CN103966228B - 一种Rh血型DEL型RHD93T＞A等位基因及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种<i>RHD</i>93T>A等位基因及其检测方法，属于分子生物学分析检测技术领域。其通过PCR-特异性引物技术设计出可以对包含具有突变基因序列的目标部位的区域进行扩增的引物序列，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的区域选择性地专门针对特异性的<i>RHD</i>93T>A等位基因进行PCR扩增检测。本发明采用分子生物学方法进行基因水平的检测，该方法大大提高了检测的灵敏性、特异性，简便、快速。由于不同民族间存在<i>RHD</i>基因的差异，在相关研究的基础上，根据中国人的<i>RHD</i>基因分子背景，专门针对<i>RHD</i>93T>A等位基因而设计的。本发明不仅在弥补血清学技术的不足上具有重要的临床实用意义，而且还具有广泛的科研应用价值。

Description

一种Rh血型DEL型RHD93T＞A等位基因及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种RHD93T>A等位基因及其检测方法，具体涉及一种掺杂于野生型基因簇中的已知突变基因的方法，属于分子生物学分析检测技术领域。

背景技术

Rh血型是人类红细胞血型系统中最为复杂、最具多态性的系统，也是引起临床输血反应和严重新生儿溶血病的主要红细胞血型。目前已发现50多种Rh血型抗原，其中RhD抗原具有很强的免疫原性，是由RHD基因编码产生，是血型研究的重点。临床上根据红细胞膜表面是否检测到D抗原，将Rh血型抗原分为RhD阳性和RhD阴性两大类。

1984年日本学者Okubo等对经直接凝集试验和间接抗人球蛋白试验(IAT)确认的RhD阴性样本通过吸收放散试验进一步检测，发现一部分个体红细胞表面仍可检测到D抗原的存在，称之为D放散型(DEL型)。它属于弱D型的一种，抗原性极弱。与白种人相比，DEL型在中国RhD阴性人群中比率甚高。Shao等对广东深圳地区大样本调查结果显示，DEL型在我国通过常规血清学鉴定的RhD阴性人群中所占比率约为26％，台湾学者报道该地区的比率是32.6％。Wagner等进行大样本调查发现DEL型在欧洲白色人种中罕见。不同地区不同种族因存在遗传背景的差异，DEL血型D抗原的基因型也存在较大差异。近年来有关DEL血型RHD基因的研究成为红细胞血型研究的热点。陆续发现DEL血型RHD基因中有新的等位基因存在，并具有明显的遗传特性。

目前，DEL血型D抗原的常规检测方法是采用血清学盐水法和间接抗人球蛋白实验以及吸收放散试验进行鉴定。该方法不仅操作繁琐、结果也存在不稳定性。此外，由于疾病或其他因素的影响，某些个体的红细胞在血清学定型时结果难以判断；慢性长期输血患者血清学结果有时呈现“混合视野”的现象；当无法获得样本的红细胞或红细胞样本不足时，像胎儿血型鉴定、法医鉴定遗留物等，血清学检测也不能获得正确结果。

用免疫血清学的方法对DEL血型的检测有赖于使用的抗-D抗体的特异性和操作方法，可靠性性较低，而且由于步骤繁琐而不适合临床大规模应用，可靠的方法是应用基因检测的方法检出DEL血型。此时通过检测DNA确定DEL血型D抗原基因型，不仅在弥补血清学技术的不足上具有重要的临床实用意义，而且还具有广泛的科研应用价值。近年来DEL血型D抗原不断有新的等位基因被发现，本研究小组最近也发现了1例DEL血型RHD基因型RHD93T>A突变的新等位基因，并针对新发现的RHD93T>A等位基因建立了相应的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供Rh血型DEL型RHD93T>A突变基因及其检测方法，通过检测RHD93T>A基因突变进行Rh血型DEL型基因型分析并作为DEL血型的表型鉴定指标。

本发明的检测方法是利用人类DEL血型不同基因型的特异性序列位点的改变，设计出针对性的引物序列，进行聚合酶链反应来完成的。

按照本发明提供的技术方案，一种Rh血型DEL型RHD93T>A等位基因，其野生型基因DNA序列如SEQIDNO：1所示，突变基因DNA序列如SEQIDNO：2所示。

从待测样品中得到核苷酸序列与RHD野生型的序列进行比较，核对突变是否为93T→A突变。所述RHD突变基因的编码蛋白质具有31F→L氨基酸序列的改变。

所述Rh血型DEL型RHD93T>A等位基因的检测方法，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无；检测方法包括以下步骤：

(1)提取待检样本中DNA；

(2)以该DNA为模板，针对RHD93T>A突变基因附近的编码区设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；

(3)测出PCR反应产物的核苷酸序列组成；

(4)将核苷酸序列与RHD野生型基因的序列进行比较，确定是否有93T→A突变。

通过数据库BLAST比对功能，按照正常读码框架进行翻译以确定是否存在31F→L氨基酸突变位点。所述PCR反应产物的核苷酸序列组成可以将PCR反应产物通过测序仪进行测序。

所述Rh血型DEL型RHD93T>A等位基因的检测方法，具体步骤为：

(1)引物设计：针对RHD等位基因序列，设计一对特异性寡核苷酸引物序列，其中正向引物为RHD93A-F，其序列如SEQIDNO：3所示；反向引物为RHD93A-R，其序列如SEQIDNO：4所示；扩增产物片段长度为125bp；并引入1对内参照引物序列作为DNA样本扩增阳性内参照，正向引物为β-globin-F，其序列如SEQIDNO：5所示；反向引物为β-globin-R，其序列如SEQIDNO：6所示，内参照扩增产物片段长度为102bp；

(2)RHD93T>A等位基因增扩：反应体系总体积50μL；其中含PCR5×缓冲液10μL，DNA模板200ng，1U/μL的Taq聚合酶1.0μL，MgCl₂终浓度为2.0mmol/L，dNTP终浓度为200nmol/L，特异性正向引物和反向引物的终浓度均为200nmol/L；加消毒双蒸水至反应体系总体积50μL；

将上述反应体系在PCR仪中反应，反应条件：95℃预变性5min，然后依次94℃变性30s，接着60℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环；

(3)RHD93T>A等位基因检测：用琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。

本发明的有益效果：本发明采用分子生物学方法进行基因水平的检测，可以高灵敏且高精度检测掺杂于基因库中的突变基因的有无。由于不同民族间存在RHD基因的差异，在相关研究的基础上，根据中国人的RHD基因分子背景，专门针对RHD93T>A等位基因而设计的。通过检测RHD93T>A基因突变进行Rh血型DEL型基因型分析并作为DEL血型的表型鉴定指标。本发明不仅在弥补血清学技术的不足上具有重要的临床实用意义，而且还具有广泛的科研应用价值。

附图说明

图1是实施例中RHD93T>A等位基因检测凝胶电泳图。

图2是实施例中RHD93T>A等位基因突变测序图。

具体实施方式

本发明中，“野生型基因”是指未发生突变，具有原本正常功能的含有遗传信息的基因；“突变型基因”是指发生了突变的基因；“突变”是指DNA、RNA等的核酸序列的改变，相当于遗传学中使用的碱基置换、插于、缺失、倒位、重复、易位等；“基因库”是指由大量基因构成的基因群体。

实施例1DNA模板的制备

所述DNA模板的制备过程采用购置的试剂盒提取全血基因组DNA，具体步骤如下：

(1)取无菌2.0mL离心管一只，加入1mL细胞裂解液。

(2)轻轻震荡然经EDTA抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μL血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5-6次混匀。

(3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2-3次混匀)。

(4)12000rpm室温离心5分钟。

(5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出。

(6)使用涡旋振荡器(Votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10-15秒)。

(7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μL，用移液枪头吸放溶液5-6次裂解白细胞，此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散；若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μL并重复置于37℃孵育。

(8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μL，用涡旋振荡器剧烈震荡10-20秒。

(9)12000rpm室温离心5分钟。

(10)将其上清液转至对应编号的已加入300μL室温异丙醇的2.0mL离心管中。

(11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状DNA形成沉淀。

(12)12000rpm室温离心1分钟。

(13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温体积浓度为70％的乙醇，轻轻颠倒离心管数次。

(14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净，将离心管置于50℃烘烤5-10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净。

(15)向离心管中加入50-100μL的DNA溶解液，轻轻混匀。

(16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估DNA提取效果，Nanodrop核酸仪检测含量，定量到20ng/μL，-20℃保存。

实施例2RHD93T>A等位基因检测技术方案：

仪器：Veriti96型PCR仪、BIO-RADGelDocXR+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。

试剂：QIAampDNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)；DNAIsolationKit提取试剂盒(北京PELFREEZ公司)；PCR缓冲液、dNTP、Taq酶(美国ABI公司)；引物和探针由上海生工生物有限公司合成。

(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的RHD基因(序列号：BN000065)和中国人各种RHD等位基因的序列，通过Oligo6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列(RHD93A-F，GCTCTCATTCTCCTCTTCTATTTTTTA；RHD93A-R，CCTGCTATTTGCTCCTGTGACCACTT)，扩增产物片段长度为125bp；并引入1对内参照引物序列作为DNA样本扩增阳性内参照(β-globin-F，GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA；β-globin-R，CCTTGATACCAACCTGCCCAG)，内参照扩增产物片段长度为102bp。

RHD93T>A等位基因检测引物序列及反应特异性如表1所示。

表1

注：*F＝正向引物；R＝反向引物。

^#引物核苷酸序列所涉及的外显子碱基序列的位置是指由ATG起始编码子开始的10个外显子整个排列顺序编号；所涉及的内含子碱基序列的位置是指每个内含子单个排列顺序编号。

(2)反应条件：反应总体积：50μL，含PCR5×缓冲液10μL，DNA模板200ng，Taq聚合酶(1U/μL)1.0μL，MgCl₂终浓度2.0mmol/L，dNTP终浓度200nmol/L，以及特异性上、下引物终浓度200nmol/L，并加消毒双蒸水至总体积50μL。

反应条件：95℃预变性5分钟，然后依次94℃变性30秒，接着60℃退火40秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。

(3)等位基因检测：用1.5％琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，PCR产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示PCR产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。根据上述引物扩增的目的片段PCR产物为125bp，反应结果见附图1，可见目的条带，说明引物设计合理，可以扩增出目的条带。

其中，所得PCR产物经凝胶电泳如图1所示，由图中所表示M：Marker,50bp梯度分子量标记物，1：空白对照，2-3：RHD基因野生型对照，4-6：RHD93T>A突变型样本。

所得PCR产物经测序如图2所示，图中箭头所示为RHD基因第1外显子93位置出现了T>A突变。

Claims (2)

1.一种Rh血型DEL型RHD93T>A等位基因，其特征是：其野生型基因DNA序列如SEQIDNO：1所示，突变型基因DNA序列如SEQIDNO：2所示。

2.权利要求1所述Rh血型DEL型RHD93T>A等位基因的检测方法，其特征是：通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无；检测方法包括以下步骤：

（1）提取待检样本中DNA；

（2）以该DNA为模板，针对RHD93T>A突变基因附近的编码区设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；

（3）测出PCR反应产物的核苷酸序列组成；

（4）将核苷酸序列与RHD野生型基因的序列进行比较，确定是否有93T→A突变；

具体步骤为：

（1）引物设计：针对RHD等位基因序列，设计一对特异性寡核苷酸引物序列，其中正向引物为RHD93A-F，其序列如SEQIDNO：3所示；反向引物为RHD93A-R，其序列如SEQIDNO：4所示；扩增产物片段长度为125bp；并引入1对内参照引物序列作为DNA样本扩增阳性内参照，正向引物为β-globin-F，其序列如SEQIDNO：5所示；反向引物为β-globin-R，其序列如SEQIDNO：6所示，内参照扩增产物片段长度为102bp；

（2）RHD93T>A等位基因增扩：反应体系总体积50μL；其中含PCR5×缓冲液10μL，DNA模板200ng，1U/μL的Taq聚合酶1.0μL，MgCl₂终浓度为2.0mmol/L，dNTP终浓度为200nmol/L，特异性正向引物和反向引物的终浓度均为200nmol/L；加消毒双蒸水至反应体系总体积50μL；

将上述反应体系在PCR仪中反应，反应条件：95℃预变性5min，然后依次94℃变性30s，接着60℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环；

（3）RHD93T>A等位基因检测：用琼脂糖凝胶对将步骤（2）所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。