CN106011298A - 一种ApoE试剂盒、引物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ApoE试剂盒、引物及其用途，两个SNP位点是否具有已知突变的测定方法。其中，该方法包括：利用第一引物和第二引物对核酸样本进行PCR扩增，并且在PCR扩增体系中加入核酸探针，核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列；检测反应体系的发光，以便确定核酸样本的预定位点是否存在已知突变，第一引物的近3’端包含与两个预定位点之一已知突变对应的碱基，第二引物的近3’端包含与另一个已知突变对应的碱基，核酸探针具有：发光基团，发光基团形成于核酸探针的5’端，调节基团，调节基团形成于核酸探针的3’端，并且调节基团可以调节发光基团的发光。利用该方法能够有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变。
Description
技术领域
本发明涉及一种ApoE试剂盒、引物及其用途，两个SNP位点是否具有已知突变的测定。具体涉及一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物，属于生物学领域。
背景技术
ApoE是一种载脂蛋白，其遗传多态性主要受控于两个SNP位点rs429358和rs7412，这两个SNP位点通过不同的核酸组合决定了ApoE的三种等位基因型：ε2(rs429358为T，rs7412为T)、ε3(rs429358为T，rs7412为C)、ε4(rs429358为C，rs7412为C),这三种类型等位基因分别编码三种ApoE蛋白亚型，即ApoE2(其蛋白序列的112位和158位均为半胱氨酸)、ApoE3(其蛋白序列的112位为半胱氨酸，158位为精氨酸)、ApoE4(其蛋白序列的112位和158位均为精氨酸)。
因此，ApoE基因有ε2/ε2、ε3/ε3、和ε4/ε4三种纯合子型与ε2/ε3、ε2/ε4和ε3/ε4三种杂合子型。
目前ApoE基因分型的方法主要有：传统DNA测序法、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法、聚合酶链反应-单链构象多态性法、聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性法、多重扩增受阻突变体系PCR技术法、高分辨率溶解曲线法以及双色荧光分子探针法等。
然而，目前确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，仍有待改进。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种ApoE试剂盒、引物及其用途，两个SNP位点是否具有已知突变的测定，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了可以有效确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
在本发明的第一个方面，一种ApoE试剂盒，其特征在于，包括：
第一引物，所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基，
第二引物，所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基，
核酸探针，所述核酸探针与两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列，并且所述核酸探针具有：
发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5’端，
调节基团，所述调节基团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光，
其中，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412，
其中，所述述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基，
其中，所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基，
其中，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物，
其中，所述第一引物包括：
5’-CGGACATGGAGGACGTGT-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGAGT-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3’
5’-CGGACATGGAGGACGAGC-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGTGC-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’，
所述第二引物包括：
5’-TGGTACACTGCCAGGTA-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGTCA-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’
5’-TGGTACACTGCCAGGCG-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGGTG-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3’，
其中，所述核酸探针的长度为20个核苷酸。
其中，所述核酸探针的序列为：5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3’。
进一步，所述核酸探针的发光基团为荧光基团，所述荧光基团为FAM，所述调节基团为淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1。
三种基因的阳性质粒用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH8.0)进行稀释，得到2400拷贝/μl、240拷贝/μl和24拷贝/μl的，并对这些样本进行检测，95％(n≥20)的阳性率作为最低检测限的标准，
浓度为2400拷贝/μl和浓度为240拷贝/μl阳性质粒阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％；
浓度为24拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，ε2、ε3和ε4检测试剂分别有16、18和14个可检出结果，检出率分别为80％、90％和70％；
所述试剂盒检测最低检出限为240拷贝/μl，换算成基因组DNA的量为0.8ng/μl，即4ng/反应；
APOE基因检测试剂能够耐受总量为6*104拷贝/反应的其它亚型的DNA，根据阳性质控品的大小，换算成基因组DNA的量为200ng/反应。
根据本发明的实施例，所述试剂盒可以应用于前面所述的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的试剂盒对核酸样本进行检测，可以有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，并进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型，对于阿尔茨海默症和心脑血管疾病的预防以及早期诊断具有非常重要的意义。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法所描述的特征和优点，也当然地适用该试剂盒，不再赘述。
本发明的第二方面，本发明提出了一组确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的PCR引物。
一种ApoE试剂盒的引物，其特征在于，所述引物包括：
第一引物，所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基，
第二引物，所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基，
所述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基，
所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基，
所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物，
其中，所述第一引物包括：
5’-CGGACATGGAGGACGTGT-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGAGT-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3’
5’-CGGACATGGAGGACGAGC-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGTGC-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’，
所述第二引物包括：
5’-TGGTACACTGCCAGGTA-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGTCA-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’
5’-TGGTACACTGCCAGGCG-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGGTG-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3’。
根据本发明的实施例，所述PCR引物可以应用于前面所述的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法以及试剂盒。由此，PCR扩增过程中引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可以按照预定方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增出不同等位基因。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法及试剂盒所用引物的描述的特征和优点，也当然地适用该PCR引物，不再赘述。
在本发明的又一个方面，一种ApoE试剂盒的用途，其特征在于，用于确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变。
其中，所述确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，包括以下步骤：
a.引物设计：
b.荧光DNA分子探针设计：
c.PCR反应体系配制：
d.PCR反应体系配制：
利用第一引物和第二引物对所述核酸样本进行PCR扩增，并且在所述PCR扩增体系中加入核酸探针，所述核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分的核酸序列；以及
e.检测反应体系的发光，
f.数据分析与结论:
以便确定所述核酸样本的预定位点是否存在已知突变。
进一步，所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基，
所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基，
所述第一引物和第二引物之一作为正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另一个作为反向引物，
所述核酸探针具有：
发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5’端，
调节基团，所述调节基团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光，
其中，所述核酸样本来源于人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞，
其中，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412，
其中，所述述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基，
其中，所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基，
其中，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物，
其中，所述第一引物包括：
5’-CGGACATGGAGGACGTGT-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGAGT-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3’
5’-CGGACATGGAGGACGAGC-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGTGC-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’，
所述第二引物包括：
5’-TGGTACACTGCCAGGTA-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGTCA-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’
5’-TGGTACACTGCCAGGCG-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGGTG-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3’，
其中，所述核酸探针的长度为20个核苷酸。
进一步，所述核酸探针的序列为：5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3’。
更进一步，所述核酸探针的发光基团为荧光基团，所述荧光基团为FAM，所述调节基团为淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1。
根据本发明实施例的方法，能够通过检测PCR扩增体系所产生的荧光，有效地确定所检测的核酸样本的两个预定位点同时存在相应的已知突变，并进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型，对于阿尔茨海默症及心脑血管等与ApoE基因型相关疾病的预防、早期诊断以及疾病预后具有非常重要的意义。
根据本发明的一些实施例，上述确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例，所述核酸样本来源于重组核酸或转基因生物组织细胞，根据本发明的实施例，可以对上述来源的核酸样本进行有效地确定突变类型，从而可以对提供核酸样本的个体进行有效地分析。
根据本发明的一个实施例，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412。由此，利用根据本发明实施例，可以有效地确定核酸样本中在两个预定位点SNP rs429358和rs7412是否具有已知突变，从而可以有效地确定ApoE等位基因分型。
根据本发明的一个实施例，所述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基。由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法对核酸样本进行检测，在PCR反应时引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，从而可以特异地扩增出ApoE的不同等位基因，并进一步可以有效地确定ApoE等位基因的类型。
由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法对核酸样本进行检测，在PCR反应过程中，引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，从而可以特异地扩增出ApoE的不同等位基因，并进一步可以有效地确定ApoE等位基因的类型。
由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法对核酸样本进行检测，通过检测各基因型对应的扩增体系中有无荧光信号，即可判断待测样品中是否含有该亚型的ApoE基因。
本发明的有益效果：
根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法可以实现下列优点至少之一：
1、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，该方法操作简便，仅需PCR扩增和荧光检测两个步骤，减少了实验步骤，避免交叉污染；
2、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，该方法容易实现自动化操作，可以大大减小手工操作过程中的人为误差，使得到的结果更加准确；
3、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，该方法快速省时，完成整个检测的时间不到1.5小时，耗时少于现有的方法；
4、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，该方法的成本较低，仅需一个荧光探针和常规PCR体系即可；
5、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，该方法的检测结果直观，根据实验结果可以直接读出待测样本的ApoE基因型，无需繁琐的分析过程。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的不同引物对ApoE不同等位基因特异性扩增原理示意图，在该图中，1表示含SNPrs42358和rs7412的ApoE基因DNA片段示意图；
图2是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的ApoE基因PCR扩增体系示意图，在该图中，1表示ApoE基因DNA模板反义链，2表示正向扩增引物，3表示偶联有荧光基团(F)和淬灭基团(Q)的DNA分子探针，4表示ApoE基因DNA模板正义链，5表示反向扩增引物，6表示DNA聚合酶；
图3是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的荧光探针工作原理示意图，在该图中，1表示ApoE基因DNA模板反义链，2表示正向扩增引物，3表示荧光基团(F)脱离的DNA分子探针，4表示ApoE基因DNA模板正义链，5表示反向扩增引物，6表示DNA聚合酶；
图4是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的实例样品检测荧光信号读值的柱型分析图。
图5ε2检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。阴性结果■阳性结果，ε2阳性质粒，浓度为2400拷贝/μl。
图6ε2检测试剂中加入浓度为240拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。阴性结果■阳性结果,ε2阳性质粒，浓度为240拷贝/μl。
图7ε2检测试剂中加入浓度为24拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，16个可检出结果，检出率为80％。阴性结果■阳性结果，ε2阳性质粒，浓度为24拷贝/μl。
图8ε3检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。阴性结果■阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为2400拷贝/μl。
图9ε3检测试剂中加入浓度为240拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。阴性结果■阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为240拷贝/μl。
图10ε3检测试剂中加入浓度为24拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，18个可检出结果，检出率为90％。阴性结果■阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为24拷贝/μl。
图11ε4检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。阴性结果■阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为2400拷贝/μl。
图12ε4检测试剂中加入浓度为240拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。阴性结果■阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为240拷贝/μl。
图13ε4检测试剂中加入浓度为24拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，14个可检出结果，检出率为70％。阴性结果■阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为24拷贝/μl。
图14 APOEε2基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果。■ε2阳性质控品ε3阳性质控品■ε4阳性质控品。
图15 APOEε3基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果，结果如图15所示。■ε2阳性质控品ε3阳性质控品■ε4阳性质控品。
图16 APOEε4基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果，结果如图16所示。■ε2阳性质控品ε3阳性质控品■ε4阳性质控品。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。根据本发明的实施例，确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法可以包括以下步骤：
S100：利用第一引物和第二引物对核酸样本进行PCR扩增，并且在PCR扩增体系中加入核酸探针
在该步骤中，针对核酸样本的两个预定位点之一的核酸序列设计一条PCR引物：第一引物，针对核酸样本的两个预定位点另一个预定位点的核酸序列设计一条PCR引物：第二引物，并且加入核酸探针，然后对核酸样本进行PCR扩增。由此，获得PCR扩增样本，以便进一步对其进行荧光检测。
发明人发现，在PCR扩增时，如果第一引物的近3’端包含与核酸样本的两个预定位点之一的已知突变对应的碱基，第二引物的近3’端包含与核酸样本的另一个预定位点的已知突变对应的碱基，以及第一引物和第二引物之一作为正向引物，第一引物和所述第二引物的另一个作为反向引物，则在PCR扩增时引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可以按照预定方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增出不同等位基因。
根据本发明的实施例，第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基。根据本发明的实施例，第一引物作为正向引物，第二引物作为反向引物。根据本发明的实施例，
其中，所述第一引物包括：
5’-CGGACATGGAGGACGTGT-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGAGT-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3’
5’-CGGACATGGAGGACGAGC-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGTGC-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’，
所述第二引物包括：
5’-TGGTACACTGCCAGGTA-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGTCA-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’
5’-TGGTACACTGCCAGGCG-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGGTG-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3’。
由此，PCR扩增时引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可以按照预定5’到3’方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增出不同等位基因。
根据本发明的具体实施例，针对SNP rs429358为T或C的核酸序列分别设计一条PCR正向引物(以下称为p112T或p112C)，针对SNP rs7412为T或C的核酸序列分别设计一条PCR反向引物(以下称为p158T或p158C)。根据ApoE基因型的区别可得知，ApoE不同基因型SNP rs429358和rs7412之间的核酸序列可由如下引物对在PCR反应中特异扩增：引物p112T和p158T能够特异扩增ε2型基因，引物p112T和p158C能够特异地扩增ε3型基因，以及引物p112C和p158C能够特异地扩增ε4型基因。由此，PCR能够特异地扩增出不同等位基因，从而可以有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，进一步可以有效地确定核酸样本中ApoE等位基因的类型。
在该步骤中，针对核酸样本的两个预定位点之间的核酸序列设计一段具有特异性的核酸荧光探针，核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列。
发明人发现，如果核酸探针具有：发光基团，发光基团形成于所述核酸探针的5’端，调节基团，调节基团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光，则当含有核酸探针对应核酸序列被PCR扩增时，探针能够特异结合到扩增模板上，此时核酸聚合酶的外切酶活性能够切下探针5’端基团，使发光基团和调节基团分离，从而发出可检测的信号。
根据本发明的具体实施例，核酸探针的发光基团为荧光基团，优选荧光基团为FAM。根据本发明的实施例，核酸探针的调节基团为荧光基团，优选调节基团为BHQ1。根据本发明的实施例，核酸探针的长度不受特别限制，例如，核酸探针的长度可以为20个核苷酸。根据本发明的具体实施例，针对SNP rs429358和rs7412之间的核酸序列设计一段具有特异性的核酸荧光探针。根据本发明的一个实施例，核酸探针的序列为5’FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ1 3’。由此，当检测核酸样本的ApoE基因型时，仅需在PCR扩增体系中加入按上述方法设计的核酸荧光探针，利用ε2/ε3/ε4基因型各自对应的不同引物分别PCR扩增待测DNA模板。PCR反应结束后，检测各反应孔的扩增情况，即可判断待测核酸样本中的ApoE基因。
根据本发明的实施例，核酸样本的类型及来源并不受特别限制，例如，可以是人基因组DNA的至少一部分，可以来源于任何人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞。由此，利用根据本发明实施例的方法，可以有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型，对于阿尔茨海默症和心脑血管疾病的预防以及早期诊断具有非常重要的意义。
在本发明中所使用的术语“核酸样本”的含义是指在任何涉及人基因组DNA的至少一部分，检测的核酸样本可以来源于任何人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞。在本发明中，除非特别说明，“第一与、第二”仅是为了便于描述本发明，不能理解为对本发明的限制。在本发明中，除非特别说明，“近3'端”指的是，距离3'末端的碱基为预定范围以内的碱基，例如距离10个，9个，8个，7个，6个，5个，4个，3个，2个，1个或者0个(即3'末端)。
S200：检测反应体系的发光，以便确定核酸样本的预定位点是否存在已知突变
在该步骤中，对步骤S100中所得到的PCR扩增样本进行荧光检测，在荧光检测时，根据PCR扩增体系中有无荧光信号即可定性判断待测核酸样本中是否具有该PCR扩增体系引物对所对应的ApoE等位基因分型。由此，可以确定核酸样本的预定位点是否存在已知突变，并进一步可以有效地确定ApoE等位基因的类型。
根据本发明的具体实施例，对人体基因组DNA的PCR扩增样本进行荧光检测，如果仅在ε2扩增体系中检测到荧光信号，则该样品来源的待测人ApoE基因型为ε2/ε2；同理如果仅在ε3(或ε4)扩增体系中检测到荧光信号，则该样品来源的待测人ApoE基因型为ε3/ε3(或ε4/ε4)；如果同时在ε2和ε3扩增体系中检测到荧光信号，则该样品来源的待测人ApoE基因型为ε2/ε3；同理如果同时在ε2和ε4扩增体系中检测到荧光信号，则该样品来源的待测人ApoE基因型为ε2/ε4；同理如果同时在ε2和ε4(或ε3和ε4)扩增体系中检测到荧光信号，则该样本来源的待测人ApoE基因型为ε2/ε4(或ε3/ε4)。由此，可以有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型，对于阿尔茨海默症和心脑血管疾病的预防、早期诊断以及疾病预后具有非常重要的意义。
根据本发明的实施例，PCR扩增及荧光检测的手段并不受特别限制，可以借助任何已知的方法与设备来进行PCR扩增及荧光检测。例如根据本发明的具体实施例，利用美国Applied Biosystems公司的7500Fast Real-Time PCR system和Roche公司的LightCycler480，可以将PCR热循环、荧光检测及各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况，PCR实验结束后可以马上得到结果，无需凝胶电泳分析，无需纯化PCR产物，具有时间省、灵敏度高、准确性好等优点，再例如，相关技术人员可以根据具体实际需要的不同，对引物以及PCR温度等进行相应的调整，在此不再赘述，这些均在本发明的权利保护范围之内。
在本发明的又一个方面，本发明提出了一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的试剂盒。根据本发明的具体实施例，该试剂盒可以应用于前面所述的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的试剂盒对核酸样本进行检测，可以有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，并进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法所描述的特征和优点，也当然地适用该试剂盒，不再赘述
在本发明的又一个方面，本发明提出了一组确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的PCR引物。根据本发明的具体实施例，该引物可以应用于前面所述的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法以及试剂盒。由此，PCR扩增过程中引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可以按照预定方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增出不同等位基因。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法及试剂盒所用引物的描述的特征和优点，也当然地适用该PCR引物，不再赘述。
本法明的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒及引物可以应用在阿尔茨海默症以及心脑血管等疾病的预防以及早期诊断方面，相关技术人员当然也可以将其扩大至其它其应用领域，在此不予赘述，这些均在本发明的权利保护范围之内。
下面通过具体的实施例，对本发明进行说明，需要说明的是这些实施例仅仅是为了说明目的，而不能以任何方式解释成对本发明的限制。另外，在下列实施例中如果没有特别说明，则所采用的设备和材料均为市售可得的。
一般方法：
1材料与试剂：
1)DNA引物p112T：5’-GCGGACATGGAGGACGTGT-3’,Tm＝59.5℃,GC含量＝63.2％，5.6nM/OD/管，加无菌去离子水55.6μl配制成100μM反应液，于4℃储藏；5’-CGGACATGGAGGACGTGT-3’，Tm＝57.2℃,GC含量＝61.1％，5.9nM/OD/管，加无菌去离子水58.9μl配制成100μM反应液，于4℃储藏。引物均合成于英潍捷基(上海)贸易有限公司，纯化方式为:PAGE纯化。
2)DNA引物p112C：5’-CGGACATGGAGGACGTGC-3’，Tm＝59.5℃,GC含量＝66.7％，5.9nM/OD/管，加无菌去离子水59μl配制成100μM反应液，于4℃储藏。引物均合成于上海博尚生物技术有限公司，纯化方式为:PAGE纯化。
3)DNA引物p158T：5’-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’，Tm＝59.5℃,GC含量＝63.2％，5.7nM/OD/管，加无菌去离子水57.2μl配制成100μM反应液，于4℃储藏。引物均合成于上海博尚生物技术有限公司，纯化方式为:PAGE纯化。
4)DNA引物p158C：5’-CTGGTACACTGCCAGGCG-3’，Tm＝59.5℃,GC含量＝66.7％，6nM/OD/管，加无菌去离子水60μl配制成100μM反应液，于4℃储藏。引物均合成于上海博尚生物技术有限公司，纯化方式为:PAGE纯化。
5)荧光DNA分子探针：5’FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’，Tm＝65℃,GC含量＝70％，5.1nM/OD/管，加无菌去离子水51μl配制成100μM反应液，于4℃避光储藏。荧光DNA分子探针合成于英潍捷基(上海)贸易有限公司，纯化方式为:HPLC纯化。
6)PCR预混液：购于美国Applied Biosystems公司的TaqMan Genotyping MasterMix(包括DNA聚合酶，dNTPs，ROX参比荧光)，ROX参比荧光在PCR反应中不会加入扩增，它作为荧光内参能够矫正在PCR反应中由于浓度和体积改变引起的荧光信号变化。
7)无菌去离子水：去离子水取自英国ELGA纯水仪(型号purelab 3000)，并经高压蒸汽灭菌后所得。
8)1.5ml离心管：购于美国Axygen公司。
9)PCR板：Optical 96-Well Reaction Plate购于美国AppliedBiosystems公司。
10)PCR封板膜：96-Well Optical Adhesive Film购于美国AppliedBiosystems公司。
11)一次性医用无菌注射器：一次性医用无菌注射器(5ml规格)购于河南新乡市宇安医用卫材有限公司。
12)人血液基因组DNA提取相关试剂：
a、红细胞裂解液：称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.3g加水溶解并稀释至500ml，0.22m滤膜(购于美国Millipore公司)过滤除菌，于4℃保存；
b、Nuclei Lysis Solution(购于美国Promega公司)；
c、Precipitation Solution(购于美国Promega公司)。
13)ε2/ε2DNA已知样本：从ε2/ε2基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。
14)ε3/ε3DNA已知样本：从ε3/ε3基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。
15)ε4/ε4DNA已知样本：从ε4/ε4基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。
16)ε2/ε3DNA已知样本：从ε2/ε3基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。
17)ε2/ε4DNA已知样本：从ε2/ε4基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。
16)ε3/ε4DNA已知样本：从ε3/ε4基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。
2仪器与设备：
1)移液器：微量移液器(10μl,20μl,100μl,1000μl)购于德国Eppendorf公司。
2)离心机：小型高速离心机(型号：5424)，购于德国Eppendorf公司。
3)离心机：Universal 32R型控温高速离心机，购于德国Hettich zentrifugen公司。
4)涡旋混合器：购于江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司。
5)全波长扫描式多功能读数仪：Thermo Scientific Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪，购于Thermo Scientific公司。
6)Real-Time PCR仪器：7500Fast Real-Time PCR system，购于美国AppliedBiosystems公司；LightCycler 480，购于Roche公司。
7)分析软件：7500software V2.0.6，购于美国Applied Biosystems公司；Lightcycler 480Software，购于Roche公司。
在下列实施例中(详细见下面的实施例1-3)，确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的步骤如下：
1引物设计：
ApoE基因的DNA序列由美国国家生物科技信息中心(NCBI)网站提供，根据包含ApoE基因多态性位点SNP rs429358和SNP rs7412的DNA序列信息，对引物进行如下设计:
1)针对SNP rs429358位点核酸形式为T的正向PCR扩增引物(p112T),其DNA序列为：5’-GCGGACATGGAGGACGTGT-3’和5’-CGGACATGGAGGACGTGT-3’；
2)针对SNP rs429358位点核酸形式为C的正向PCR扩增引物(p112C),其DNA序列为：5’-CGGACATGGAGGACGTGC-3’；
3)针对SNP rs7412位点核酸形式为T的反向PCR扩增引物(p158T),其DNA序列为：5’-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’；
4)针对SNP rs7412位点核酸形式为C的反向PCR扩增引物(p158C),其DNA序列为：5’-CTGGTACACTGCCAGGCG-3’。
2荧光DNA分子探针设计：
根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)网站提供的ApoE基因DNA序列信息，该基因SNP rs429358位点与SNP rs7412位点之间的DNA序列为：tgcggccgcctggtgcagtaccgcggcgaggtgcaggccatgctcggccagagcaccgaggagctgcgggtgcgcctcgcctcccacctgcgcaagctgcgtaagcggctcctccgcgatgccgatgacctgcagaagcgc，选取该序列中的一段作为探针的互补核酸序列部分，该序列为5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3’。选用荧光探针，选取FAM荧光基团以及BHQ1淬灭基团，FAM荧光基团偶联在互补核酸序列的5’端，BHQ1淬灭基团偶联在互补核酸序列的3’端，荧光探针为：5’FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’。
以下部分以基因组DNA样本为检测样品进行阐述：
3操作流程
2)基因组DNA提取：
a、含有900μl红细胞裂解液的1.5ml离心管中，上下颠倒5-6次。
b、室温放置10分钟(期间颠倒2-3次)，室温条件下13000-16000g离心20秒。
c、吸去上清，剩下约10-20μl于管底。
d、涡旋振荡重悬白细胞，加入Nuclei Lysis Solution，吹吸5-6次，可选步骤加入1.5μl的RNA酶混匀，37℃条件下放置15分钟。
e、加入100ul Precipitation Solution，涡旋振荡10-20秒。
f、室温条件下13000-16000g离心10分钟。
g、转移上清到新的1.5ml离心管，加入300ul异丙醇，上下轻轻颠倒直到有白色絮状DNA出现。
h、室温条件下13000-16000g离心1分钟。
i、吸去上清，加入70％乙醇，轻轻的上下颠倒几次洗涤DNA，室温条件下13000-16000g离心1分钟。
j、轻轻吸去乙醇，将1.5ml离心管倒置在干净的吸水纸上10-15分钟。
k、加入100ul无菌去离子水溶解DNA，65℃水浴1小时，也可以4℃过夜。
l、利用全波长扫描式多功能读数仪中的DNA浓度测量程序测量所提DNA的浓度，取一部分DNA溶液用无菌去离子水稀释至2ng/ml，作为后续PCR检测模板，剩余DNA溶液存放于2～8℃或-20℃。
3)PCR反应体系配制：
根据ApoE基因的三个多态性，与三种检测试剂(ε2试剂、ε3试剂和ε4试剂),分别用于人群中存在6种不同ApoE基因型ε2/ε2,ε3/ε3,ε4/ε4,ε2/ε3,ε2/ε4和ε3/ε4的检测。6种已知ApoE基因型DNA已知样本(ε2/ε2DNA已知样本、ε3/ε3DNA已知样本、ε4/ε4DNA已知样本、ε2/ε3DNA已知样本、ε2/ε4DNA已知样本和ε3/ε4DNA已知样本)作为对照
其中ε2试剂包括：
a、对应ApoEε2等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物p112T(该实例中核酸序列为5’-GCGGACATGGAGGACGTGT-3’)。
b、对应ApoEε2等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物p158T(该实例中核酸序列为5’-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’)。
c、荧光探针
(该实例中探针形式为5’FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’)。
d、PCR预混液TaqMan Genotyping Master Mix。
其各成分具体剂量为：
其中ε3试剂包括：
a、对应ApoEε3等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物p112T(该实例中核酸序列为5’-CGGACATGGAGGACGTGT-3’)。
b、对应ApoEε3等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物p158C(该实例中核酸序列为5’-CTGGTACACTGCCAGGCG-3’)。
c、荧光探针
(该实例中探针形式为5’FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’)。
d、PCR预混液TaqMan Genotyping Master Mix。
其各成分具体剂量为：
其中ε4试剂包括：
a、对应ApoEε4等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物p112C(该实例中核酸序列为5’-CGGACATGGAGGACGTGC-3’)。
b、对应ApoEε4等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物p158C(该实例中核酸序列为5’-CTGGTACACTGCCAGGCG-3’)。
c、荧光探针
(该实例中探针形式为5’FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’)。
d、PCR预混液TaqMan Genotyping Master Mix。
其各成分具体剂量为：
使用ApoE基因分型检测试剂需要10μl反应体系就可以充分检测到信号。
ε2基因检测的PCR反应体系为：
ε2试剂： 5μl
待测DNA样品(2ng/μl)： 5μl
ε2阳性对照检测体系1：
ε2试剂： 5μl
ε2/ε2DNA已知样本(2pg/μl)： 5μl
ε2阳性对照检测体系2：
ε2试剂： 5μl
ε2/ε3DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε2阳性对照检测体系3：
ε2试剂： 5μl
ε2/ε4DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε2阴性对照检测体系1：
ε2试剂： 5μl
ε3/ε3DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε2阴性对照检测体系2：
ε2试剂： 5μl
ε4/ε4DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε2阴性对照检测体系3：
ε2试剂： 5μl
ε3/ε4DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε3基因检测的PCR反应体系为：
ε3试剂： 5μl
待测DNA样品(2ng/μl)： 5μl
ε3阳性对照检测体系1：
ε3试剂： 5μl
ε3/ε3DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε3阳性对照检测体系2：
ε3试剂： 5μl
ε2/ε3DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε3阳性对照检测体系3：
ε3试剂： 5μl
ε3/ε4DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε3阴性对照检测体系1：
ε3试剂： 5μl
ε2/ε2DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε3阴性对照检测体系2：
ε3试剂： 5μl
ε4/ε4DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε3阴性对照检测体系3：
ε3试剂： 5μl
ε2/ε4DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε4基因检测的PCR反应体系为：
ε4试剂： 5μl
待测DNA样品(2ng/μl)： 5μl
ε4阳性对照检测体系1：
ε4试剂： 5μl
ε4/ε4DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε4阳性对照检测体系2：
ε4试剂： 5μl
ε2/ε4DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε4阳性对照检测体系3：
ε4试剂： 5μl
ε3/ε4DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε4阴性对照检测体系1：
ε4试剂： 5μl
ε2/ε2DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε4阴性对照检测体系2：
ε4试剂： 5μl
ε3/ε3DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
ε4阴性对照检测体系3：
ε4试剂： 5μl
ε2/ε3DNA已知样本(2pg/ul)： 5μl
4)PCR扩增反应:
将待测样品即人血液提取的基因组DNA(2ng/μl)与已知ApoE基因型的DNA已知样品分别加入ε2，ε3和ε4基因检测的10μl PCR反应体系中。用灭菌的去离子水作为整个PCR体系的阴性对照。在PCR板中配制好所有PCR反应体系后，用PCR封板膜封闭好PCR板，残留在PCR板孔壁上液体用Universal 32R型控温高速离心机离心到管底并排除气泡。然后，将该PCR板放入7500Fast Real-Time PCR system仪器中，打开7500software V2.0.6软件，选择软件中的Genotyping模块，在Plate setup中设置对应放入PCR板上每孔的检测内容。然后在Run method中设置PCR反应程序及反应体系，这些项目设置完毕后，便可运行程序，该程序默认PCR反应之前先在60℃条件下预读取本底荧光强度值再进行PCR扩增以消除背景荧光值。待PCR反应完成之后，仪器可自动在60℃条件下收集荧光数据。表1为该实例PCR反应过程的标准热循环程序。
表1 PCR反应程序
5)数据分析与结论:
表2 Real-Time PCR仪读完荧光值之后导出荧光数值
表2是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的实例样品检测荧光信号读值结果。
在Real-Time PCR仪读完荧光值之后导出荧光数值，结果如表2所示。在ApoE基因型为ε2/ε2的DNA已知样品中，ε2基因检测体系为阳性结果，其荧光值为2.23623729。ε3，ε4基因检测体系为阴性结果，其荧光值分别为0.218611和0.51656318；在ApoE基因型为ε3/ε3的DNA已知样品中，ε3基因检测体系为阳性结果，其荧光值为2.50921822。ε2，ε4基因检测体系为阴性结果，其荧光值分别为0.1933465和0.40723515；在ApoE基因型为ε4/ε4的DNA已知样品中，ε4基因检测体系为阳性结果，其荧光值为2.59521461。ε2，ε3基因检测体系为阴性结果，其荧光值分别为0.17685843和0.22782183。作为阴性对照的无菌去离子水样品，在ε2，ε3和ε4基因检测体系中，其荧光值分别为0.17888165，0.22742152和-0.0582402。这样，在这一实例中最大的阴性结果荧光值为0.51656318，而所有阳性结果的荧光值均远大于最大的阴性结果荧光值。在此定义以最大阴性结果荧光值的2倍数值作为荧光信号阳性和阴性结果的分界值，该实例中这一分界值为1.03312636。
根据表2中的荧光值可以作柱形图，柱形图如图5所示，在阳性与阴性结果分界值处划一直线，可以直观的看出所有的阳性结果都在直线上方，而所有阴性结果都在直线下方。该实例中待测DNA样品在ε2和ε3基因检测体系得到结果根据上述分析方法判断为阳性结果，而在ε4基因检测体系得到结果根据上述分析方法判断为阴性结果。由此得知，该实例中待测DNA样品的ApoE基因型为ε2/ε3型。
实施例1
在实施例中，如图1所示，引物p112T仅与SNP rs429358为T的核酸序列匹配，引物p112C仅与SNP rs429358为C的核酸序列匹配，引物p158T仅与SNP rs7412为T的核酸序列匹配，引物p158C仅与SNP rs7412为C的核酸序列匹配。由此，含引物对p112T/p158T的PCR体系仅能扩增SNP rs429358为T同时SNP rs7412为T的ApoE等位基因(即ε2)；含引物对p112T/p158C的PCR体系仅能扩增SNP rs429358为T同时SNP rs7412为C的ApoE等位基因(即ε3)；含引物对p112C/p158C的PCR体系仅能扩增SNP rs429358为C同时SNP rs7412为C的ApoE等位基因(即ε4)。所以，利用上述三种引物对，可以特异地扩增出ApoE的不同等位基因，并确定DNA样品中人ApoE等位基因的类型。
实施例2
在实施例中，如图2所示，荧光基团(F)脱离的DNA分子探针3的两段分别偶联有荧光基团和淬灭基团，此时由于淬灭基团能吸收荧光基团的激发能量，因此，体系中只能检测到本底荧光信号。荧光基团(F)脱离的DNA分子探针3能与ApoE基因DNA模板反义链1特异互补匹配，且匹配序列位于正向扩增引物2和反向扩增引物5对应的DNA序列之间，当PCR扩展反应开始后，正向扩增引物2和荧光基团(F)脱离的DNA分子探针3将与ApoE基因DNA模板反义链1结合，反向扩增引物5将与ApoE基因DNA模板正义链4结合，在DNA聚合酶6的作用下开始扩增模板DNA。
实施例3
在实施例中，如图3所示，DNA聚合酶6在PCR反应过程中从正向扩增引物2或反向扩增引物5开始，以ApoE基因DNA模板反义链1或ApoE基因DNA模板正义链4为模板，起始DNA的延伸，当DNA聚合酶6在介导DNA延伸的过程中遇到结合在ApoE基因DNA模板反义链1上的荧光基团(F)脱离的DNA分子探针3，DNA聚合酶6将利用其外切酶活性从荧光基团(F)脱离的DNA分子探针3的5’端逐一切掉探针上的核苷酸，致使荧光基团从探针上脱离并与淬灭基团分离，此时即能检测到荧光基团激发出的荧光信号，并由此确定检测样品含有该引物对所对应的ApoE等位基因类型。
发明人认为引物序列对于检测效果是有非常重要的影响的，引物序列的任何改变都有可能造成检测效果的不可信。将正向引物或者反向引物的端点碱基进行改造，结果假阳性几乎达到100％。
1、本发明的产品具有更高的灵敏度
发明人把三种基因的阳性质粒用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH8.0)进行稀释，得到2400拷贝/μl、240拷贝/μl和24拷贝/μl的，并对这些样本进行检测，95％(n≥20)的阳性率作为最低检测限的标准。
(1)ε2检测试剂三种浓度的检测结果：
图5ε2检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。结果如图5所示：阴性结果■阳性结果，ε2阳性质粒，浓度为2400拷贝/μl
图6ε2检测试剂中加入浓度为240拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。结果如图6所示：阴性结果■阳性结果,ε2阳性质粒，浓度为240拷贝/μl。
图7ε2检测试剂中加入浓度为24拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，16个可检出结果，检出率为80％。结果如图7所示：阴性结果■阳性结果，ε2阳性质粒，浓度为24拷贝/μl。
(2)ε3检测试剂三种浓度的检测结果：
图8ε3检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。结果如图8所示：阴性结果■阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为2400拷贝/μl。
图9ε3检测试剂中加入浓度为240拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。结果如图9所示：阴性结果■阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为240拷贝/μl。
图10ε3检测试剂中加入浓度为24拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，18个可检出结果，检出率为90％。结果如图10所示：阴性结果■阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为24拷贝/μl。
(3)ε4检测试剂三种浓度的检测结果：
图11ε4检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。结果如图11所示：阴性结果■阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为2400拷贝/μl。
图12ε4检测试剂中加入浓度为240拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结果，检出率为100％。结果如图12所示：阴性结果■阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为240拷贝/μl。
图13ε4检测试剂中加入浓度为24拷贝/μl阳性质粒，重复检测20次，14个可检出结果，检出率为70％。结果如图13所示：阴性结果■阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为24拷贝/μl。
人类基因组约有30亿个碱基，1个细胞约为6pg的基因组，1个拷贝人类基因组DNA约为3pg，因此10pg人类基因组DNA约有3个拷贝，1ng的基因组DNA人类基因组DNA约有300个拷贝。因此240个拷贝相当于0.8ng的人类基因组DNA，所以本试剂盒检测最低检出限为0.8ng/μl，即4ng/反应。
2、本发明的产品具有更高的特异性
我们选择考察了1.5*106拷贝/反应、3*105拷贝/反应、6*104拷贝/反应、1.2*104拷贝/反应、2.4*103拷贝/反应、4.8*102拷贝/反应、96拷贝/反应和19.2拷贝/反应，换算后相当于基因组DNA含量为5000ng/反应、1000ng/反应、200ng/反应、40ng/反应、8ng/反应、1.6ng/反应、0.32ng/反应和0.064ng/反应，结果如图14所示。■ε2阳性质控品ε3阳性质控品■ε4阳性质控品。
图14 APOEε2基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果。
表3 APOEε2基因检测试剂对阳性质控品的扩增Ct值
| 浓度 | ε2阳性质控品 | ε3阳性质控品 | ε4阳性质控品 |
| 1.5*106拷贝/反应 | 20.1 | 34.91 | - |
| 3*105拷贝/反应 | 24.84 | 35.78 | - |
| 6*104拷贝/反应 | 27.71 | - | - |
| 1.2*104拷贝/反应 | 29.62 | - | - |
| 2.4*103拷贝/反应 | 32.53 | - | - |
| 4.8*102拷贝/反应 | 32.53 | - | - |
| 96拷贝/反应 | 34.31 | - | - |
| 19.2拷贝/反应 | 36.49 | - | - |
图15APOEε3基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果，结果如图15所示。■ε2阳性质控品ε3阳性质控品■ε4阳性质控品。
表4 APOEε3基因检测试剂对阳性质控品的扩增Ct值
图16APOEε4基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果，结果如图16所示。■ε2阳性质控品ε3阳性质控品■ε4阳性质控品。
表5 APOEε4基因检测试剂对阳性质控品的扩增Ct值
| 浓度 | ε2阳性质控品 | ε3阳性质控品 | ε4阳性质控品 |
| 1.5*106拷贝/反应 | - | 36.83 | 21.91 |
| 3*105拷贝/反应 | - | - | 23.1 |
| 6*104拷贝/反应 | - | - | 26.1 |
| 1.2*104拷贝/反应 | - | - | 28.29 |
| 2.4*103拷贝/反应 | - | - | 30.25 |
| 4.8*102拷贝/反应 | - | - | 33.79 |
| 96拷贝/反应 | - | - | 36.79 |
| 19.2拷贝/反应 | - | - | - |
从图5-16和表3-5可以看出，APOEε2基因检测试剂对ε2阳性质控品浓度为1.5*106拷贝/反应、3*105拷贝/反应、6*104拷贝/反应、1.2*104拷贝/反应、2.4*103拷贝/反应、4.8*102拷贝/反应、96拷贝/反应时可以得到很好的扩增，但对ε3阳性质控品浓度为1.5*106拷贝/反应、3*105拷贝/反应时出现了非特异的扩增；APOEε3扩增液对ε3阳性质控品浓度为1.5*106拷贝/反应、3*105拷贝/反应、6*104拷贝/反应、1.2*104拷贝/反应、2.4*103拷贝/反应、4.8*102拷贝/反应、96拷贝/反应时可以得到很好的扩增，但对ε4阳性质控品浓度为1.5*106拷贝/反应时出现了非特异的扩增；APOEε4扩增液对ε4阳性质控品浓度为1.5*106拷贝/反应、3*105拷贝/反应、6*104拷贝/反应、1.2*104拷贝/反应、2.4*103拷贝/反应、4.8*102拷贝/反应、96拷贝/反应时可以得到很好的扩增，但对ε3阳性质控品浓度为1.5*106拷贝/反应时出现了非特异的扩增。因此，表明APOE基因检测试剂能够耐受总量为6*104拷贝/反应的其它亚型的DNA，根据阳性质控品的大小，换算成基因组DNA的量为200ng。
以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。
Claims (10)
1.一种ApoE试剂盒，其特征在于，包括：
第一引物，所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基，
第二引物，所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基，
核酸探针，所述核酸探针与两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列，并且所述核酸探针具有：
发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5’端，
调节基团，所述调节基团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光，
其中，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412，
其中，所述述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基，
其中，所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基，
其中，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物，
其中，所述第一引物包括：
5’-CGGACATGGAGGACGTGT-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGAGT-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3’
5’-CGGACATGGAGGACGAGC-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGTGC-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’，
所述第二引物包括：
5’-TGGTACACTGCCAGGTA-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGTCA-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’
5’-TGGTACACTGCCAGGCG-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGGTG-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3’，
其中，所述核酸探针的长度为20个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸探针的序列 为：5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3’。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸探针的发光基团为荧光基团，所述荧光基团为FAM，所述调节基团为淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒检测最低检出限为240个拷贝/μl，根据换算为基因组DNA0.8ng/μl，即4ng/反应；
APOE基因检测试剂能够耐受总量为6*104拷贝/反应的其它亚型的DNA，根据阳性质控品的大小，换算成基因组DNA的量为200ng/反应。
5.一种如权利要求1所述的ApoE试剂盒的引物，其特征在于，所述引物包括：
第一引物，所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基，
第二引物，所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基，
所述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基，
所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基，
所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物，
其中，所述第一引物包括：
5’-CGGACATGGAGGACGTGT-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGAGT-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3’
5’-CGGACATGGAGGACGAGC-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGTGC-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’，
所述第二引物包括：
5’-TGGTACACTGCCAGGTA-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGTCA-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’
5’-TGGTACACTGCCAGGCG-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGGTG-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3’，
6.一种如权利要求1所述的ApoE试剂盒的用途，其特征在于，用于 确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，包括以下步骤：
a.引物设计：
b.荧光DNA分子探针设计：
c.PCR反应体系配制：
d.PCR反应体系配制：
利用第一引物和第二引物对所述核酸样本进行PCR扩增，并且在所述PCR扩增体系中加入核酸探针，所述核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分的核酸序列；以及
e.检测反应体系的发光，
f.数据分析与结论:
以便确定所述核酸样本的预定位点是否存在已知突变。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：
其中，所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基，
所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基，
所述第一引物和第二引物之一作为正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另一个作为反向引物，
所述核酸探针具有：
发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5’端，
调节基团，所述调节基团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光，
其中，所述核酸样本来源于人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞，
其中，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412，
其中，所述述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基，
其中，所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基，
其中，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物，
其中，所述第一引物包括：
5’-CGGACATGGAGGACGTGT-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGAGT-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3’
5’-CGGACATGGAGGACGAGC-3’
5’-GCGGACATGGAGGACGTGC-3’
5’-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’，
所述第二引物包括：
5’-TGGTACACTGCCAGGTA-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGTCA-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’
5’-TGGTACACTGCCAGGCG-3’
5’-CTGGTACACTGCCAGGTG-3’
5’-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3’。
其中，所述核酸探针的长度为20个核苷酸。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述核酸探针的序列为：
5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3’。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述核酸探针的发光基团为荧光基团，所述荧光基团为FAM，所述调节基团为淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109371113A (zh) * | 2018-10-29 | 2019-02-22 | 湖南健基生物技术有限公司 | 一种检测人类apoe和slco1b1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用 |
| CN110951859A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-04-03 | 苏州天隆生物科技有限公司 | 一种检测人类apoe和slco1b1基因多态性的免提取试剂盒 |
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| CN103103259A (zh) * | 2012-12-31 | 2013-05-15 | 厦门人瑞生物医药科技有限公司 | 确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物 |
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