CN104745592A - Cyp4v2基因突变体及其应用 - Google Patents
Cyp4v2基因突变体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104745592A CN104745592A CN201310751725.XA CN201310751725A CN104745592A CN 104745592 A CN104745592 A CN 104745592A CN 201310751725 A CN201310751725 A CN 201310751725A CN 104745592 A CN104745592 A CN 104745592A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sample
- nucleotide sequence
- cyp4v2
- retina
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Abstract
本发明公开了CYP4V2基因突变体及其应用,具体涉及分离的编码CYP4V2突变体的核酸,分离的多肽,筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法,筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的系统,以及用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的试剂盒。其中,该分离的编码CYP4V2突变体的核酸,与SEQ ID NO:1相比,具有c.31C>T突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在,可以有效地检测生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性。
Description
技术领域
本发明涉及CYP4V2基因突变体及其应用。具体地,本发明涉及分离的编码CYP4V2突变体的核酸,分离的多肽,筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法,筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的系统,用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的试剂盒,构建体以及重组细胞。
背景技术
Bietti’s结晶样视网膜变性(Bietti’s crystalline Corneoretinal dystrophy,简称BCD)是罕见的遗传性致盲疾病,在全世界的发病率约为1/24000,其高发人群是中国人,在我国的发病率约为1/4000。BCD患者通常20—30岁发病,40—50岁致盲,目前已经成为威胁全球青年和中年人群视觉功能、视觉质量的主要眼部疾病,最终严重影响患者的生活质量,给家庭和社会带来了巨大的负担。BCD是由于视网膜感光细胞(包括视锥细胞和视杆细胞)和视网膜色素上皮细胞变性,伴随进行性脉络膜血管萎缩、硬化而导致的致盲性遗传性眼病。BCD的遗传方式主要是常染色体隐性遗传(autosoma recessive BCD,简称为ARBCD)。
目前原发性BCD的基因学方面的研究较少,其致病相关机制仍不明确。因而,目前对原发性BCD尤其是其致病基因的研究仍有待深入。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易感原发性结晶样视网膜变性(BCD)的生物样品的方法。
本发明是基于发明人的下列工作完成的:发明人通过外显子组测序、Sanger测序验证、蛋白结构分析的方法确定了原发性结晶样视网膜变性的一个新的致病突变——CYP4V2基因的c.31C>T突变。
进而,根据本发明的第一方面,本发明提出了一种分离的编码CYP4V2突变体的核酸。根据本发明的实施例,所述核酸与SEQ ID NO:1相比,具有c.31C>T突变,即相对于野生型CYP4V2基因,本发明的CYP4V2基因突变体的cDNA第31位碱基C突变为T。根据本发明的实施例,发明人确定了CYP4V2基因的突变体,该突变体与原发性结晶样视网膜变性的发病密切相关,从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在,可以有效地检测生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性。
根据本发明的第二方面,本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例,与SEQID NO:2相比,所述分离的多肽具有p.Q11X突变,即该突变是由于c.31C>T突变而引起的,具体地,相对于野生型CYP4V2,本发明的分离的多肽(即CYP4V2突变体)第11位氨基酸由Gln突变为终止码。通过检测生物样品中是否表达该多肽,可以有效地检测生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性。
根据本发明的第三方面,本发明提出了一种筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法。根据本发明的实施例,该方法包括以下步骤:从所述生物样品提取核酸样本;确定所述核酸样本的核酸序列;所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比,具有c.31C>T突变是所述生物样品易感原发性结晶样视网膜变性的指示。通过根据本发明实施例的筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法,可以有效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品。
根据本发明的第四方面,本发明提出了一种筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的系统。根据本发明的实施例,该系统包括:核酸提取装置,所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本;核酸序列确定装置,所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连,用于对所述核酸样本进行分析,以便确定所述核酸样本的核酸序列;判断装置,所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连,以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比,是否具有c.31C>T突变,判断所述生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性。利用该系统,能够有效地实施前述筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法,从而可以有效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品。
根据本发明的第五方面,本发明提出了一种用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例,该试剂盒含有:适于检测CYP4V2基因突变体的试剂,其中与SEQ ID NO:1相比,该CYP4V2基因突变体具有c.31C>T突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒,能够有效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品。
根据本发明的第六方面,本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例,该构建体包含前面所述的分离的编码CYP4V2突变体的核酸。由此,利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞,能够有效地用于筛选治疗原发性结晶样视网膜变性的药物。
根据本发明的第七方面,本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例,该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例,利用本发明的重组细胞,能够有效地筛选治疗原发性结晶样视网膜变性的药物。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了根据本发明实施例的筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的系统及其组成部分的示意图,其中,
图1I为根据本发明实施例的筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的系统的示意图,
图1II为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图,
图1III为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图;
图2显示了根据本发明一个实施例的BCD患者家系的家系图;
图3显示了根据本发明一个实施例,图2所示BCD患者家系中先证者的眼底像;
图4显示了根据本发明的一个实施例,图2所示BCD患者家系中先证者、家系内正常人和家系外正常对照的CYP4V2基因c.31C>T突变位点的代表性Sanger测序验证峰图,其中,
图4Ⅰ为根据本发明实施例的先证者的CYP4V2基因c.31C>T突变位点的代表性Sanger测序验证峰图,
图4Ⅱ为根据本发明实施例的家系内正常人的CYP4V2基因c.31C>T突变位点的代表性Sanger测序验证峰图,
图4Ⅲ为根据本发明实施例的家系外正常对照的CYP4V2基因c.31C>T突变位点的代表性Sanger测序验证峰图;
图5显示了根据本发明的一个实施例,多个物种CYP4V2蛋白的序列对比结果。
具体实施方式
下面参考具体实施例,对本发明进行说明,需要说明的是,这些实施例仅是说明性的,而不能理解为对本发明的限制。
CYP4V2基因突变体
根据本发明的第一方面,本发明提出了一种分离的编码CYP4V2突变体的核酸。根据本发明的实施例,所述核酸与SEQ ID NO:1相比,具有c.31C>T突变。在本文中所使用的表达方式“编码CYP4V2突变体的核酸”,是指与编码CYP4V2突变体的基因相对应的核酸物质,即核酸的类型不受特别限制,可以是任何包含与CYP4V2突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物,包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例,前面所述的编码CYP4V2突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例,发明人确定了CYP4V2基因的突变体,该突变体与原发性结晶样视网膜变性的发病密切相关,从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在,可以有效地检测生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性,也可以通过检测该突变体在生物体中是否存在,可以有效地预测生物体是否易感原发性结晶样视网膜变性。
对于本发明说明书和权利要求书中,提及核酸,本领域技术人员应当理解,实际包括互补双链的任意一条,或者两条。为了方便,在本说明书和权利要求书中,虽然多数情况下只给出了一条链,但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如,提及SEQ ID NO:1,实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解,利用一条链可以检测另一条链,反之亦然。
该编码CYP4V2突变体的核酸,是本申请的发明人通过外显子组测序、Sanger测序验证以及蛋白结构分析的方法确定的原发性结晶样视网膜变性的致病基因CYP4V2的新的致病突变。该致病突变位点在现有技术中并未被提到。
其中,野生型CYP4V2基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列:
ATGGCGGGGCTCTGGCTGGGGCTCGTGTGGCAGAAGCTGCTGCTGTGGGGCGCGGCGAGTGCCCTTTCCCTGGCCGGCGCCAGTCTGGTCCTGAGCCTGCTGCAGAGGGTGGCGAGCTACGCGCGGAAATGGCAGCAGATGCGGCCCATCCCCACGGTGGCCCGCGCCTACCCACTGGTGGGCCACGCGCTGCTGATGAAGCCGGACGGGCGAGAATTTTTTCAGCAGATCATTGAGTACACAGAGGAATACCGCCACATGCCGCTGCTGAAGCTCTGGGTCGGGCCAGTGCCCATGGTGGCCCTTTATAATGCAGAAAATGTGGAGGTAATTTTAACTAGTTCAAAGCAAATTGACAAATCCTCTATGTACAAGTTTTTAGAACCATGGCTTGGCCTAGGACTTCTTACAAGTACTGGAAACAAATGGCGCTCCAGGAGAAAGATGTTAACACCCACTTTCCATTTTACCATTCTGGAAGATTTCTTAGATATCATGAATGAACAAGCAAATATATTGGTTAAGAAACTTGAAAAACACATTAACCAAGAAGCATTTAACTGCTTTTTTTACATCACTCTTTGTGCCTTAGATATCATCTGTGAAACAGCTATGGGGAAGAATATTGGTGCTCAAAGTAATGATGATTCCGAGTATGTCCGTGCAGTTTATAGAATGAGTGAGATGATATTTCGAAGAATAAAGATGCCCTGGCTTTGGCTTGATCTCTGGTACCTTATGTTTAAAGAAGGATGGGAACACAAAAAGAGCCTTCAGATCCTACATACTTTTACCAACAGTGTCATCGCTGAACGGGCCAATGAAATGAACGCCAATGAAGACTGTAGAGGTGATGGCAGGGGCTCTGCCCCCTCCAAAAATAAACGCAGGGCCTTTCTTGACTTGCTTTTAAGTGTGACTGATGACGAAGGGAACAGGCTAAGTCATGAAGATATTCGAGAAGAAGTTGACACCTTCATGTTTGAGGGGCACGATACAACTGCAGCTGCAATAAACTGGTCCTTATACCTGTTGGGTTCTAACCCAGAAGTCCAGAAAAAAGTGGATCATGAATTGGATGACGTGTTTGGGAAGTCTGACCGTCCCGCTACAGTAGAAGACCTGAAGAAACTTCGGTATCTGGAATGTGTTATTAAGGAGACCCTTCGCCTTTTTCCTTCTGTTCCTTTATTTGCCCGTAGTGTTAGTGAAGATTGTGAAGTGGCAGGTTACAGAGTTCTAAAAGGCACTGAAGCCGTCATCATTCCCTATGCATTGCACAGAGATCCGAGATACTTCCCCAACCCCGAGGAGTTCCAGCCTGAGCGGTTCTTCCCCGAGAATGCACAAGGGCGCCATCCATATGCCTACGTGCCCTTCTCTGCTGGCCCCAGGAACTGTATAGGTCAAAAGTTTGCTGTGATGGAAGAAAAGACCATTCTTTCGTGCATCCTGAGGCACTTTTGGATAGAATCCAACCAGAAAAGAGAAGAGCTTGGTCTAGAAGGACAGTTGATTCTTCGTCCAAGTAATGGCATCTGGATCAAGTTGAAGAGGAGAAATGCAGATGAACGCTAA(SEQ ID NO:1),
其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列:
MAGLWLGLVWQKLLLWGAASALSLAGASLVLSLLQRVASYARKWQQMRPIPTVARAYPLVGHALLMKPDGREFFQQIIEYTEEYRHMPLLKLWVGPVPMVALYNAENVEVILTSSKQIDKSSMYKFLEPWLGLGLLTSTGNKWRSRRKMLTPTFHFTILEDFLDIMNEQANILVKKLEKHINQEAFNCFFYITLCALDIICETAMGKNIGAQSNDDSEYVRAVYRMSEMIFRRIKMPWLWLDLWYLMFKEGWEHKKSLQILHTFTNSVIAERANEMNANEDCRGDGRGSAPSKNKRRAFLDLLLSVTDDEGNRLSHEDIREEVDTFMFEGHDTTAAAINWSLYLLGSNPEVQKKVDHELDDVFGKSDRPATVEDLKKLRYLECVIKETLRLFPSVPLFARSVSEDCEVAGYRVLKGTEAVIIPYALHRDPRYFPNPEEFQPERFFPENAQGRHPYAYVPFSAGPRNCIGQKFAVMEEKTILSCILRHFWIESNQKREELG LEGQLILRPSNGIWIKLKRRNADER(SEQ ID NO:2)。
发明人发现的CYP4V2基因突变体与SEQ ID NO:1相比,具有c.31C>T突变,即相对于野生型CYP4V2基因,本发明的CYP4V2基因突变体的cDNA第31位碱基C突变为T。由此,其所编码的产物与野生型的CYP4V2相比,具有p.Q11X突变,即该突变是由于c.31C>T突变而引起的,具体地,相对于野生型CYP4V2,本发明的分离的多肽(即CYP4V2突变体)第11位氨基酸由Gln(Q)突变为终止码,具体而言,本发明的分离的多肽具有如下所示的氨基酸序列:
MAGLWLGLVW(SEQ ID NO:23)。
已知,CYP4V2基因所编码全长19.28kp,包含11个外显子,编码产物为525个氨基酸的蛋白质,该蛋白属于CYP450家族,在脂肪酸代谢中发挥重要作用。目前,人们对于体内的CYP4V2基因的认知较少,也尚未见CYP4V2基因及其上的c.31C>T突变为原发性结晶样视网膜变性的致病突变的相关报道。
根据本发明的第二方面,本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例,与野生型CYP4V2相比,该分离的多肽具有p.Q11X突变,即该突变是由于c.31C>T突变而引起的,具体地,相对于野生型CYP4V2,本发明的分离的多肽(即CYP4V2突变体)第11位氨基酸由Gln(Q)突变为终止码。根据本发明的一些具体示例,该多肽是由前述分离的编码CYP4V2突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽,可以有效地检测生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性,也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在,可以有效地预测生物体是否易感原发性结晶样视网膜变性。
根据本发明的第三方面,本发明提出了一种筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法。根据本发明的实施例,该方法包括以下步骤:
从所述生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例,生物样品的类型并不受特别限制,只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品CYP4V2是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例,生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种,优选外周血。由此,可以方便地进行取样和检测,从而能够进一步提高筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的效率。根据本发明的实施例,这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解,其可以是任何能够反映生物样品中CYP4V2是否存在突变的样本,例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA,也可以是该全基因组中包含CYP4V2编码序列的一部分,可以是从生物样品中提取的总RNA,也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例,所述核酸样本为全基因组DNA。由此,可以扩大生物样品的来源范围,并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定,从而能够提高筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的效率。另外,根据本发明的实施例,针对采用RNA作为核酸样本,从生物样品提取核酸样本可以进一步包括:从生物样品提取RNA样本,优选RNA样本为mRNA;以及基于所得到的RNA样本,通过反转录反应,获得cDNA样本,所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此,可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的效率。
接下来,在得到核酸样本之后,可以对核酸样本进行分析,从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例,确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例,可以通过测序方法,确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例,可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例,可以采用第二代测序技术,也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例,可以利用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此,结合最新的测序技术,针对单个位点可以达到较高的测序深度,检测灵敏度和准确性大大提高,因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点,进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而,能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此,根据本发明的实施例,确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括:首先,针对所得到的核酸样本,构建核酸测序文库;以及对所得到的核酸测序文库进行测序,以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例,可以采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外,根据本发明的实施例,可以对核酸样本进行筛选,富集CYP4V2外显子,该筛选富集可以在构建测序文库之前,构建测序文库过程中,或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例,针对核酸样本,构建核酸测序文库进一步包括:利用CYP4V2外显子特异性引物,对核酸样本进行PCR扩增;以及针对所得到的扩增产物,构建核酸测序文库。由此,可以通过PCR扩增,富集CYP4V2外显子,从而能够进一步提高筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的效率。根据本发明的实施例,CYP4V2外显子特异性引物的序列不受特别限制,根据本发明的优选实施例,该CYP4V2外显子特异性引物具有SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列:
正向引物:5’-CAACCTCGCAGCACCCTCAGAA-3’(SEQ ID NO:3);
反向引物:5’-ACTTTGGGATGGGGCACTAGCAGT-3’(SEQ ID NO:4)。
发明人惊奇地发现,通过采用上述引物,可以在PCR反应体系中显著有效地完成对CYP4V2外显子的扩增。需要说明的是,这些SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后,意外获得的。
关于针对核酸样本,构建测序文库的方法和流程,本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择,关于流程的细节,可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程,例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361;Feb2010)或Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063;Feb2010),通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例,从生物样品提取核酸样本的方法和设备,也不受特别限制,可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。
需要说明的是,在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解,其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后,得到的完整的核酸序列信息,也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列,只要这些核酸序列中含有对应CYP4V2的编码序列即可。
最后,在确定核酸样本的核酸序列之后,将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有c.31C>T突变,则指示生物样品易感原发性结晶样视网膜变性。由此,通过根据本发明实施例的筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法,可以有效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品。根据本发明的实施例,对核酸序列与SEQ ID NO:1进行比对的方法和设备并不受特别限制,可以采用任意常规的软件进行操作,根据本发明的具体实例,可以采用SOAP软件进行比对。
需要说明的是,根据本发明实施例的“筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法”的用途不受特别限制,例如可以用作非诊断目的的筛选方法。
筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的系统和试剂盒
根据本发明的第四方面,本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法的系统。
参考图1,根据本发明的实施例,该筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的系统1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。
根据本发明的实施例,核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述,根据本发明的实施例,核酸样本的类型并不受特别限制,对于采用RNA作为核酸样本,则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102,其中,提取单元101用于从生物样品提取RNA样本,反转录单元102与RNA提取单元101相连,用于对RNA样本进行反转录反应,以便获得cDNA样本,所得到的cDNA样本构成核酸样本。
根据本发明的实施例,核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连,用于对核酸样本进行分析,以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示,可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此,根据本发明的一个实施例,所述核酸序列确定装置200可以进一步包括:文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本,构建核酸测序文库;测序单元202与文库构建单元201相连,用于对核酸测序文库进行测序,以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述,可以通过PCR扩增,富集CYP4V2外显子,进一步提高筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的效率。由此,文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块(图中未示出),在该PCR扩增模块中设置有CYP4V2外显子特异性引物,以便利用CYP4V2外显子特异性引物,对所述核酸样本进行PCR扩增,根据本发明的具体实施例,CYP4V2外显子特异性引物具有如SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例,测序单元202可以包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此,结合最新的测序技术,针对单个位点可以达到较高的测序深度,检测灵敏度和准确性大大提高,因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点,进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而,提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。
根据本发明的实施例,判断装置300与核酸序列确定装置200相连,适于将核酸样本的核酸序列进行比对,以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1的区别判断生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性。具体地,基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比,是否具有c.31C>T突变,判断生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性。如前所述,根据本发明的一个实施例,核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比,具有c.31C>T突变,是生物样品易感原发性结晶样视网膜变性的指示。如前所述,根据本发明的实施例,对核酸序列与SEQ ID NO:1进行比对的设备并不受特别限制,可以采用任意常规的软件进行操作,根据本发明的具体实例,可以采用SOAP软件进行比对。
由此,利用该系统,能够有效地实施前述筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法,从而可以有效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品。
根据本发明的第五方面,本发明提出了一种用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例,该用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的试剂盒包括:适于检测CYP4V2基因突变体的试剂,其中与SEQ ID NO:1相比,该CYP4V2基因突变体具有c.31C>T突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒,能够有效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品。在本文中,所使用的术语“适于检测CYP4V2基因突变体的试剂”应做广义理解,即可以是检测CYP4V2编码基因的试剂,也可以是检测CYP4V2突变体多肽的试剂,例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例,所述试剂为核酸探针或引物,优选地,所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列。由此,可以高效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品。
需要说明的是,在本文前面筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点,同样适用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的系统或者试剂盒,在此不再赘述。
构建体及重组细胞
根据本发明的第六方面,本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例,该构建体包含前面所述的分离的编码CYP4V2突变体的核酸,即本发明的CYP4V2基因突变体。由此,利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞,能够有效地用于筛选治疗原发性结晶样视网膜变性的药物。其中,所述受体细胞的种类不受特别限制,例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞,优选该受体细胞来源于哺乳动物。
在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体,其包含特定核酸序列,并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中,以获得重组细胞。根据本发明的实施例,构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例,其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种,优选质粒。质粒作为遗传载体,具有操作简单,可以携带较大片段的性质,便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制,既可以是环形质粒,也可以是线性质粒,即可以是单链的,也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物,包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA,其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体,优选所述核酸为DNA,因为DNA相对于RNA而言,其更稳定,并且易于操作。
根据本发明的第七方面,本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例,该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而,本发明的重组细胞能够表达构建体所携带的CYP4V2基因突变体。根据本发明的一些实施例,利用本发明的重组细胞,能够有效地筛选治疗原发性结晶样视网膜变性的药物。根据本发明的实施例,受体细胞的种类不受特别限制,例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞,优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1确定原发性结晶样视网膜变性(BCD)致病突变
1、样本收集
2010年,发明人在重庆收集到1例BCD患者,该患者的家系成员共4人,其中患者1人,正常成员3人。参与本发明研究的共4人,其中患者1人,正常成员(父亲,哥哥和弟弟)3人,所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书。该患者的家系图如图2所示,其中,□表示正常男性,■表示男性患者,表示已逝正常女性,M表示突变,+表示为野生型。
在该家系中,患者49岁出现夜盲,眼底检查表现为典型结晶样视网膜变性改变,图3显示了该BCD患者的眼底像。由图3可以看出,该患者双眼眼底视盘边界清楚,色蜡黄,视网膜血管变细,后极部及中周部视网膜可见骨细胞样色素沉着,视网膜色素上皮层弥漫性萎缩,后极部视网膜可见少量的结晶样颗粒沉积,脉络膜血管硬化,毛细血管萎缩。该家系中结晶样视网膜变性的表型表现为隐性遗传模式,患者的双亲未患病,是杂合携带者;双亲无病的子女不患病,符合常染色体完全隐性遗传特征。
2、目标区域捕获测序
发明人利用HISEQ2000、SOLiD、454或单分子测序装置,采用Sanger测序方法对先证者(图2中■所代表成员)的外显子组序列进行了测序。具体如下:
2.1DNA提取
采集图2所示患者家系中患者的外周血,利用DNA提取试剂盒从外周血样品中提取基因组DNA,并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度,所得各基因组DNA的OD260/OD280均应位于1.7-2.0之间,浓度不少于200纳克/微升,总量不少于30微克。
2.2目标区域捕获与测序
利用超声波仪将各基因组DNA样本随机打断成100~500bp左右的片段,随后按照制造商提供的操作说明书,在片段两端分别连接上接头制备文库(可参见:http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书,通过参照将其全文并入本文)。文库经纯化后经过PCR扩增与捕获试剂SureSelect Biotiny lated RNA Library(BAITS)进行杂交富集,再经过PCR扩增,文库检测合格后即可上机测序,以便获得原始测序数据。其中,测序平台为HiSeq,读取长度为35~100bp,各样本的平均测序深度最少为50×。
3、变异检测、注释及数据库比较
利用Illumina basecalling Software1.7对上述获得的原始测序数据进行处理,经过过滤去污染后,使用SOAPaligner/SOAP2(可参见:Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:shortoligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008,24(5):713-714;Li R,Yu C,Li Y,ea al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics2009,25(15):1966-1967,通过参照将其全文并入本文)比对到UCSC人类参考基因组(hg19,build37.1,http://genome.ucsc.edu/),以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见:Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNP detection for massively parallelwhole-genome resequencing.Genome Res2009,19(6):1124-1132,通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型,获得患者的单核苷酸多态性(SNPs)和插入/缺失测序结果。
随后通过dbSNP数据库(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp135.txt.gz.)、HapMap数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)、千人基因组数据库(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)、炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)等公共数据库的过滤,去掉上述获得的测序结果中的同义突变、非编码区的变异,以及所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异,并利用SIFT软件进行SNP功能预测,最终得到3个可能具有致病意义的de novo SNP位点。
对上述3个de novo SNP位点在家系成员中和正常人群对照组基因组DNA中进行扫描,最终确定CYP4V2基因c.31C>T杂合突变导致CYP4V2蛋白发生p.Q11X无义突变,此基因突变在该常染色体隐性遗传结晶样视网膜变性家系中与疾病表型共分离,并在正常对照人群中未检出该突变。综上推测,CYP4V2基因c.31C>T,p.Q11X是BCD的致病突变。
实施例2:Sanger法测序验证
针对CYP4V2基因(外显子1-11)序列设计引物,通过PCR扩增,产物纯化,测序的方法获得有关序列。具体操作如下:
1.DNA提取
采集BCD家系中的先证者(图2中■所代表成员)外周血,利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA,利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度,所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间,浓度不少于200纳克/微升,总量不少于30微克。
2.引物设计
PCR反应引物设计参考人类基因组序列,具体见下表1:
表1
接着,分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应:PCR反应体系:
体系组成 | 体积 |
DNA模板(20纳克/微升) | 1微升 |
2×GC缓冲液Ⅰ(加入了Mg2+) | 2.5微升 |
2mM dNTP | 2微升 |
LA Taq酶(5U/微升) | 0.25微升 |
引物(100纳克/微升)正/反向 | 各1微升 |
去离子水 | 加至25微升 |
反应条件:
由此,获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。
3.测序
利用HISEQ2000、SOLiD、454或单分子测序装置,采用Sanger测序方法,将步骤2中获得的基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。
基于测序结果,并进一步结合CYP4V2p.Q11X蛋白结构分析,提示上述突变位于CYP4V2基因外显子1上,由于外显子1上编码碱基显示终止码,故导致从外显子1到外显子12之间的结构缺失,蛋白无翻译从而导致蛋白酶无活性。由此,表明CYP4V2基因为BCD的致病基因。
实施例3:Sanger法测序验证
分别对实施例1中所述的BCD患者家系中的所有家系成员(包括患者及家系内正常人)以及100名家系外正常人的CYP4V2基因进行检测:利用实施例2中针对CYP4V2基因外显子1设计的引物,通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列,根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型,验证CYP4V2基因及该突变与BCD之间的相关性。
具体方法步骤如下:
1.DNA提取
按照实施例2中所述的提取DNA的方法,分别提取制备受试者外周静脉血中的基因组DNA,备用。
2、PCR反应
利用实施例2中针对CYP4V2基因外显子1设计的引物和PCR条件,进行PCR反应。由此,获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。
3、测序
利用HISEQ2000、SOLiD、454或单分子测序装置,将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行Sanger法测序验证。家系中先证者、家系内正常人和家系外正常对照的CYP4V2基因c.31C>T突变位点的代表性Sanger测序验证峰图如图4所示。
由图4可知,CYP4V2基因野生型为31C/C纯合型,突变型为31T/T纯合型,突变导致CYP4V2蛋白的11位谷氨酰胺改变为提前终止码。此外,通过验证发现CYP4V2,c.31C>T杂合突变在家系中不表现为疾病表型共分离,即患者均携带该纯合突变(2个等位基因),而未受累的家族成员父亲携带1个等位基因突变,先证者哥哥和弟弟均未携带任何等位基因突变。同时,发明人在100个与该BCD家无亲缘关系的正常对照中排查均未发现该突变位点。
由此,进一步证明CYP4V2基因为BCD的致病基因,CYP4V2基因的c.31C>T突变为BCD的致病突变。
实施例4:CYP4V2p.Q11物种保守性分析
利用NCBI数据库对CYP4V2基因的物种同源性进行比较(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=Retrieve&db=homologene&dopt=MultipleAlignment&list_uids=5859),结果见图5。图5显示了多个物种CYP4V2蛋白的序列对比结果。由图5可知,CYP4V2p.Q11在哺乳动物中高度保守,表明CYP4V2蛋白的11位谷氨酰胺在物种间是保守的。由此,进一步表明CYP4V2基因的c.31C>T突变为BCD的致病突变。
实施例5:检测试剂盒
制备一检测试剂盒,其包含能够检测CYP4V2基因的c.31C>T突变的引物,用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品,其中这些引物为CYP4V2基因外显子特异性引物,其序列如实施例2中所述SEQ ID NO:3-4所示。
利用上述试剂盒筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的具体步骤为:按照实施例2的步骤1所述的方法提取待测者DNA,以所提取的DNA为模板与上述CYP4V2基因的外显子特异性引物进行PCR反应,并按照本领域常规方法对PCR产物纯化,将纯化的产物进行测序,然后通过观察测序所得到的序列是否具有c.31C>T突变,能够有效地检测本发明的CYP4V2基因突变体在待测者DNA中是否存在,从而能够有效地检测待测者是否易感原发性结晶样视网膜变性,进一步,能够从待测者中筛选出易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种分离的编码CYP4V2突变体的核酸,其特征在于,所述核酸与SEQ ID NO:1相比,具有c.31C>T突变,
任选地,所述核酸为DNA。
2.一种分离的多肽,其特征在于,与SEQ ID NO:2相比,所述分离的多肽具有p.Q11X突变,
任选地,所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。
3.一种筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法,其特征在于,包括以下步骤:
从所述生物样品提取核酸样本;
确定所述核酸样本的核酸序列;
所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比,具有c.31C>T突变是所述生物样品易感原发性结晶样视网膜变性的指示,
任选地,所述生物样本为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种,
任选地,所述核酸样本为全基因组DNA。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,从所述生物样品提取核酸样本进一步包括:
从所述生物样品提取RNA样本,优选所述RNA样本为mRNA;以及
基于所述RNA样本,通过反转录反应,获得cDNA样本,所述cDNA样本构成所述核酸样本。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,确定所述核酸样本的核酸序列进一步包括:
针对所述核酸样本,构建核酸测序文库;以及
对所述核酸测序文库进行测序,以便获得由多个测序数据构成的测序结果,
任选地,采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所述核酸测序文库进行测序,
任选地,针对所述核酸样本,构建核酸测序文库进一步包括:
利用CYP4V2基因外显子特异性引物,对所述核酸样本进行PCR扩增;以及
针对所得到的扩增产物,构建所述核酸测序文库,
任选地,所述特异性引物具有如SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列。
6.一种筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的系统,其特征在于,包括:
核酸提取装置,所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本;
核酸序列确定装置,所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连,用于对所述核酸样本进行分析,以便确定所述核酸样本的核酸序列;
判断装置,所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连,以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比,是否具有c.31C>T突变,判断所述生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性,
任选地,所述核酸提取装置进一步包括:
RNA提取单元,所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本;以及
反转录单元,所述反转录单元与所述RNA提取单元相连,用于对所述RNA样本进行反转录反应,以便获得cDNA样本,所述cDNA样本构成所述核酸样本。
7.根据权利要求6所述的系统,其特征在于,所述核酸序列确定装置进一步包括:
文库构建单元,所述文库构建单元用于针对所述核酸样本,构建核酸测序文库;以及
测序单元,所述测序单元与所述文库构建单元相连,用于对所述核酸测序文库进行测序,以便获得由多个测序数据构成的测序结果,
任选地,所述文库构建单元进一步包括:
PCR扩增模块,所述PCR扩增模块中设置有CYP4V2基因外显子特异性引物,以便利用所述特异性引物,对所述核酸样本进行PCR扩增,
任选地,所述特异性引物具有如SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列,
任选地,所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。
8.一种用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的试剂盒,其特征在于,含有:
适于检测CYP4V2基因突变体的试剂,其中与SEQ ID NO:1相比,所述CYP4V2基因突变体具有c.31C>T突变,
任选地,所述试剂为核酸探针或引物,
任选地,所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列。
9.一种构建体,其特征在于,包含权利要求1所述的分离的编码CYP4V2突变体的核酸。
10.一种重组细胞,其特征在于,所述重组细胞是通过权利要求9所述的构建体转化受体细胞而获得的。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310751725.XA CN104745592B (zh) | 2013-12-31 | 2013-12-31 | Cyp4v2基因突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310751725.XA CN104745592B (zh) | 2013-12-31 | 2013-12-31 | Cyp4v2基因突变体及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104745592A true CN104745592A (zh) | 2015-07-01 |
CN104745592B CN104745592B (zh) | 2020-02-21 |
Family
ID=53585851
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310751725.XA Expired - Fee Related CN104745592B (zh) | 2013-12-31 | 2013-12-31 | Cyp4v2基因突变体及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104745592B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109136266A (zh) * | 2018-08-10 | 2019-01-04 | 深圳泓熙生物科技发展有限公司 | 用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性的基因载体及其用途 |
WO2019025984A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Reflection Biotechnologies Limited | CELLULAR MODELS AND THERAPIES FOR OCULAR DISEASES |
CN113015804A (zh) * | 2020-10-13 | 2021-06-22 | 北京中因科技有限公司 | 用于治疗结晶样视网膜变性的核酸分子及其用途 |
CN113106124A (zh) * | 2020-06-09 | 2021-07-13 | 北京中因科技有限公司 | 表达cyp4v2的aav载体及其用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006037993A3 (en) * | 2004-10-02 | 2006-06-15 | Auvation Ltd | Cancer markers |
CN103198236A (zh) * | 2012-01-06 | 2013-07-10 | 深圳华大基因科技有限公司 | Cyp450基因型别数据库及基因分型、酶活性鉴定方法 |
-
2013
- 2013-12-31 CN CN201310751725.XA patent/CN104745592B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006037993A3 (en) * | 2004-10-02 | 2006-06-15 | Auvation Ltd | Cancer markers |
CN103198236A (zh) * | 2012-01-06 | 2013-07-10 | 深圳华大基因科技有限公司 | Cyp450基因型别数据库及基因分型、酶活性鉴定方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
LIN J.等: "Recessive mutations in the CYP4V2 gene in East Asian and Middle Eastern patients with Bietti crystalline corneoretinal dystrophy", 《J MED GENET》 * |
NCBI: "rs1232415716", 《REFERENCE SNP (RS) REPORT》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019025984A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Reflection Biotechnologies Limited | CELLULAR MODELS AND THERAPIES FOR OCULAR DISEASES |
CN109136266A (zh) * | 2018-08-10 | 2019-01-04 | 深圳泓熙生物科技发展有限公司 | 用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性的基因载体及其用途 |
CN109136266B (zh) * | 2018-08-10 | 2022-02-18 | 深圳泓熙生物科技发展有限公司 | 用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性的基因载体及其用途 |
CN113106124A (zh) * | 2020-06-09 | 2021-07-13 | 北京中因科技有限公司 | 表达cyp4v2的aav载体及其用途 |
CN113015804A (zh) * | 2020-10-13 | 2021-06-22 | 北京中因科技有限公司 | 用于治疗结晶样视网膜变性的核酸分子及其用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104745592B (zh) | 2020-02-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104120132A (zh) | Fbn1基因突变体及其应用 | |
CN103374575B (zh) | Cyp4v2基因突变体及其应用 | |
CN103571847A (zh) | Foxc1基因突变体及其应用 | |
CN104745592A (zh) | Cyp4v2基因突变体及其应用 | |
CN106282195A (zh) | 基因突变体及其应用 | |
CN103361373B (zh) | Snrnp200基因突变体及其应用 | |
CN103374574B (zh) | Cyp4v2基因突变体及其应用 | |
WO2017107545A1 (zh) | Scap基因突变体及其应用 | |
CN103834673B (zh) | Ext1基因突变体及其应用 | |
CN104745594A (zh) | Cyp4v2基因突变体及其应用 | |
CN103275987B (zh) | Aqp5基因突变体及其应用 | |
CN105838720B (zh) | Ptprq基因突变体及其应用 | |
CN104178487A (zh) | Atm基因突变体及其应用 | |
CN104099338B (zh) | Myo15a基因突变体及其应用 | |
CN104745591A (zh) | Cyp4v2基因突变体及其应用 | |
CN104073499B (zh) | Tmc1基因突变体及其应用 | |
CN104164424A (zh) | Cc2d2a基因突变体及其应用 | |
CN112226440B (zh) | 一种遗传性原发不孕的致病突变及其检测试剂 | |
CN109943569A (zh) | 分离的编码ifnlr1突变体的核酸及其应用 | |
CN110878346B (zh) | 基因突变体及其应用 | |
CN104774840A (zh) | 基因突变体及其应用 | |
CN105802974B (zh) | Bcs1l基因突变体及其应用 | |
CN104178489B (zh) | Aagab基因突变体及其应用 | |
CN104561015A (zh) | Myl4基因突变体及其应用 | |
CN109022444B (zh) | Ttc21b基因突变体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200221 Termination date: 20201231 |