituirse los polinucleótidos y vectores de la invención en liposomas para la administración a las células diana. Los vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden transferirse a la célula huésped mediante métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, se utiliza comúnmente la transfección con cloruro de calcio para células procariotas, mientras que puede usarse comúnmente el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación para otros huéspedes celulares; véase Sambrook, citado anteriormente.

Tales vectores pueden comprender además genes tales como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula huésped adecuada y en condiciones adecuadas. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico de la invención está unida operativamente a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células procariotas o eucariotas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido en un ARNm que puede traducirse. Los expertos en la técnica conocen bien los elementos reguladores que garantizan la expresión en células eucariotas, preferiblemente células de mamífero. Normalmente, comprenden secuencias reguladoras que garantizan la iniciación de la transcripción y opcionalmente señales de poli-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales, y/o regiones promotoras asociadas de manera natural o heterólogas. Posibles elementos reguladores que permiten la expresión células huésped procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor PL, lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos para elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levaduras o el promotor de CMV, SV40, VSR (virus del sarcoma de Rous), potenciador de CMV, potenciador de SV40 o un intrón de globina en células de mamífero y otras células animales. Junto a los elementos que son responsables de la iniciación de la transcripción, tales elementos reguladores pueden comprender también señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio poli-A de SV40 o el sitio poli-A de tk, corriente aguas abajo de la molécula de ácido nucleico. Además, dependiendo del sistema de expresión usado, pueden añadirse secuencias líder que pueden dirigir el polipéptido hasta un compartimento celular o secretarlo en el medio, a la secuencia codificante del polinucleótido de la invención y se conocen bien en la técnica. La(s) secuencia(s) líder se ensambla(n) en la fase apropiada con las secuencias de traducción, iniciación y terminación, y preferiblemente, una secuencia líder que puede dirigir la secreción de la proteína traducida, o una parte de la misma, hacia el espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación C o N-terminal que confiere las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados tales como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), o pSPORT1 (GIBCO BRL).

Preferiblemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas promotores eucariotas en vectores que pueden transformar o transfectar células huésped eucariotas, pero también pueden usarse secuencias de control para huéspedes procariotas.

Tal como se mencionó anteriormente, el vector de la presente invención también puede ser un vector de direccionamiento o de transferencia génica. La terapia génica, que se basa en introducir genes terapéuticos en células mediante técnicas ex vivo o in vivo, es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia génica. Se describen vectores y métodos adecuados para la terapia génica in vitro o in vivo en la bibliografía y se conocen por el experto en la técnica; véanse, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; documento WO94/29469; documento WO 97/00957 o Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640, y las referencias citadas en ellos. Los polinucleótidos y vectores de la invención pueden diseñarse para la introducción directa o para la introducción a través de liposomas, o de vectores virales (por ejemplo adenovirales, retrovirales) en la célula.

Adicionalmente, la invención se refiere a un huésped no humano transformado con el vector de la invención.

Los huéspedes adecuados comprenden animales transgénicos, células tales como células bacterianas, de levaduras, células animales, preferiblemente de mamífero, células fúngicas o células de insectos. Los protocolos de transformación que incluyen transfección, microinyección, electroporación, etc., también se conocen bien en la técnica.

Además, la invención se refiere a un oligonucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con una parte de la estructura molecular de ácido nucleico o las moléculas de ácido nucleico de la invención, en el que dicha parte se hibrida con un punto de ruptura de la conversión génica, según se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas.

En esta realización de la invención, se entiende que los oligonucleótidos se hibridan directamente con el punto de ruptura. El establecimiento de condiciones de hibridación rigurosas se describe bien, por ejemplo, en Sambrook et al, "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook" CSH Press, Cold Spring Harbor 1989 o Hames y Higgins, "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press, Oxford (1985). Por tanto, la detección de las secuencias que se hibridan específicamente requerirá normalmente condiciones de hibridación y lavado tales como 0,2 x SSC, 0,1% de SDS a 65°. Como se sabe bien, la longitud de la sonda y la composición del ácido nucleico que va a determinarse constituyen parámetros adicionales de las condiciones de hibridación rigurosas. Preferiblemente, el oligonucleótido es un desoxinucleótido. Se prefiere además que el oligonucleótido comprenda de 12 a 50 nucleótidos y más preferiblemente de 15 a 24 nucleótidos. La hibridación con el punto de ruptura puede ser en condiciones rigurosas o no rigurosas. Un ejemplo de condiciones de hibridación no rigurosas es la hibridación y lavado a 50°C en 4 x SSC, 0,1% de SDS.

Además, la invención se refiere a un método para probar la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica para un antígeno Rhesus-D mutante o de una molécula de ácido nucleico que porta una deleción del gen RHD según se caracteriza mediante la estructura molecular de ácido nucleico o la molécula de ácido nucleico de la invención en una muestra que comprende hibridar el oligonucleótido de la invención en condiciones rigurosas con moléculas de ácido nucleico comprendidas en la muestra obtenida de un ser humano y detectar dicha hibridación.

Preferiblemente, el método de la invención comprende además digerir el producto de dicha hibridación con una endonucleasa de restricción o someter el producto de dicha hibridación a digestión con una endonucleasa de restricción y analizar el producto de dicha digestión.

Esta realización preferida de la invención permite mediante medios convenientes, la diferenciación entre una hibridación eficaz y una hibridación no eficaz. Por ejemplo, si el gen RHD de tipo natural comprende un sitio de restricción de endonucleasa, el producto hibridado podrá escindirse mediante una enzima de restricción apropiada mientras que una secuencia mutada no producirá el producto bicatenario o no comprenderá el sitio de restricción reconocible y, en consecuencia, no se escindirá. El análisis del producto de la digestión puede realizarse por medios convencionales, tales como mediante electroforesis en gel, que puede combinarse opcionalmente mediante la tinción del ácido nucleico con, por ejemplo, bromuro de etidio. También se conciben combinaciones con técnicas adicionales tales como inmunotransferencia de tipo Southern.

La detección de dicha hibridación puede realizarse, por ejemplo, mediante un anticuerpo anti-ADN de doble cadena o empleando un oligonucleótido marcado. De manera conveniente, el método de la invención se emplea junto con técnicas de inmunotransferencia tales como inmunotransferencia de tipo Southern o de tipo Northern y técnicas relacionadas. Puede realizarse el marcado, por ejemplo, mediante protocolos convencionales e incluye el marcado con marcadores radiactivos, etiquetas fluorescentes, fosforescentes, quimioluminiscentes, enzimáticas, etc.

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La invención se refiere adicionalmente a un método para probar la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica para un antígeno Rhesus-D mutante o de una molécula de ácido nucleico que porta una deleción del gen RHD según se caracteriza mediante la estructura molecular de ácido nucleico o la molécula de ácido nucleico de la invención en una muestra que comprende determinar la secuencia de ácido nucleico de al menos una parte de la estructura
molecular de ácido nucleico de la invención, codificando dicha parte para un punto de ruptura de dicho gen híbrido.

Preferiblemente, el método de la invención comprende además, antes de determinar dicha secuencia de ácido nucleico, la amplificación de al menos dicha parte de dicha estructura molecular de ácido nucleico.

Además, la invención se refiere a un método para probar la presencia de una molécula de ácido nucleico que porta una deleción del gen RHD según se caracteriza mediante la estructura molecular de ácido nucleico de la invención en una muestra que comprende llevar a cabo una reacción de amplificación usando un conjunto de cebadores que amplifica al menos una parte de dicha secuencia en el que al menos uno de los cebadores empleados en dicha reacción de amplificación es el oligonucleótido según se define en las reivindicaciones adjuntas.

Preferiblemente, la amplificación se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). También pueden emplearse otros métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la ligasa.

En una realización preferida del método de la invención dicha PCR es PCR-RFLP, PCR-SSP o PCR de largo alcance.

Adicionalmente, en otra realización preferida de la invención, se analiza el peso molecular del producto de amplificación. Dicho análisis del peso molecular utiliza técnicas convencionales, tales como electroforesis en gel de agarosa, SDS-PAGE, espectrometría de masas tal como MALDI-TOF para este fin, que se conocen bien por el experto en la técnica.

En una realización del método de la invención, se proporciona un método que detecta alelos RHD-positivos que comprende las siguientes etapas:

(a) aislar ADN de una muestra de sangre o de una muestra obtenida de un donante de sangre;

(b) hibridar al menos dos cebadores orientados de forma opuesta en condiciones rigurosas con el ADN de modo que se lleve a cabo una PCR;

(c) amplificar la secuencia diana;

(d) separar los productos de amplificación en un gel; y

(e) analizar los amplicones.

Con respecto a las condiciones específicas que van a aplicarse en las diversas etapas, se hace referencia a la correspondiente descripción anteriormente en el presente documento.

En una realización preferida, los alelos RHD-positivos se derivan de una población RhD-negativa serológicamente. En otra realización preferida, la muestra RhD-negativa se selecciona de una población de raza blanca.

Preferiblemente, en el método de la invención dicha amplificación o reacción de amplificación es o se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). También pueden emplearse otros métodos de amplificación tales como la reacción en cadena de la ligasa.

Preferiblemente, en el método de la invención dicha muestra es sangre, suero, plasma, tejido fetal, saliva, orina, tejido mucoso, moco, tejido vaginal, tejido fetal obtenido de la vagina, piel, pelo, folículo piloso u otro tejido humano.

Además, el método de la invención comprende preferiblemente la etapa de enriquecimiento de células fetales. Este enriquecimiento puede conseguirse usando anticuerpos, lectinas u otros reactivos apropiados que se unen específicamente a células fetales o mediante cualquier técnica que intente la separación diferencial de células maternas y fetales, como mediante gradientes de densidad. También preferiblemente, en dicho método puede extraerse ADN o ARNm fetal a partir de tejido materno como sangre periférica, suero o plasma, ventajosamente según procedimientos convencionales.

En una realización preferida adicional del método de la invención, dicha molécula de ácido nucleico o material proteico procedente de dicha muestra se fija a un soporte sólido.

Preferiblemente, dicho soporte sólido es un chip.

Las ventajas de los chips se conocen bien en la técnica y no es necesario tratarlas en el presente documento en detalle. Éstas incluyen el pequeño tamaño así como un fácil acceso de análisis de analitos basados en ordenador.

Además, la presente invención se refiere al uso de la estructura molecular de ácido nucleico de la invención para el análisis de un fenotipo de Rhesus-D negativo o positivo.

El análisis puede realizarse, por ejemplo, basándose en los métodos descritos anteriormente en el presente documento.

La invención también se refiere a un método para determinar si un paciente que necesita una transfusión de sangre va a transfundirse con sangre RhD-negativa de un donante que comprende la etapa de probar en una muestra de dicho paciente la presencia de una o más estructuras moleculares de ácido nucleico de la invención, en el que una prueba positiva para dos diferentes de dichas estructuras moleculares de ácido nucleico o moléculas de ácido nucleico es indicativa de la necesidad de una transfusión con sangre Rh-negativa. Alternativamente, una prueba positiva que indica la presencia concomitante de dos copias idénticas de una de dichas estructuras moleculares de ácido nucleico o moléculas de ácido nucleico es indicativa de la necesidad de una transfusión con sangre Rh-negativa.

Alternativamente, una prueba negativa para la presencia de la estructura molecular de ácido nucleico representativa del haplotipo RHD-negativo común con o sin una prueba negativa para una o más estructuras moleculares de ácido nucleico representativas de otras estructuras moleculares de ácido nucleico RHD-negativas de esta invención permite la transfusión de sangre que se tipifica como RhD-positiva. La invención tiene importantes implicaciones para diseñar una terapia de transfusión en seres humanos. Por ejemplo, ahora puede someterse a prueba de manera conveniente si el paciente necesita realmente una transfusión con sangre RhD-negativa o si no han de tomarse tales precauciones.

Además, la invención se refiere a un método para determinar si puede usarse la sangre de un donante para la transfusión a un paciente que la necesita que comprende la etapa de probar en una muestra de dicho donante la presencia de una o más de dichas estructuras moleculares de ácido nucleico de la invención, en el que una prueba negativa para las estructuras moleculares de ácido nucleico representativas del haplotipo RHD-negativo común con o sin una prueba negativa para una o más estructuras moleculares de ácido nucleico o moléculas de ácido nucleico representativas de los otros haplotipos RHD-negativos de esta invención excluye la transfusión de la sangre del donante a un paciente que se tipifica como RhD-negativo.

Las muestras a las que se hace referencia en los métodos citados anteriormente pueden ser muestras a las que se hace referencia en toda la memoria descriptiva, tales como sangre, suero, etc.

En cuanto a las directrices para transfundir a un paciente basándose en cualquiera de los métodos citados anteriormente, debe tenerse sumo cuidado de que se evite una política de transfusión inferior a la óptima. Este factor de riesgo ha de considerarse siempre por el médico al cargo. En todos los casos, ha de minimizarse el riesgo posible para el paciente.

La invención también se refiere a un método para la evaluación del riesgo de una madre RhD-negativa de concebir o gestar un feto RhD-positivo o del riesgo de una madre que tiene un título de anti-D de concebir o gestar un feto en riesgo de desarrollar una enfermedad hemolítica del recién nacido que comprende evaluar una muestra obtenida del padre del feto para determinar la presencia de una o más de dichas estructuras moleculares de ácido nucleico o moléculas de ácido nucleico de la invención, en el que una prueba negativa para las estructuras moleculares de ácido nucleico o moléculas de ácido nucleico representativas del haplotipo RHD-negativo común con o sin una prueba negativa para una o más estructuras moleculares de ácido nucleico o moléculas de ácido nucleico representativas de los otros haplotipos RHD-negativos de esta invención es indicativa de un alto riesgo de concebir un feto RhD-positivo.

En una realización preferida del método de la presente invención dicha estructura molecular de ácido nucleico porta mutaciones o deleciones.

Además, la invención se refiere a un método para evaluar la posibilidad o probabilidad de que un hombre sea el padre de un niño sometiendo a prueba una muestra obtenida de dicho hombre para determinar la presencia de una o más de dichas estructuras moleculares de ácido nucleico de la invención, en el que se usan los resultados de la prueba para determinar la homocigosidad para, la heterocigosidad para o la ausencia de cualquier estructura molecular de ácido nucleico representativa del haplotipo RHD-negativo de la presente invención usado para inferir la posibilidad o probabilidad de que dicho hombre sea el padre del niño.

Por tanto y en resumen, la presente invención proporciona medios y métodos para la detección de haplotipos de RHD, que comprenden haplotipos RHD-negativos comunes, según se describió anteriormente, así como alelos RHD-positivos presumiblemente raros en poblaciones serológicamente RhD-negativas. Estos últimos alelos, que albergan secuencias de RHD y por tanto se determinan como RHD-positivos, pueden comprender o bien genes híbridos RHD/RHCE, codones de terminación, mutaciones de sitios de corte y empalme o deleciones de un gen, que terminan o reducen la expresión del antígeno RhD. Llevando a cabo los métodos de detección mejorados de la invención, se encontró sorprendentemente, que varias muestras determinadas como RhD-negativas en serología rutinaria, podía identificarse que tenían alelos RHD-positivos. Además, algunas de esas muestras eran incluso positivas al antígeno RhD cuando se realizó un ensayo de detección basado en adsorción y elución, lo que indica que la base molecular para los alelos RHD-positivos en RhD-negativos es más heterogénea de lo previsto. Ventajosamente, el contenido de la descripción de la presente invención proporciona ahora técnicas de amplificación de ácidos nucleicos nuevas y viables para determinar si secuencias específicas de RHD producen fenotipos RhD-positivos o RhD-negativos.

Según la presente invención el término "polimorfismo" se refiere a la existencia en una población de más de una estructura genética o un gen de un haplotipo o de un segmento de ADN. No obstante, a veces tal polimorfismo genético no da siempre como resultado un fenotipo diferente, sino que sólo puede detectarse a nivel genético.

Además, la invención se refiere a un kit que comprende

(a) el oligonucleótido de la invención; y/o

(b) un par de cebadores útiles para llevar a cabo la reacción de amplificación de la invención.

Pueden envasarse partes del kit individualmente en viales o en combinación en recipientes o unidades de múltiples recipientes. El kit de la presente invención puede usarse ventajosamente para llevar a cabo el método de la invención y podría emplearse, entre otras cosas, en una variedad de aplicaciones a las que se hizo referencia anteriormente. La fabricación de los kits sigue preferiblemente procedimientos convencionales que se conocen por los expertos en la técnica.

Finalmente, la invención se refiere al uso de un oligonucleótido para hibridarlo en condiciones rigurosas con una parte de la estructura molecular de ácido nucleico de la invención en el que dicha parte se hibrida con una región que implica el punto de ruptura de dicho gen híbrido o con la parte complementaria de la misma, en la que dicha región que implica el punto de ruptura se caracteriza porque la parte en 5’ de la caja Rhesus corriente aguas arriba está en gran proximidad espacial con respecto a la parte en 3’ de la caja Rhesus corriente aguas abajo.

Las figuras muestran

Figura 1 Estructura esquemática del locus génico RH. Las posiciones y orientaciones de los genes y las cajas Rhesus se indican mediante flechas abiertas y triángulos, respectivamente (panel A). Los exones se muestran como barras verticales y se indica su número de exón. Los dos genes RH tienen orientación opuesta, se enfrentan entre sí con sus extremos 3’, y están separados por aproximadamente 30.000 pb. Un tercer gen, SMP1, tiene la misma orientación que RHD y está situado entre RHD y RHCE. El gen RHD está flanqueado en ambos lados por las dos cajas Rhesus altamente homólogas (b). Todos los exones tienen menos de 200 pb con la excepción de los exones terminales en 3’ de RHD y SMP1. Los datos usados para establecer esta estructura (panel B) incluyen la extensión de secuencias genómicas representadas en los ADNc (flechas horizontales), identidades y homologías con respecto a los clones genómicos (barra a: identidad con dJ465N24; b: homología de RHD con respecto a dJ469D22; c: homología de la parte en 3’ de RHD con respecto a dJ465N24; d: identidad con dJ469D22). Se indican las posiciones de tres reacciones de PCR puente. Se indica la posición correcta de un tramo de nucleótidos notificado previamente por Okuda et al. (Okuda, Biochem. Biophys. Res. Commun. 263:378, 1999) como secuencia "espaciadora" entre RHD y RHCE mediante la barra marcada como s.

Figura 2 Organización cromosómica de las regiones de ADN situadas en 5’ con respecto a los genes RHD y RHCE. Se representa la estructura propuesta de las regiones flanqueantes en 5’ de RHCE y RHD (panel A). Un total de 4.941 pb inmediatamente en 5’ de los codones de iniciación ATG son homólogos entre los genes RHCE y RHD (barras sombreadas en sentido vertical). No está presente homología más allá de esta región de homología (barras sombreadas en sentido diagonal). Se utilizaron dos clones genómicos, dJ469D22 y dJ465N24, para el diseño de cebadores. DJ469D22 comprende la longitud completa de la región de RHCE representada, mientras que dJ465N24 se extiende sólo 466 pb en la región de homología. Se indican las posiciones de varios cebadores de PCR (a, rey14a; b, rend32; c, rey15a; d, re014; e, re011d). Esta estructura propuesta está apoyada por varias reacciones de PCR (panel B). Se realizó el cebado directo con cebador a (específico de RHCE, carriles 1 - 3), cebador b (específico de RHD, carriles 4 - 6), y cebador c (región dehomología de RHCE y RHD, carriles 7 - 9). Los amplicones carecían de cebador a con cebador inverso específico de RHD e (carril 2) y de cebador b con ADN de RHD-negativo (carril 6). Las otras siete reac-
ciones de PCR produjeron amplicones de los tamaños previstos según la estructura genómica mostrada en el panel A.

Figura 3 Organización cromosómica de las cajas Rhesus. La extensión física de la caja Rhesus corriente aguas arriba (en 5’ con respecto a RHD) es de 9.145 pb (barra negra). Aproximadamente el 63% de la secuencia de nucleótidos de las cajas consiste en ADN repetitivo; se indican los tipos de las familias de repetición. La homología global entre la caja Rhesus corriente aguas arriba y corriente aguas abajo es del 98,6%, pero dentro de una región de identidad de 1.463 pb (flechas horizontales), sólo hay una inserción individual de 4 pb (doble línea vertical). Se sitúa una isla CpG (flecha de doble punta) en el extremo 3’ y está en la caja Rhesus corriente aguas abajo (en 3’ con respecto RHD) adyacente al promotor de SMP1.

Figura 4 Deleción del gen RHD en los haplotipos Rh-negativos. Se muestran tres segmentos de 3.100 pb de las cajas Rhesus. La línea superior indica la secuencia de nucleótidos de la caja Rhesus corriente aguas arriba en D-positivos, la línea inferior la secuencia de nucleótidos de la caja Rhesus corriente aguas abajo en D-positivos. La línea intermedia proporciona la secuencia de nucleótidos de la única caja Rhesus portada por Rh-negativos. Los asteriscos indican nucleótidos idénticos. La deleción de RHD se produjo en un segmento de 903 pb de identidad absoluta que era parte de una región de identidad de 1.463 pb. Se muestran las posiciones de los cebadores rez7 y mb31 (m indica apareamiento erróneo). Se indican los sitios de restricción de PstI mediante signos de intercalación (^). Las tres cajas Rhesus se depositan en EMBL con los números de registro AJ252311 (caja Rhesus corriente aguas arriba), AJ252312 (caja Rhesus corriente aguas abajo), y AJ252313 (caja Rhesus híbrida).

Figura 5 Dos procedimientos técnicos para la detección específica de la deleción de RHD en haplotipos RHD-negativos comunes. Se muestran una amplificación por PCR de largo alcance con cebadores situados en secuencias distintas a la caja Rhesus (panel A) y PCR-RFLP con cebadores situados en las cajas Rhesus (Panel B). Se indican los genotipos deducidos. Los cebadores de la PCR de largo alcance estaban situados en 5’ de la caja Rhesus corriente aguas arriba (cebador rez4) y en el exón 1 de SMP1 (cebador sr9). Se detectaron específicamente los haplotipos RHD-negativos (panel A, carriles 1 - 6). El ADN homocigótico para el gen RHD era negativo, porque la PCR no puede amplificar el tramo de ADN de 70.000 pb del gen RHD. Para el método de PCR-RFLP, se digirieron los amplicones de la PCR (cebador rez7 y mb31) con PstI. En D-negativos, hay tres sitios de PstI en el amplicón (véase la figura 4) dando como resultado fragmentos de 1.888 pb, 564 pb, 397 pb, y 179 pb (carriles 1 a 3). La caja Rhesus corriente aguas abajo de D-positivos carece de un sitio de PstI dando como resultado fragmentos de 1.888 pb, 744 pb, y 397 pb (carriles 7 a 9). Los heterocigóticos RHD^{+}/RHD^{-} muestran ambos fragmentos de 744 y 564 pb (carriles 4 a 6). El fragmento de 564 pb parece más débil porque PstI no corta los heterodímeros. El cebador mb31 no amplifica la caja Rhesus corriente aguas arriba de D-positivos.

Figura 6 Modelo del mecanismo propuesto que produce los haplotipos RHD-negativos prevalentes en personas de raza blanca. Se representa la estructura física del locus de los genes RHD y RHCE (panel A). Puede desencadenarse un sobrecruzamiento desigual entre las cajas Rhesus corriente aguas arriba y corriente aguas abajo por su alta homología (panel B). Se encontró que la región del punto de ruptura en las cajas Rhesus tenía una homología del 100% para 903 pb (véase la figura 4). La resolución de la estructura del cromosoma sometido a sobrecruzamiento proporcionó la estructura del haplotipo RHD-negativo existente (panel C).

Figura 7 secuencia de ADN de la caja Rhesus híbrida de RHD-negativos.

Figura 8 secuencia de ADN de la caja Rhesus corriente aguas arriba de D-positivos.

Figura 9 secuencia de ADN de la caja Rhesus corriente aguas abajo de D-positivos.

Los ejemplos ilustran la invención:

Ejemplo 1 Muestras de sangre y aislamiento de ADN

Se recogieron muestras de sangre anticoaguladas con EDTA o citrato de donantes de sangre de raza blanca y se caracterizaron como D-negativas en la tipificación rutinaria que incluye una prueba de antiglobulina con anti-D (Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärztekammer; Paul-Ehrlich-Institut. Richtlinien zur Blutgruppenbestimmung und Bluttransfusion (Hämotherapie). Köln: Deutscher Ärzte-Verlag; 1996; Wagner, Infusionsther Transfusionsmed 22:285-90, 1995). Si fue necesario, se recogieron muestras al azar para fenotipos CcEe específicos. Se sometieron a prueba un total de 314 muestras ccddee, 433 Ccddee, 271 ccddEe, 19 CcddEe, 24 CCddee, 1CcddEE y 6 ccddEE. Se aisló el ADN mediante un procedimiento de precipitación con sales modificado según se describe en Gassner et al., Transfusion 37; 1020, 1997.

Ejemplo 2 Tratamiento final molecular

Se sometieron a prueba todas las muestras mediante PCR-SSP para determinar la presencia de cuatro polimorfismos específicos de RHD situados en el promotor de RHD, intrón 4, exón 7 y la región no traducida en 3’ del exón 10. Se detectaron 48 muestras con al menos una reacción de PCR positiva (tabla 5). Se investigaron adicionalmente esas muestras para determinar la presencia de polimorfismos específicos de RHD en el exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, intrón 7 y exón 9. Veintiséis muestras mostraron uno de ocho patrones de PCR diferenciados que suponen una mezcla de reacciones positivas y negativas (tabla 6). Veintidós muestras fueron positivas para todos los polimorfismos específicos de RHD investigados y se les asignaron ocho alelos de RHD mediante la secuenciación específica de RHD de los diez exones de RHD del ADN genómico (tabla 7). Para cada patrón de PCR y cada alelo de RHD, se investigó serológicamente una muestra. Se determinaron los fenotipos que representan D débil, D parcial, y D_{el}, o se confirmó serológicamente como D-negativo mediante adsorción/elución (tablas 6 y 7).

Ejemplo 3 Análisis y búsquedas en la base de datos de ADN

Se hicieron búsquedas en la base de datos GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) y del cromosoma 1 del Centro Sanger (http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/nph-BlastServer.html) con secuencias de ADNc representativas de RHD (RhXIII, número de registro X63097) y RHCE (RhVI, X63095) usando el programa BLAST. Se identificaron el clon genómico de 84.810 pb dJ469D22 (número de registro de GenBank AL031284), el clon genómico de 129.747 pb dJ465N24 (número de registro de GenBank AL031432) y el clon genómico de 2.234 pb de ADNc de SMP1 (número de registro de GenBank AF081282). dJ469D22 representaba un fragmento principal del gen RHCE, iniciándose a 33.340 pb en 5’ del codón de iniciación de RHCE y terminando a 1.142 pb en 3’ de exón 9. En dJ465N24, un tramo interno de 1.418 pb situado entre la posición 120.158 y 121.568 era homólogo en un 96% al extremo 3’ del ADNc de RHD. El extremo 3’ del ADNc de SMP1 era complementario al extremo 3’ del ADNc de RHCE con un solapamiento de 58 pb.

Ejemplo 4 PCR

Si no se menciona lo contrario, las reacciones de PCR se realizaron con hibridación a 60°C, extensión de 10 min. a 68°C y desnaturalización a 92°C usando los sistemas de PCR de alta fidelidad de expansión o de cebadores largos de gran expansión (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) y los cebadores enumerados (tabla 1). Se usaron tres reacciones de PCR para rellenar los huecos en las regiones flanqueantes en 3’ de los genes RH. Se realizó la PCR 1 usando los cebadores rea7 y rend31 (PCR 2, rend32, sf1c; PCR 3, rea7, sf3). Se confirmó la estructura de las regiones flanqueantes en 5’ con amplificaciones por PCR que implican rend32, rey14a, rey15a y cebadores antisentido re011d y re014. Se estimó que el tamaño del intrón 9 era de aproximadamente 9.000 pb basándose en amplificaciones por PCR usando rb10b y rr4 para RHD (re96 y rh7 para RHCE).

Ejemplo 5 Secuenciación de nucleótidos

Se realizó la secuenciación de nucleótidos con una unidad de secuenciación de ADN (kit de reacción rápida de secuenciación del ciclo de terminación Prism BigDye; ABI 373A, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania).

Ejemplo 6 Caracterización del locus del gen RH

Se derivó una estructura física del locus de los genes RH (figura 1). Esta estructura se dedujo a partir de las siguientes consideraciones: (i) regiones flanqueantes en 3’. La región flanqueante en 3’ de RHD era altamente homóloga a la parte en 3’ de dJ465N24 (figura 1B, región c). Esta homología continuaba más allá del extremo del ADNc de RHD y se extendía en al menos 8.000 pb tal como se demuestra por el hecho de que era posible obtener amplicones de PCR (figura 1B, PCR 1). Las secuencias homólogas a la parte en 3’ de dJ465N24 eran vecinas a la región en 5’ del gen SMP1 (figura 1B; PCR 2). El extremo 3’ del gen SMP1 aparecía inmediatamente adyacente al gen RHCE tal como se indica mediante la complementariedad de los extremos 3’ de los ADNc respectivos y se confirmó mediante PCR (figura 1B, PCR 3). A continuación se describen detalles adicionales de la región flanqueante en 3’ de RHD 3’ (caja Rhesus) y el gen SMP1. (ii) Regiones flanqueantes en 5’. dJ469D22 comprendía la región flanqueante en 5’ de 33.340 pb de RHCE. Para RHD, una homología de 466 pb entre el extremo 3’ de dJ465N24 y dJ469D22 indicó que dJ465N24 podría representar la secuencia flanqueante en 5’ de RHD. Esta suposición se demostró mediante PCR (figura 2). (iii) Análisis de YAC 38A-A10. Se aisló el ADN de YAC 38A-A10 (centro de recursos HGMP del RU, Cambridge, UK) tras una fase de crecimiento única mediante métodos convencionales (http://hdkiab.wustl.edu/labmanual/yeast). Se confirmó que este YAC contenía ADN de RH. Además, experimentos de clonación al azar indicaron que parte de su inserto se derivaba probablemente del cromosoma X (datos no mostrados). Se había conocido que este YAC contenía los exones 2 a 10 de RHCE y los exones 1 a 10 de RHD (Carritt, Hum. Mol. Genet. 6:843, 1997) y por tanto se esperaba que contuviesen los segmentos de ADN intercalados entre RHD y RHCE. Se observó la presencia de segmentos de ADN representativos de diferentes partes del locus RH en este YAC (tabla 2). Los resultados concordaron con la estructura propuesta del locus RH mostrada en la figura 1, panel A.

Ejemplo de referencia 1

Identificación de secuencias específicas de RHD en el promotor de RHD

Se estableció una secuencia promotora de RHD de aproximadamente 2.000 pb mediante paseo cromosómico (GenomeWalker kit, Clontech, Heidelberg, Alemania). Se amplificaron muestras D-positivas y D-negativas usando los cebadores re04 y re11d (tabla 1) y las secuencias específicas de RHDy RHCE establecidas para 1.200 pb en 5’ del codón de iniciación mediante la secuenciación con cebadores internos. Se identificó una deleción corta en el gen RHD y se usó para desarrollar el cebador específico de RHD re011d. Se ha depositado la secuencia de 1.200 pb que incluye el promotor de RHD en EMBL con el número de registro AJ252314.

Ejemplo 7 Caracterización de cajas Rhesus

Dos segmentos de ADN de aproximadamente 9.000 pb, situados en 5’ y 3’ del gen RHD, eran altamente homólogos, tenían idéntica orientación, y se designaron como "cajas Rhesus" (figura 4). Se amplificaron las cajas Rhesus y se secuenciaron usando cebadores internos en dos fragmentos solapantes usando los pares de cebadores de PCR rez4/rend31 y rend32/re011d (caja Rhesus corriente aguas arriba), rea7/rend31 y rend32/sr9 (caja Rhesus corriente aguas abajo), y rez4/rend31 y rend32/sr9 (caja Rhesus híbrida de RHD-negativo). La caja Rhesus corriente aguas arriba (en 5’ de RHD) tenía aproximadamente 9.142 pb de longitud y terminaba aproximadamente a 4.900 pb en 5’ del codón de iniciación de RHD. La caja Rhesus corriente aguas abajo (en 3’ de RHD) tenía 9.145 pb de longitud y se iniciaba 104 pb tras el codón de terminación de RHD. Las cajas Rhesus englobaban exactamente la parte de RHD con homología con RHCE. La parte central de ambas cajas Rhesus contenía un resto casi completo de un elemento humano de tipo transposón (THE-1B). El único marco de lectura abierto que se encuentra normalmente en el elemento THE-1B se suprimió, sin embargo, debido a varias aberraciones de nucleótidos que se producen en ambas cajas Rhesus en paralelo, incluyendo una mutación sin sentido en el codón 4. Aunque hubo una homología global del 98,6% entre ambas cajas Rhesus, una "región de identidad" de 1.463 pb situada entre las posiciones 5.701 y 7.163 era completamente idéntica con la única excepción de una inserción T de 4 pb en una zona de poli T.

Caja Rhesus corriente aguas abajo, a una distancia entre RHD y RHCE de aproximadamente 30.000 pb (figura 1).

Ejemplo 8 Ubicación de la deleción del gen RHD en los haplotipos RHD-negativos

Se pensó que la homología de las dos cajas Rhesus puede haber desempeñado un papel decisivo en el mecanismo para la deleción de RHD en los haplotipos RHD-negativos comunes. Se determinó la secuencia de nucleótidos de la caja Rhesus en ADN RHD-negativo (figura 5). La única caja Rhesus detectada en RHD-negativos tenía una estructura híbrida. El extremo 5’ de esta caja Rhesus representaba una caja Rhesus corriente aguas arriba, el extremo 3’ una caja Rhesus corriente aguas abajo. Se determinó que la región de punto de ruptura de 903 pb de la deleción de RHD se situaba en la región de identidad de las cajas Rhesus (figura 4, flecha que apunta a la izquierda).

Ejemplo 9 Detección específica de la deleción de RHD mediante PCR

Se desarrollaron dos métodos basados en PCR para la detección específica de la deleción del gen RHD que se produce en los haplotipos RHD-negativos prevalentes (figura 6). Se realizó una PCR-SSP de largo alcance usando el sistema de PCR con cebadores largos de gran expansión con tampón 3 y los cebadores rez4 (en 5’ de la caja Rhesus corriente aguas arriba) y sr9 (exón 1 de SMP1). La hibridación fue a 60°C y la extensión 20 min. a 68°C. Se resolvieron los amplicones de la PCR usando un gel de agarosa al 1%. Se realizó PCR-RFLP usando el sistema de PCR de alta fidelidad de expansión y los cebadores rez7 (no específicos, en 5’ de la región de identidad de la caja Rhesus) y mb31 (específico para la caja Rhesus corriente aguas abajo, en 3’ de la región de identidad de la caja Rhesus). La hibridación fue a 65°C y la extensión 10 min a 68°C. Se digirieron los amplicones de la PCR con PstI durante 3 horas a 37°C y se resolvieron los fragmentos resolved u usando un gel de agarosa al 1%. Estas técnicas permitieron la detección rápida y directa de haplotipos RHD-negativos comunes, aun cuando están en trans con respecto a haplotipos RHD-positivos. Se aplicó además PCR-RFLP a un número mayor de muestras (tabla 3). Tal como se esperaba, las 33 muestras con genotipo conocido se tipificaron correctamente. En 68 muestras adicionales representativas de los fenotipos más comunes, los resultados concordaron con las frecuencias de haplotipos conocidas en la población.

Ejemplo 10 PCR-SSPde RHD

Se adaptaron y extendieron las reacciones de PCR-SSP (tabla 4) a partir de un método de PCR-SSP específicos de exones de RHD descrito previamente (Gassner, Transfusion 37:1020-6, 1997) y se desencadenaron para funcionar en condiciones de termociclación idénticas. Las concentraciones de los cebadores específicos fueron de 0,2 \muM para todas las reacciones con la excepción del exón 6 (0,1 \muM), intrón 7 (0,4 \muM) y exón 9 (0,4 \muM). Para la mayor parte de las muestras, se sometió a prueba el intrón 4/exón 7 como reacción múltiplex que contenía 0.2 \muM de los cebadores del exón 7 (conjunto de cebadores ga71/ga72) y 0,1 \muM del intrón 4. Cada reacción contenía un conjunto de cebadores de HGH (Gassner, Transfusion 37:1020-6, 1997) como control interno en concentraciones de 0,05 \muM para el promotor, intrón 4, y exón 7 con ga71/ga72; 0,075\muM para el exón 10; 0,1 \muM para el intrón 7; 0,15 \muM para el exón 3, exón 4, exón 7 con rb26/re71, y exón 9; 0,2 \muM para el exón 5 y exón 6. La concentración de Mg^{2+} fue de 0,4 \muM para el intrón 7 y para todas las demás reacciones de 0,15 \muM. Para el exón 6, se añadió disolución Q al 20% (Qiagen, Hilden, Germany).

Ejemplo de referencia 2

Frecuencias de haplotipos

Para los alelos observados más de una vez, su asociación de haplotipo fue trivial. Se supuso que los alelos que sólo se observaron una vez estaban asociados con el haplotipo Cde o cdE en lugar del haplotipo cde, porque no se detectó alelo RHD-positivo en ninguna muestra ccddee. Un alelo que aparece en una única muestra CcddEe se contó formalmente como la mitad para Cde y la mitad para cdE. Se supuso que las muestras CCddee albergaban un alelo Cde normal y uno aberrante. Se calculó la frecuencia de un alelo de RHD aberrante dado en su haplotipo como el número de muestras observadas dividido entre el número de los correspondientes haplotipos en observación (500 Cde, 302 cdE). Se calculó la frecuencia en la población de un alelo de RHD a partir de la frecuencia de este alelo en su haplotipo y la frecuencia conocida del haplotipo en la población local (Wagner, Infusionsther. Transfusionsmed. 22:285-90, 1995). Se calcularon las frecuencias de haplotipos para cada patrón de PCR y para cada alelo de RHD (tabla 8). Según un estudio previo en Inglaterra por Avent et al. (Avent, Blood 89:2568-77, 1997), el 4,9% de haplotipos Cde y el 1,5% de haplotipos cdE fueron RHD-positivos en nuestra población. Como no se detectó ningún alelo RHD-positivo entre 314 muestras ccddee, la frecuencia del haplotipo cde fue inferior al 0,5 % (límite superior del intervalo de confianza del 95% unilateral, distribución de Poisson). Las tres frecuencias difirieron de manera estadísticamente significativa entre sí (p<0,05; prueba exacta de Fisher bilateral para cada comparación por parejas corregida según Bonferoni-Holm). Se estimó que la frecuencia en la población de cualquier haplotipo D-negativo RHD-positivo era de 1:1.606. Los alelos D_{el} sólo pudieron observarse en los haplotipos que se presume que son Cde. Aproximadamente el 3% de las muestras que portan el antígeno C que se tipificaron como D-negativas en la rutina del banco de sangre representaban D_{el}. La frecuencia en la población de alelos D_{el} era de 1:3.030.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Cebadores

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

TABLA 8 Frecuencias estimadas en la población

11

12

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42. Wagner FF, Gassner C, Müller TH, Schönitzer D, Schunter F, Flegel WA: Molecular basis of weak D phenotypes. Blood 93:385, 1999

43. Wagner FF, Frohmajer A, Ladewig B, Eicher NI, Lonicer CB, Müller TH, Siegel MH, Flegel WA. Weak D alleles express distinct phenotypes. Blood 2000; 95: 2699 - 2708

44. Wagner FF, Flegel WA. RHD gene deletion occurred in the Rhesus box. Blood 2000;

45. Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärztekammer; Paul-Ehrlich-Institut. Richtlinien zur Blutgruppenbestimmung und Bluttransfusion (Hämotherapie). Köln: Deutscher Ärzte-Verlag; 1996.

46. Legler TJ, Kohler M, Mayr WR, Panzer S, Ohto H, Fischer GF; Genotyping of the human platelet antigen systems 1 through 5 by multiplex polymerase chain reaction and ligation-based typing. Transfusion 1996 May; 36(5): 426-31

Claims (34)

1. Estructura molecular de ácido nucleico que representa o bien la caja híbrida Rhesus, o bien la caja Rhesus corriente aguas arriba o bien la caja Rhesus corriente aguas abajo, cuya secuencia se muestra en SEQ ID Nos 18 a 20 respectivamente.

2. Estructura molecular de ácido nucleico según la reivindicación 1, representativa de los haplotipos RHD-negativos comunes, en la que dicho haplotipo RHD-negativo se refiere a cualquier haplotipo negativo para el antígeno RhD que comprende una caja Rhesus híbrida.

3. Estructura molecular de ácido nucleico según la reivindicación 1, representativa de un haplotipo RHD-negativo que comprende una deleción del gen RHD que implica la caja Rhesus corriente aguas arriba, la caja Rhesus corriente aguas abajo o ambas.

4. Estructura molecular de ácido nucleico según la reivindicación 1, representativa de los haplotipos RHD-positivos comunes, en la que dicho haplotipo RHD-positivo se refiere a cualquier haplotipo que comprende secuencias de ADN específicas para el gen RHD.

5. Estructura molecular de ácido nucleico según la reivindicación 1, derivada de una muestra que comprende un haplotipo RHD-positivo que se clasifica serológicamente como RhD-negativo, en el que dicho haplotipo RHD-positivo que se clasifica serológicamente como RhD-negativo describe una muestra que se ha sometido a prueba para determinar la presencia de antígeno RhD usando por ejemplo ensayos serológicos rutinarios en los que el resultado de tales ensayos fue negativo.

6. Estructura molecular de ácido nucleico según la reivindicación 5, en la que se selecciona dicha muestra de una población de raza blanca.

7. Procedimiento para detectar específicamente un haplotipo RHD-negativo producido por una mutación sin sentido, mutación de cambio de sentido, mutación de un sitio de corte y empalme, deleción parcial, inserción parcial, inversión parcial o una combinación de las mismas dentro del gen RHD, que termina o suprime la expresión de un producto proteico del gen RHD en una muestra utilizando o bien una caja Rhesus híbrida o bien la caja Rhesus corriente aguas arriba o bien la caja Rhesus corriente aguas abajo, cuyas secuencias se muestran en SEQ ID Nos 18 a 20 respectivamente o una característica estructural según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 con técnicas conocidas en la técnica, preferiblemente mediante PCR-RFLP, PCR-SSP o PCR de largo alcance.

8. Vector que comprende la estructura molecular de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Huésped no humano transformado con el vector según la reivindicación 8.

10. Oligonucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con una parte de la estructura molecular de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha parte hibrida con una región que implica el punto de ruptura de dicho gen híbrido o con la parte complementaria de la misma, en la que dicha región que implica el punto de ruptura se caracteriza porque la parte 5’ de la caja RHD corriente aguas arriba está en proximidad espacial cercana a la parte 3’ de la caja RHD corriente aguas abajo y en el que dicho oligonucleótido engloba 20 nucleótidos y está situado en 5’ y 3’ del punto de ruptura real.

11. Método para probar la presencia de una molécula de ácido nucleico que porta una deleción del gen RHD como la caracterizada por la estructura molecular de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en una muestra que comprende hibridar el oligonucleótido según la reivindicación 10 en condiciones rigurosas con moléculas de ácido nucleico comprendidas en la muestra obtenida de un ser humano y detectar dicha hibridación.

12. Método según la reivindicación 11, que comprende además digerir el producto de dicha hibridación con una endonucleasa de restricción y analizar el producto de dicha digestión.

13. Método para probar la presencia de una molécula de ácido nucleico que porta una deleción del gen RHD tal como la caracterizada por la estructura molecular de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en una muestra que comprende determinar la secuencia de ácido nucleico de al menos una parte de la estructura molecular de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, codificando dicha parte un punto de ruptura de dicho gen híbrido.

14. Método según la reivindicación 13, que comprende además, antes de determinar dicha secuencia de ácido nucleico, la amplificación de al menos dicha parte de dicha estructura de ácido nucleico.

15. Método para probar la presencia de una molécula de ácido nucleico que porta una deleción del gen RHD como la caracterizada por la estructura molecular de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en una muestra que comprende llevar a cabo una reacción de amplificación usando un conjunto de cebadores que amplifica al menos una parte de dicha secuencia, en el que al menos uno de los cebadores empleados en dicha reacción de amplificación es un oligonucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con una parte de la estructura molecular de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha parte hibrida con una región que implica el punto de ruptura de dicho gen híbrido o con la parte complementaria de la misma, en el que dicha región que implica el punto de ruptura se caracteriza porque la parte 5’ de la caja RHD corriente aguas arriba está en proximidad espacial cercana a la parte 3’ de la caja RHD corriente aguas abajo.

16. Método según las reivindicaciones 14 ó 15, en el que dicha amplificación se realiza mediante o dicha reacción de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

17. Método según la reivindicación 16, en el que dicha PCR es PCR-RFLP, PCR-SSP o PCR de largo alcance

18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que se analiza el peso molecular del producto de amplificación.

19. Método para probar la presencia de una estructura molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 5 ó 6, que codifica alelos RHD-positivos que comprende las siguientes etapas:

(a) aislar el ADN de una muestra de sangre obtenida de un donante de sangre;

(b) hibridar al menos dos cebadores orientados de forma opuesta en condiciones rigurosas con el ADN de modo que se lleve a cabo una PCR;

(c) amplificar la secuencia diana;

(d) separar los productos de amplificación en un gel; y

(e) analizar los amplicones.

20. Método según la reivindicación 19, en el que dichos alelos RHD-positivos se derivan de una muestra RhD-negativa serológicamente.

21. Método según la reivindicación 19 ó 20, en el que dicha muestra se selecciona de una población de raza blanca.

22. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 11 a 21, en el que dicha muestra es sangre, suero, plasma, tejido fetal, saliva, orina, tejido mucoso, moco, tejido vaginal, tejido fetal obtenido de la vagina, piel, pelo, folículo piloso u otro tejido humano.

23. Método según la reivindicación 22, que comprende el enriquecimiento de células fetales o la extracción de ADN fetal o ARNm de tejido materno, tal como sangre periférica, suero o plasma.

24. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 11 a 23, en el que se fija dicha molécula de ácido nucleico o material proteico de dicha muestra a un soporte sólido.

25. Método según la reivindicación 24, en el que dicho soporte sólido es un chip.

26. uso de la estructura molecular de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para el análisis de un fenotipo Rhesus-D positivo o negativo.

27. Método para determinar si un paciente que necesita una transfusión de sangre va a transfundirse con sangre RhD- negativa de un donante que comprende la etapa de probar en una muestra procedente de dicho paciente la presencia de una o más estructuras de ácido nucleico según una cualquiera de la reivindicación 2 y las reivindicaciones 5 y 6, en el que una prueba positiva para dos de dichas estructuras moleculares de ácido nucleico diferentes es indicativa de la necesidad de una transfusión con sangre Rh-negativa.

28. Método para determinar si la sangre de un donante puede usarse para la transfusión a un paciente que necesita la misma, que comprende la etapa de probar en una muestra procedente de dicho donante la presencia de una o más estructuras moleculares de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que una prueba negativa para la estructura molecular de ácido nucleico según la reivindicación 2, con o sin una prueba negativa para una o más estructuras moleculares de ácido nucleico según las reivindicaciones 4 a 6, excluye la transfusión de la sangre del donante a un paciente tipificado como RhD-negativo.

29. Método para evaluar el riesgo de una madre RhD-negativa para concebir o gestar un feto RhD-positivo o el riesgo de una madre que tiene un título de anti-D para concebir o gestar un feto con riesgo de desarrollar una enfermedad hemolítica del recién nacido que comprende evaluar una muestra obtenida del padre o del feto para determinar la presencia de una o más estructuras moleculares de ácido nucleico como las definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

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30. Método según la reivindicación 29, en el que dicha estructura molecular de ácido nucleico porta mutaciones o deleciones.

31. Método para evaluar la posibilidad o probabilidad de que un hombre sea el padre de un niño mediante el ensayo en una muestra procedente dicho hombre de la presencia de una o más estructuras de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los resultados de la prueba se usan para determinar la homocigosidad, la heterocigosidad o la ausencia de cualquier estructura molecular de ácido nucleico o una molécula nucleica según las reivindicaciones 2 y 4 a 6 usada para inferir la posibilidad o probabilidad de que dicho hombre sea el padre del niño.

32. Kit que comprende

(a) el oligonucleótido según la reivindicación 10; y/o

(b) un par de cebadores útiles para llevar a cabo la reacción de amplificación según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17.

33. Uso de un oligonucleótido para hibridarlo en condiciones rigurosas con una parte de la estructura molecular de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha parte hibrida con una región que implica el punto de ruptura de dicho gen híbrido o con la parte complementaria de la misma, en el que dicha región que implica el punto de ruptura se caracteriza porque la parte 5’ de la caja Rhesus corriente aguas arriba está en proximidad espacial cercana a la parte 3’ de la caja Rhesus corriente aguas abajo.

34. Método para probar la presencia de la estructura molecular de ácido nucleico según la reivindicación 3, representativa de un haplotipo de RHD-negativo común que comprende las siguientes etapas:

(a) aislar el ADN de una muestra de sangre o una muestra obtenida de un donante de sangre;

(b) hibridar al menos dos cebadores orientados de forma opuesta en condiciones rigurosas al ADN de modo que se lleve a cabo una PCR;

(c) amplificar la secuencia diana;

(d) separar los productos de amplificación en un gel; y

(e) analizar los amplicones.