CN110951859A - 一种检测人类apoe和slco1b1基因多态性的免提取试剂盒 - Google Patents

一种检测人类apoe和slco1b1基因多态性的免提取试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的免提取试剂盒，所述试剂盒包括主反应液、ApoE引物探针混合液1、ApoE引物探针混合液2、SLCO1B1引物探针混合液1、SLCO1B1引物探针混合液2、阳性质控和阴性质控；所述主反应液包括DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸、Mg2+、Tris缓冲液和超纯BSA，所述DNA聚合酶为TTX酶和/或HS‑D‑Taq酶。试剂盒以其独特的扩增体系，特异性和灵敏度兼顾的引物和探针序列和体系，能够直接完成对全血样本和试子样本完成测试，检测在四个反应体系闭管中完成，防止了污染发生，另外试剂盒中阴性质控和阳性质控能够有效监控假阳性和试剂和操作的有效性，有效控制污染和监控整个实验过程。

Description

一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的免提取试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的免提取试剂盒。
背景技术
他汀类药物是目前最有效的降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平从而降低心血管疾病风险的药物。但是不同个体对不同他汀类药物的反应不同，原因是他汀类药物在肝脏代谢和转运的遗传特性不同。特别是参与他汀类药物肝脏代谢的关键性转运蛋白如阴离子转运多肽(OATP1B1)(由SLCO1B1基因编码)以及载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)的基因多态性可影响他汀类药物的血浆及肝脏浓度，从而影响他汀类药物的疗效和安全性。他汀类药物在肌病风险或在降LDL-C的能力方面如发生变化，均会改变这类药物临床应用时的效益风险比，因此根据检测结果指导患者在选择用药方面具有重要的临床意义。
载脂蛋白E参与血脂的运输、存储和排泄。人APOE基因位于19号染色体，该基因有两个功能性SNP位点：rs429358(c.388T>C)和rs7412(c.526C>T)。这两个位点形成3种单倍体E2、E3、E4。由三种单倍体构成6种不同的基因型(E2/E2、E3/E3、E4/E4、E2/E3、E2/E4和E3/E4)。E2型个体患冠心病的风险低，但易患黄斑变性和Ⅲ类高脂血症。而E4型个体患老年痴呆症、冠心病、脑梗塞、视网膜色素变性等疾病风险高。他汀类药物对E4型的疗效往往不佳，而对E2携带者的降脂作用最强，因此不同个体的APOErs429358(c.388T>C)和rs7412(c.526C>T)基因对他汀药物的反应不同。
有机阴离子转运多肽参与多种药物转运，在他汀类药物代谢中负责将血液中的药物转移至肝脏直接发挥药效或者转化为有活性的物质。由12号染色体上的SLCO1B1基因编码。有两个主要的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位点，分别为(c.388A>G)和(c.521T>C)。这两个SNP位点可形成四种单倍体：SLCO1B1*1a(388A-521T)，SLCO1B1*1b(388G-521T)，SLCO1B1*5(388A-521C)，SLCO1B1*15(388G-521C)。
突变型SLCO1B1基因引起编码的OATP1B1转运蛋白活力减弱，表现为肝脏摄取药物能力降低，引起他汀药物血药浓度上升，增加横纹肌溶解症或肌病的发生风险。
他汀类药物是目前最有效的降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平从而降低心血管疾病风险的药物，但是不同个体对不同他汀类药物的反应不同，因此他汀类药物使用前需要对患者进行相关基因检测，以免造成不良反应。目前市场上存在一些APOE、SLCO1B1基因多态性检测试剂盒，但是都需要对试剂盒检测样本进行提取、纯化。
全血和试子作为临床常用的检测样本,以其稳定、易获得、易保存等优点常作为临床检验的原料。全血由血浆和血细胞组成，血细胞中含有大量的人类遗传物质，因此全血常作为临床核酸检测特别是DNA检测的原料。取得样本的试子上包含大量的特定部位的脱落细胞，脱落细胞中含有大量的人类遗传物质，因此试子以其无创伤性、易获得、易保存等特点也常作为临床核酸检验原料。
临床采集的全血样本和试子中含有大量的抑制PCR扩增的抑制剂，这些抑制物质包括内源性和外源性；内源性抑制物质包括：免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、黏蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。外源性抑制物质包括：肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、采样器材上的抑制剂、试子上纤维等。目前市场上的荧光PCR分子诊断产品在对全血样本和试子样本进行核酸检测前，需要对全血和试子中的核酸进行分离纯化，这样不仅增加了临床检测步骤、工时、成本，而且在提取纯化过程中还存在操作失误、安全性问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的免提取试剂盒，其优点是本试剂盒可将全血和试子样本直接用于荧光PCR扩增，检测体系具有抗全血和试子中抑制剂干扰、扩增灵敏度高、保存稳定性好等优点。
为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的免提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括主反应液、ApoE引物探针混合液1、ApoE引物探针混合液2、SLCO1B1引物探针混合液1、SLCO1B1引物探针混合液2、阳性质控和阴性质控；
所述主反应液包括DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸、Mg2+、Tris缓冲液和超纯BSA，所述DNA聚合酶为TTX酶和/或HS-D-Taq酶，浓度为2U-5U，所述四种脱氧核糖核苷酸为dATP、dCTP、dTTP和dGTP，浓度为0.2μM/ml-1μM/ml，所述Mg2+浓度为0.04M/ml-0.4M/ml；
所述ApoE引物探针混合液1包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2、和SEQID NO.5所示的引物序列；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的探针序列；以及SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的检测质控内标引物和探针序列；
所述ApoE引物探针混合液2包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.3、和SEQID NO.5所示的引物序列；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的探针序列；以及SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的检测质控内标引物和探针序列；
所述SLCO1B1引物探针混合液1包括SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.13、和SEQ ID NO.17所示的引物序列；SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示的探针序列；以及SEQID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的检测质控内标引物和探针序列；
所述SLCO1B1引物探针混合液2包括SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.15、和SEQ ID NO.17所示的引物序列；SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示的探针序列；以及SEQID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的检测质控内标引物和探针序列。
作为一个优选方案，所述阳性质控包括含有APOE基因SNP位点rs429358(c.388T>C)和rs7412(c.526C>T)，SLCO1B1基因SNP位点(c.388A>G)和(c.521T>C)的质粒；所述阴性质控为生理盐水。
作为一个优选方案，SEQ ID NO.7所示探针序列5’修饰FAM发光基团，3’修饰BHQ1淬灭基团；SEQ ID NO.8所示探针序列5’修饰CY5发光基团，3’修饰BHQ2淬灭基团；SEQ IDNO.11所示序列5’修饰TEXAS RED发光基团，3’修饰BHQ1淬灭基团。
作为一个优选方案，SEQ ID NO.18所示探针序列5’修饰FAM发光基团，3’修饰BHQ1淬灭基团；SEQ ID NO.19所示探针序列5’修饰CY5发光基团，3’修饰BHQ2淬灭基团。
本发明用于APOE、SLCO1B1基因多态性检测，免除全血和试子作为临床样本前期处理过程，可将全血和试子样本直接用于荧光PCR扩增，这样就减少了核酸提取纯化步骤带来的增加操作工序、增加耗时、物料损耗、环境和操作人员安全等问题，使得检测过程简单，医生和病人都能较快的得到检测结果。此外虽然免除了全血和试子样本的提取，该检测体系具有抗全血和试子中抑制剂干扰、扩增灵敏度高、保存稳定性好等优点，能够满足全血和试子中核酸的检测。
本发明具有以下有益效果：本发明能够快速的检测APOE基因SNP位点rs429358(c.388T>C)和rs7412(c.526C>T)，SLCO1B1基因SNP位点(c.388A>G)和(c.521T>C)基因位点的多态性，具有极高的灵敏度和特异性。试剂盒以其独特的扩增体系，特异性和灵敏度兼顾的引物和探针序列和体系，能够直接完成对全血样本和试子样本完成测试，检测在4个反应体系闭管中完成，防止了污染发生，另外试剂盒中阴性质控和阳性质控能够有效监控假阳性和试剂和操作的有效性，有效控制污染和监控整个实验过程。
附图说明
图1为HS-D-Taq酶量优化试验结果，酶使用量0.5U-5U均有扩增，随着体系中酶量增加，扩增效率明显增强，当体系中酶使用量高于2U后，扩增效率不再增加，酶量达到饱和。
图2为TTX酶量优化试验结果，酶使用量0.5U-5U均有扩增，0.5U-1U扩增效率无明显差异，随着体系中酶量增加，扩增效率明显增强，当体系中酶使用量高于2U后，扩增效率不再增加，酶量达到饱和。
图3为dNTP使用量测试优化结果。
图4为Tris使用量的测试优化结果。
图5为Tris和BSA使用量的测试优化结果。
图6为Mg2+使用量优化结果。
图7A和B为样本#1对应APOE体系1和APOE体系2检测结果。
图8A和B为样本#2对应APOE体系1和APOE体系2检测结果。
图9A和B为样本#3对应APOE体系1和APOE体系2检测结果。
图10A和B为样本#4对应APOE体系1和APOE体系2检测结果。
图11A和B为样本#5对应APOE体系1和APOE体系2检测结果。
图12A和B为样本#6对应APOE体系1和APOE体系2检测结果。
图13A和B为样本#7对应APOE体系1和APOE体系2检测结果。
图14A和B为样本#8对应APOE体系1和APOE体系2检测结果。
图15A和B为样本#9对应APOE体系1和APOE体系2检测结果。
图16A和B为样本#1对应SLCO1B1体系1和SLCO1B1体系2检测结果。
图17A和B为样本#2对应SLCO1B1体系1和SLCO1B1体系2检测结果。
图18A和B为样本#3对应SLCO1B1体系1和SLCO1B1体系2检测结果。
图19A和B为样本#4对应SLCO1B1体系1和SLCO1B1体系2检测结果。
图20A和B为样本#5对应SLCO1B1体系1和SLCO1B1体系2检测结果。
图21A和B为样本#6对应SLCO1B1体系1和SLCO1B1体系2检测结果。
图22A和B为样本#7对应SLCO1B1体系1和SLCO1B1体系2检测结果。
图23A和B为样本#8对应SLCO1B1体系1和SLCO1B1体系2检测结果。
图24A和B为样本#9对应SLCO1B1体系1和SLCO1B1体系2检测结果。
图25A和B为样本#10对应APOE体系1和体系2核酸提取检测结果。
图26A和B为样本#10对应APOE体系1和体系2免提取检测结果。
图27A和B为样本#11对应APOE体系1和体系2核酸提取检测结果。
图28A和B为样本#11对应APOE体系1和体系2免提取检测结果。
图29A和B为样本#12对应APOE体系1和体系2核酸提取检测结果。
图30A和B为样本#12对应APOE体系1和体系2免提取检测结果。
图31A和B为样本#13对应APOE体系1和体系2核酸提取检测结果。
图32A和B为样本#13对应APOE体系1和体系2免提取检测结果。
图33A和B为样本#10对应SLCO1B1体系1和体系2核酸提取检测结果。
图34A和B为样本#10对应SLCO1B1体系1和体系2免提取检测结果。
图35A和B为样本#11对应SLCO1B1体系1和体系2核酸提取检测结果。
图36A和B为样本#11对应SLCO1B1体系1和体系2免提取检测结果。
图37A和B为样本#12对应SLCO1B1体系1和体系2核酸提取检测结果。
图38A和B为样本#12对应SLCO1B1体系1和体系2免提取检测结果。
图39A和B为样本#13对应SLCO1B1体系1和体系2核酸提取检测结果。
图40A和B为样本#13对应SLCO1B1体系1和体系2免提取检测结果。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
实施例1.试剂盒制备
主反应液主要成分为DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸、Tris缓冲液、Mg2+、超纯BSA。
1.主反应配方：
1.1：DNA聚合酶原料为Taq酶，浓度为2U-5U。
DNA聚合酶原料为外购的Taq酶，外购的供应商包括TOYOBO(产品名称TTX)，厦门同仁心(产品名称HS-D-Taq)。这两种酶具有高度的耐干扰性和极高的扩增效率，且可用于荧光PCR扩增。
平台体系中酶使用量测试优化。
试验方法：总体系20μl，酶使用量0.5U-5U，最优酶使用量为2U-5U。具体使用量见图1和图2。
图1为HS-D-Taq酶量优化试验结果，酶使用量0.5U-5U均有扩增，0.5U-1U扩增效率无明显差异，随着体系中酶量增加，扩增效率明显增强，当体系中酶使用量高于2U后，扩增效率不再增加，酶量达到饱和，所以该体系中酶优化使用量2U-5U。
图2为TTX酶量优化试验结果，酶使用量0.5U-5U均有扩增，随着体系中酶量增加，扩增效率明显增强，当体系中酶使用量高于2U后，扩增效率不再增加，酶量达到饱和，所以该体系中酶优化使用量2U-5U。
1.2：四种脱氧核糖核苷酸原料为dATP、dCTP、dTTP、dGTP，纯度为≥98％,优化的浓度为0.2μM/ml-1μM/ml。
平台体系中dNTP使用量测试优化。
试验方法：总体系20μl，dNTP使用量0.05μM/ml-1.5μM/ml，具体的加入量见图3。
图3为dNTP使用量测试优化结果。dNTP使用量0.05μM/ml-1.5μM/ml均有较好扩增，随着dNTP量增加，扩增效率明显增强，当使用量增加到1μM/ml时，扩增Ct值无明显变化，考虑到扩增效率，该体系中使用的dNTP优化量可以为0.2μM/ml-1μM/ml，最高的扩增效率，dNTP使用量为1μM/ml。
1.3：反应缓冲液的主要成分为Tris(PH＝8.9)，超纯BSA(纯度≥99％)，纯化水，其中Tris浓度范围0.05M/ml-0.5M/ml，BSA浓度范围0.5mg/ml-5mg/ml。
碱性环境对该平台全血的扩增是必须的Tris(PH＝8.9)。
缓冲液Tris和BSA浓度优化：
试验方法：总体积为20μl，Tris浓度范围0.05M/ml-0.5M/ml(测试浓度分别为0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5)，BSA浓度范围0.5mg/ml-5mg/ml(测试浓度分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0)。
图4和图5分别为Tris和BSA使用量的测试优化结果，从结果我们可以看出Tris和BSA的使用对该体系的扩增效率没有明显的影响。
1.4：Mg2+原料为MgCl2，分子生物级，浓度0.04M/ml-0.4M/ml。
MgCl2浓度优化
试验方法：总体积为20μl，Mg2+浓度范围0.02M/ml-0.5M/ml，具体使用量见图6。
图6为Mg2+使用量优化结果，Mg2+浓度范围0.02M/ml-0.5M/ml，均有较好的扩增，随着Mg2+使用量增加，扩增效率明显增强，当浓度达到0.4M/ml，扩增Ct值不再有明显变化，因此该体系Mg2+优化浓度范围0.04M/ml-0.4M/ml，扩增效率最优的Mg2+使用量为0.4M/ml。因此主反应液优化配方如表1。
表1.主反应液优化配方
物料名称 浓度
dNTP 0.2μM/ml-1μM/ml
Tris-HCL(PH＝8.9) 0.05M/ml-0.5M/ml
BSA 0.5mg/ml-5mg/ml
MgCl2 0.04M/ml-0.4M/ml
TTX/HS-D-Taq 2U-5U
2.APOE引物探针混合液1、APOE引物探针混合液2
APOE引物探针混合液1、APOE引物探针混合液2主要成分为APOE多态性位点(c.388T>C、c.526C>T)特异性引物和探针、内标引物探针、纯化水。
APOE-F1、APOE-R1、APOE-R3用于检测APOE 388位点多态性；
APOE-P1用于检测388位点的公用探针。
APOE-F2、APOE-F3、APOE-R2用于检测APOE 526位点多态性；
APOE-P2用于检测526位点的公用探针。
内标IC-F、IC-R是用于检测质控内标引物；内标IC-P是用于检测质控内标探针。
APOE-P1 5’修饰FAM发光基团，3’修饰BHQ1淬灭基团；APOE-P2 5’修饰CY5发光基团，3’修饰BHQ2淬灭基团；内标IC-P 5’修饰TEXAS RED发光基团，3’修饰BHQ1淬灭基团。
APOE引物探针混合液1主要成分包括APOE-F1、APOE-R1、APOE-P1、APOE-F2、APOE-R2、APOE-P2、IC-F、IC-R、IC-P多种引物探针。
APOE引物探针混合液2主要成分包括APOE-F1、APOE-R3、APOE-P1、APOE-F3、APOE-R2、APOE-P2、IC-F、IC-R、IC-P多种引物探针。
APOE引物探针混合液1、APOE引物探针混合液2最佳配方如表2和表3。
表2.APOE引物探针混合液1最佳配方
Figure BDA0002322497850000071
表3.APOE引物探针混合液2最佳配方
Figure BDA0002322497850000081
表4.引物探针序列表一
APOE-F1 5’GTGCGCCTCGCCTCC3’(SEQ ID NO.1)
APOE-F2 5’GCGGACATGGAGGACGAGC3’(SEQ ID NO.2)
APOE-F3 5’GCGGACATGGAGGACGAGT3’(SEQ ID NO.3)
APOE-R1 5’CCTGGTACACTGCCAGGTA3’(SEQ ID NO.4)
APOE-R2 5’CTCCTCGGTGCTCTGGC3’(SEQ ID NO.5)
APOE-R3 5’CCTGGTACACTGCCAGTCG3’(SEQ ID NO.6)
APOE-P1 5’CAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAGCC3’(FAM)(SEQ ID NO.7)
APOE-P2 5’CGGCCGCCTGGTGCAGTACCGC3’(CY5)(SEQ ID NO.8)
IC-F 5’GCAGGAGATGCCGTGGAC3’(SEQ ID NO.9)
IC-R 5’GGGTACCTCACCTCAGCCATT3’(SEQ ID NO.10)
IC-P 5’GAGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGC 3’(TEXAS RED)(SEQ ID NO.11)
3.SLCO1B1引物探针混合液1、SLCO1B1引物探针混合液2
SLCO1B1-F1、SLCO1B1-R1、SLCO1B1-F3用于检测SLCO1B1 388位点多态性；
SLCO1B1-P1用于检测388位点的公用探针。
SLCO1B1-F2、SLCO1B1-F4、APOE-R2用于检测SLCO1B1 521位点多态性；
SLCO1B1-P2用于检测521位点的公用探针。
内标IC-F、IC-R是用于检测质控内标引物；内标IC-P是用于检测质控内标探针。
SLCO1B1-P1 5’修饰FAM发光基团，3’修饰BHQ1淬灭基团；SLCO1B1-P2 5’修饰CY5发光基团，3’修饰BHQ2淬灭基团；内标IC-P 5’修饰TEXAS RED发光基团，3’修饰BHQ1淬灭基团。
SLCO1B1引物探针混合液1主要成分包括SLCO1B1-F1、SLCO1B1-R1、SLCO1B1-P1、SLCO1B1-F2、SLCO1B1-R2、SLCO1B1-P2、IC-F、IC-R、IC-P多种引物探针。
SLCO1B1引物探针混合液2主要成分包括SLCO1B1-F3、SLCO1B1-R1、SLCO1B1-P1、SLCO1B1-F4、SLCO1B1-R2、SLCO1B1-P2、IC-F、IC-R、IC-P多种引物探针。
SLCO1B1引物探针混合液1、SLCO1B1引物探针混合液2最佳配方如表5和表6。
表5.SLCO1B1引物探针混合液1最佳配方
Figure BDA0002322497850000091
表6.SLCO1B1引物探针混合液2最佳配方
Figure BDA0002322497850000092
表7.引物探针序列表二
SLCO-F1 5’ACAGGTATTCTAAAGAAACTAATAGCA3’(SEQ ID NO.12)
SLCO-F2 5’GGGTCATACATGTGGATATAGGT3’(SEQ ID NO.13)
SLCO-F3 5’ACAGGTATTCTAAAGAAACTAATAACG3’(SEQ ID NO.14)
SLCO-F4 5’TGGGTCATACATGTGGATATATCC3’(SEQ ID NO.15)
SLCO-R1 5’ACGCGTAGTTTAAACCTGTG3’(SEQ ID NO.16)
SLCO-R2 5’CTCTACTATTTCAAAAGTAGACAAAGGG 3’(SEQ ID NO.17)
SLCO-P1 5’TAGAGCATCACCTGAGATAGTGGG3’(MGB FAM)(SEQ ID NO.18)
SLCO-P2 5’TAGGGGAGACTCCCATAGTACCATTGGGGCT3’(CY5)(SEQ ID NO.19)
IC-F 5’GCAGGAGATGCCGTGGAC3’(SEQ ID NO.9)
IC-R 5’GGGTACCTCACCTCAGCCATT3’(SEQ ID NO.10)
IC-P 5’GAGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGC 3’(TEXAS RED)(SEQ ID NO.11)
4.ApoE、SLCO1B1阳性质控
阳性质控的主要成分为含有APOE基因SNP位点rs429358(c.388T>C)和rs7412(c.526C>T)，SLCO1B1基因SNP位点(c.388A>G)和(c.521T>C)的质粒。其中APOEc.388T>C基因型为TC、APOEc.526C>T基因型为CT、SLCO1B1 c.388A>G基因型为AG、SLCO1B1 c.521T>C基因型为TC。
配制：人工合成的含有上述基因位点且位点基因型为上述对应基因型的人工构建质粒，使用TE缓冲液进行适当浓度稀释。对于该试剂盒体系，建议最终浓度范围为104copise/μl-107copise/μl。
5.ApoE、SLCO1B1阴性质控
成分为生理盐水。
表8.试剂盒组成
Figure BDA0002322497850000101
【检验方法】
1.样本处理【样本处理区】
全血：取出需要检测的全血样本，室温下上下颠倒混匀即可。
试子：取出需要检测的试子样本，生理盐水洗涤混匀即可。
2.试剂配制【试剂准备区】
从检测试剂盒中取出ApoE引物探针混合液1、ApoE引物探针混合液2、SLCO1B1引物探针混合液1、SLCO1B1引物探针混合液2和ApoE、SLCO1B1主反应液，在室温下融化并振荡混匀，2000rpm离心10秒。计算所需反应试剂测试数n[n＝测试数+对照数(2)]，每个测试配制4个反应体系，每测试反应体系配制如表9。
表9.每个测试反应体系配制
Figure BDA0002322497850000111
按n测试计算上述各试剂的用量，加入一适当容积的离心管中混匀。按18μl量分装到PCR薄壁管中，然后转移到样本处理区。
3.加样【样本处理区】
单个反应总体积为20μl，因此往上述分装有18μl反应液的PCR薄壁管中按顺序分别加入2μl阳性对照、2μl阴性对照、2μl全血样本或试子洗涤液，盖紧8联管管盖，然后将8联管轻轻混匀后微离心，最后转移至PCR检测区。
4.PCR扩增及荧光检测【PCR扩增区】
将各反应管按一定顺序放入荧光定量PCR仪上，按以下程序进行PCR扩增：
表10.PCR扩增程序
Figure BDA0002322497850000112
检测荧光选择：FAM通道、TEXAS RED通道和CY5通道。
5.检测仪器
扩增检测仪器选择具有FAM、TEXAS RED和CY5三个通道的荧光定量PCR仪，如ABI7500荧光PCR扩增仪和西安天隆公司的天隆TL988-Ⅳ四通道荧光定量PCR扩增仪。
6.检测结果判读
6.1.试剂盒有效性判定
阳性质控：FAM、CY5通道Ct值≤35，扩增曲线有明显指数增长期。
阴性质控：各通道均无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，无Ct值。
如不符合上述条件，则该次实验视为无效，应检查操作、仪器、试剂、扩增条件等方面的问题。
6.2.样本有效性判定
内标基因：所有样本检测中TEXAS RED通道Ct值≤38，扩增曲线有明显指数增长期。
在满足上述条件后对目的通道进行判读，具体参见表11.-表14.
表11.
Figure BDA0002322497850000121
表12.
表13.
Figure BDA0002322497850000123
表14.
Figure BDA0002322497850000124
实施例2.试剂盒全血样本测试
选取9例已知APOE基因SNP位点rs429358(c.388T>C)和rs7412(c.526C>T)，SLCO1B1基因SNP位点(c.388A>G)和(c.521T>C)的型别全血样本，按照本发明检测方法中的操作步骤进行检测，检测结果参见图7-图24
样本已知基因型和本发明试剂盒检测基因型如下表15。
表15本发明试剂盒检测结果和已知结果对比
Figure BDA0002322497850000131
结论：通过对9例已知APOE基因SNP位点rs429358(c.388T>C)和rs7412(c.526C>T)，SLCO1B1基因SNP位点(c.388A>G)和(c.521T>C)的型别全血样本免提取检测，通过表15判读结果对比分析，本发明试剂盒检测结果与已知型别完全相同，即该发明专利可以稳定用于免提取样本的APOE、SLCO1B1基因多态性检测。
实施例3.核酸提取后检测结果与免提取检测结果的比对
实验过程：选取4例已知APOE基因SNP位点rs429358(c.388T>C)和rs7412(c.526C>T)，SLCO1B1基因SNP位点(c.388A>G)和(c.521T>C)的型别全血样本，分成2组，1组核酸提取纯化试剂盒进行核酸提取纯化，另一组按照本发明检测方法中的操作步骤免除核酸提取直接进行检测，检测结果参见图25-图40，具体判读结果见表16。
表16核酸提取和免提取检测结果对比
Figure BDA0002322497850000132
结论：通过对图25-图40和表16判读结果的对比分析，核酸提取后检测结果与免提取检测结果相同，且与已知型别完全相同，即免提取并不影响检测结果，免提取检测荧光值低于核酸提取检测荧光值，Ct值有退后，可能由于免提取的样本中存在PCR扩增的抑制剂。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州天隆生物科技有限公司
<120> 一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的免提取试剂盒
<130> /
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgcgcctcg cctcc 15
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggacatgg aggacgagc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggacatgg aggacgagt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctggtacac tgccaggta 19
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcctcggtg ctctggc 17
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctggtacac tgccagtcg 19
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caggtcatcg gcatcgcgga ggagcc 26
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggccgcctg gtgcagtacc gc 22
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcaggagatg ccgtggac 18
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggtacctca cctcagccat t 21
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagcttggaa cagactcacg gccagc 26
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acaggtattc taaagaaact aatagca 27
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gggtcataca tgtggatata ggt 23
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acaggtattc taaagaaact aataacg 27
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgggtcatac atgtggatat atcc 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acgcgtagtt taaacctgtg 20
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctctactatt tcaaaagtag acaaaggg 28
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tagagcatca cctgagatag tggg 24
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
taggggagac tcccatagta ccattggggc t 31

Claims (4)

1.一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的免提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括主反应液、ApoE引物探针混合液1、ApoE引物探针混合液2、SLCO1B1引物探针混合液1、SLCO1B1引物探针混合液2、阳性质控和阴性质控；
所述主反应液包括DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸、Mg2+、Tris缓冲液和超纯BSA，所述DNA聚合酶为TTX酶和/或HS-D-Taq酶，浓度为2U-5U，所述四种脱氧核糖核苷酸为dATP、dCTP、dTTP和dGTP，浓度为0.2μM/ml-1 μM/ml，所述Mg2+浓度为0.04M/ml-0.4 M/ml；
所述ApoE引物探针混合液1包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2、和SEQ IDNO.5所示的引物序列；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的探针序列；以及SEQ ID NO.9、SEQID NO.10和SEQ ID NO.11所示的检测质控内标引物和探针序列；
所述ApoE引物探针混合液2包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.3、和SEQ IDNO.5所示的引物序列；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的探针序列；以及SEQ ID NO.9、SEQID NO.10和SEQ ID NO.11所示的检测质控内标引物和探针序列；
所述SLCO1B1引物探针混合液1包括SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.13、和SEQ ID NO.17所示的引物序列；SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示的探针序列；以及SEQID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的检测质控内标引物和探针序列；
所述SLCO1B1引物探针混合液2包括SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.15、和SEQ ID NO.17所示的引物序列；SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示的探针序列；以及SEQID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的检测质控内标引物和探针序列。
2.根据权利要求1所述一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的免提取试剂盒，其特征在于，所述阳性质控包括含有APOE 基因SNP位点rs429358 (c.388T>C)和rs7412(c.526C>T)，SLCO1B1基因SNP位点（c.388A>G）和（c.521T>C）的质粒；所述阴性质控为生理盐水。
3.根据权利要求1所述一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的免提取试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.7所示探针序列5，修饰FAM发光基团，3，修饰BHQ1淬灭基团；SEQ ID NO.8所示探针序列5，修饰CY5发光基团，3，修饰BHQ2淬灭基团；SEQ ID NO.11所示序列5，修饰TEXAS RED发光基团，3，修饰BHQ1淬灭基团。
4.根据权利要求1所述一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的免提取试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.18所示探针序列5，修饰FAM发光基团，3，修饰BHQ1淬灭基团；SEQ IDNO.19所示探针序列5，修饰CY5发光基团，3，修饰BHQ2淬灭基团。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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CB02 Change of applicant information
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Address after: Building NE-33, Northeast District, Suzhou Nano City, No. 99 Jinjihu Avenue, Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province, 215000

Applicant after: SUZHOU TIANLONG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: Room 501, Building 07, Northwest District, Suzhou Nano City, No. 99, Jinjihu Avenue, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province, 215000

Applicant before: SUZHOU TIANLONG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
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