CN116397017A - 用于多态性检测apoe基因分型的检测方法和pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于多态性检测APOE基因分型的检测方法和PCR试剂盒。本申请中，所述引物对组包括选自下组的一种或多种引物对：第一引物对，所述第一引物对包括具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的引物；和第二引物对，所述第二引物对包括具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的引物。本申请提供的试剂盒可实现对APOE基因388 T>C位点和526 C>T位点多态性的检测。此检测方法操作简便，分型结果直观，对检测设备要求简单，可针对性地选择合适的他汀类调脂药物，从而降低冠心病的发生率及心血管疾病发生的风险。
Description
技术领域
本发明及基因检测领域，特别涉及用于多态性检测APOE基因分型的检测方法和PCR试剂盒。
背景技术
APOE(载脂蛋白E)是血浆脂蛋白的重要组成部分，参与脂质的储存、运输及排泄。APOE蛋白具有多态性，其多态性与高脂蛋白血症及动脉粥样硬化密切相关。APOE基因的两个SNP rs429358(c.388T>C，Cys130Arg)和rs7412(c.526C>T，Arg176Cys)构成3种单倍型，分别是E2(rs429358T-rs7412T)、E3(rs429358T-rs7412C)、E4(rs429358C-rs7412C)。由3种单倍型构成6种不同的基因型(E2/E2、E3/E3、E4/E4、E2/E3、E2/E4和E3/E4)。E3/E3是最常见的基因型，人群中的频率约为60％。E2、E4为突变型基因，所占比例分别为8％和14％。APOE4携带者患冠心病的风险提高40％。他汀类药物是目前有效降低冠心病发病率和死亡率的一线药物，高脂血症是冠心病发生的重要危险因素之一。APOE蛋白的多态性导致其对同一他汀类降脂药物的代谢能力不同，他汀类药物对APOE4携带者疗效往往不佳甚至无疗效，而对AOPE2携带者的降脂作用最强。目前FDA已将APOE2列为普伐他汀药物反应相关的生物标记。
目前，APOE基因分型常用的检测方法有基于PCR方法的等位基因特异性PCR法(AS-PCR)、荧光PCR法和测序法。等位基因特异性PCR法较为简单方便，但只有当等位基因特异性引物3’末端碱基与对应的等位基因碱基型模板完全互补配对时，PCR扩增反应才可以正常进行而得到特定产物，并产生荧光信号，否则即无特异性PCR扩增反应，观察不到荧光信号，容易产生假阴性检测结果。测序法准确率很高，但是存在周期长、费用高、容易发生交叉污染等缺点。
荧光PCR法是在PCR扩增时加入一对引物，再同时加入一个或两个特异性的荧光探针，该探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发生的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增起始阶段，探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使荧光报告基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，检测结果准确而高效，适用多位点同时检测。因此，开发一种基于荧光PCR法的APOE(载脂蛋白E)基因分型检测方法尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供基于荧光PCR技术的一种检测APOE基因分型的方法。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测APOE基因分型的引物对组。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测APOE基因分型的引物探针混合液。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测APOE基因分型的PCR试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种用于多态性检测APOE基因分型的引物对组，所述引物对组包括选自下组的一种或多种引物对：
第一引物对，所述第一引物对包括具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的引物；和
第二引物对，所述第二引物对包括具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的引物。
在一些优选的方案中，所述第一引物对包括具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序的反向引物。
在一些优选的方案中，所述第二引物对包括具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的反向引物。
在一些优选的方案中，所述引物对组包括第一引物对和第二引物对。
在一些优选的方案中，所述第一引物对特异性检测APOE基因388T>C位点；
所述第二引物对特异性检测APOE基因526C>T位点。
本发明的第二方面提供了一种用于多态性检测APOE基因分型的引物探针混合液，所述引物探针混合液包括本发明第一方面所述的PCR引物对组和选自下组的一个或多个探针：
第一探针，包括特异性靶向野生型APOE基因388T>C位点的核苷酸序列；
第二探针，包括特异性靶向突变型APOE基因388T>C位点的核苷酸序列；
第三探针，包括特异性靶向野生型APOE基因526C>T位点的核苷酸序列；和
第四探针，包括特异性靶向突变型APOE基因526C>T位点的核苷酸序列。
在一些优选的方案中，所述第一探针具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
所述第二探针具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
所述第三探针具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；
所述第四探针具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
在一些优选的方案中，所述第一探针具有第一荧光标记，所述第二探针具有第二荧光标记，所述第三探针具有第三荧光标记，所述第四探针具有第四荧光标记；
且所述第一荧光标记和所述第二荧光标记互不相同，所述第三荧光标记和所述第四荧光标记互不相同。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记和所述第四荧光标记相同，所述第二荧光标记和所述第三荧光标记相同。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记和所述第四荧光标记选自FAM和VIC。
在一些优选的方案中，所述第二荧光标记和所述第三荧光标记选自FAM和VIC。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记和所述第四荧光标记为FAM；且所述第二荧光标记和所述第三荧光标记为VIC。
在一些优选的方案中，所述SEQ ID NO：3的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB；
所述SEQ ID NO：8的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB；
所述SEQ ID NO：4的5’端标记有VIC，3’端标记有MGB；和
所述SEQ ID NO：7的5’端标记有VIC，3’端标记有MGB。
上述引物和探针的核苷酸序列信息如下：
本发明第三方面提供了一种用于检测APOE基因分型的PCR试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对组。
在一些优选的方案中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器包含第一引物探针混合液；所述第一引物探针混合液包含所述第一引物对、所述第一探针和所述第二探针。
在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器包含第二引物探针混合液；
所述第二引物探针混合液包含所述第二引物对、所述第三探针和所述第四探针。
在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器包含PCR反应酶系；优选地，所述PCR反应酶系包括热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs和PCR buffer。
在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括阳性质控品。
在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括阴性质控品。
在一些优选的方案中，所述阴性质控品为纯化水。
在一些优选的方案中，所述阳性质控品包括：包含APOE 388T>C野生型目的片段和APOE 526C>T野生型目的片段；和/或
APOE 388T>C纯合突变型目的片段和APOE 526C>T纯合突变型目的片段。
在一些优选的方案中，所述阳性质控品包括第一阳性质控品、第二阳性质控品和第三阳性质控品；
所述第一阳性质控品包括：APOE 388T>C野生型目的片段和APOE 526C>T野生型目的片段；
所述第二阳性质控品包括：APOE 388T>C野生型目的片段和APOE 526C>T野生型目的片段，以及APOE 388T>C纯合突变型目的片段和APOE 526C>T纯合突变型目的片段；
所述第三阳性质控品包括：APOE 388T>C纯合突变型目的片段和APOE 526C>T纯合突变型目的片段。
本发明的第四方面提供了一种检测APOE基因分型的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，所述样本中含有人APOE基因；
(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应：
其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、本发明第一方面所述的引物对组。
在一些优选的方案中，所述方法为非诊断目的。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明提供的用于检测APOE基因分型的PCR试剂盒可实现对APOE基因388T>C位点和526C>T位点多态性的检测。此检测方法操作简便，分型结果直观，对检测设备要求简单；
(2)本发明提供的用于检测APOE基因分型的PCR试剂盒检测限低、检测结果准确度高。
(3)本发明适用于对高脂血症患者的APOE基因388T>C位点和526C>T位点多态性进行检测，通过型别鉴定后，可针对性地选择合适的他汀类调脂药物，从而降低冠心病的发生率及心血管疾病发生的风险。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中ABI7500仪器检测APOE基因388T>C位点PCR反应管阴性质控品和阳性质控品的结果；
图2是根据本发明实施例中ABI7500仪器检测APOE基因526C>T位点PCR反应管阴性质控品和阳性质控品的结果；
图3是根据本发明实施例中Bio-Rad CFX Connect仪器检测APOE基因388T>C位点PCR反应管阴性质控品和阳性质控品的结果；
图4是根据本发明实施例中Bio-Rad CFX Connect仪器检测APOE基因526C>T位点PCR反应管阴性质控品和阳性质控品的结果。
具体实施方式
APOE基因多态性导致其对同一他汀类调脂药物的代谢能力不同，APOE4携带者患冠心病的风险提高40％，他汀类药物对APOE4携带者疗效往往不佳甚至无疗效，而对AOPE2携带者的降脂作用最强。本发明人通过研究，开发了一款试剂盒，适用于对高脂血症患者的APOE基因388T>C位点和526C>T位点多态性进行检测，通过型别鉴定后，可针对性地选择合适的他汀类调脂药物，从而降低冠心病的发生率及心血管疾病发生的风险。
本发明提供了一种基于实时荧光定量PCR平台，根据检测的荧光值的差异对样本型别自动进行散点分型，从而检测人外周全血样本中的APOE基因388T>C位点和526C>T位点多态性的方法，并提供了该方法所用的引物、探针及包括该引物和探针混合液的试剂盒。
本发明的一些实施方式中提供了一种用于多态性检测APOE基因分型的引物对组，所述引物对组包括选自下组的一种或多种引物对：
第一引物对，所述第一引物对包括具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的引物；和
第二引物对，所述第二引物对包括具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的引物。
在一些优选的方案中，所述第一引物对包括具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序的反向引物。
在一些优选的方案中，所述第二引物对包括具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的反向引物。
在一些优选的方案中，所述引物对组包括第一引物对和第二引物对。
在一些优选的方案中，所述第一引物对特异性检测APOE基因388T>C位点；
所述第二引物对特异性检测APOE基因526C>T位点。
本发明的另一些实施方式中提供了一种用于多态性检测APOE基因分型的引物探针混合液，所述引物探针混合液包括本发明第一方面所述的PCR引物对组和选自下组的一个或多个探针：
第一探针，包括特异性靶向野生型APOE基因388T>C位点的核苷酸序列；
第二探针，包括特异性靶向突变型APOE基因388T>C位点的核苷酸序列；
第三探针，包括特异性靶向野生型APOE基因526C>T位点的核苷酸序列；和
第四探针，包括特异性靶向突变型APOE基因526C>T位点的核苷酸序列。
在一些优选的方案中，所述第一探针具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
所述第二探针具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
所述第三探针具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；
所述第四探针具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
在一些优选的方案中，所述第一探针具有第一荧光标记，所述第二探针具有第二荧光标记，所述第三探针具有第三荧光标记，所述第四探针具有第四荧光标记；
且所述第一荧光标记和所述第二荧光标记互不相同，所述第三荧光标记和所述第四荧光标记互不相同。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记和所述第四荧光标记相同，所述第二荧光标记和所述第三荧光标记相同。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记和所述第四荧光标记选自FAM和VIC。
在一些优选的方案中，所述第二荧光标记和所述第三荧光标记选自FAM和VIC。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记和所述第四荧光标记为FAM；且所述第二荧光标记和所述第三荧光标记为VIC。
在一些优选的方案中，所述SEQ ID NO：3的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB；
所述SEQ ID NO：8的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB；
所述SEQ ID NO：4的5’端标记有VIC，3’端标记有MGB；和
所述SEQ ID NO：7的5’端标记有VIC，3’端标记有MGB。
上述引物和探针的核苷酸序列信息如下表1：
表1
上述PCR引物和标有不同类型荧光的探针根据人APOE基因388T>C位点和APOE526C>T位点所在区段DNA序列设计并合成，可分别用于对APOE基因388T>C位点和APOE 526C>T位点多态性进行检测，根据野生型和突变型检测结果在荧光值上的差异，分别判断样本中APOE基因388T>C位点型别和APOE 526C>T位点型别，根据388T>C位点型别和APOE 526C>T位点型别最终确定APOE基因的型别。所述引物和探针，能够准确检测APOE基因388T>C位点和APOE 526C>T位点的型别。
本发明的另一些实施方式中提供了一种用于检测APOE基因分型的PCR试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对组。
在一些优选的方案中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器包含本发明第二方面所述的引物探针混合液。
在一些优选的方案中，所述第一容器包含第一引物对、第一探针和第二探针。
在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器第二引物对、第三探针和第四探针。
在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器包含PCR反应酶系；优选地，所述PCR反应酶系包括热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs和PCR buffer。
在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括阳性质控品。
在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括阴性质控品。
在一些优选的方案中，所述阴性质控品为纯化水。
在一些优选的方案中，所述阳性质控品包括：包含APOE 388T>C野生型目的片段和APOE 526C>T野生型目的片段；和/或
APOE 388T>C纯合突变型目的片段和APOE 526C>T纯合突变型目的片段。
在一些优选的方案中，所述阳性质控品包括第一阳性质控品、第二阳性质控品和第三阳性质控品；
所述第一阳性质控品包括：APOE 388T>C野生型目的片段和APOE 526C>T野生型目的片段；
所述第二阳性质控品包括：APOE 388T>C野生型目的片段和APOE 526C>T野生型目的片段，以及APOE 388T>C纯合突变型目的片段和APOE 526C>T纯合突变型目的片段；
所述第三阳性质控品包括：APOE 388T>C纯合突变型目的片段和APOE 526C>T纯合突变型目的片段。
在一些优选的方案中，所述的试剂盒的组成如下表2：
表2
检测APOE基因388T>C位点多态性时，APOE基因388T>C位点的两种探针及引物对共同组成APOE 388PCR反应液A；
检测APOE基因526C>T位点多态性时，APOE基因526C>T位点的两种探针及引物对共同组成APOE 526PCR反应液A；
热启动Taq酶、热启动Taq酶稀释液、UDG酶、dNTPs、PCR buffer组成APOE PCR反应液B；
APOE 388PCR反应液A和APOE PCR反应液B组成AOPE 388PCR反应液；
APOE 526PCR反应液A和APOE PCR反应液B组成APOE 526PCR反应液。
所述PCR buffer包括如下成分，如表3，
表1.APOE PCR buffer
| 编号 | 组分 | 组分中的主要成分 |
| 1 | PCR buffer | (NH4)2SO4、Tris-HCl、MgCl2、Tween-20 |
所述质控品样本包括如下成分，如表4，
表2.质控品成分
本发明还提供了检验本发明所述试剂盒有效性的方法，具体为：每次检测均设置阴性对照组和阳性对照组，当阳性对照组的检测结果为阳性，且每个阳性样本均分型正确，阴性对照组均为阴性时，表明试剂盒有效。
本发明的另一些实施方式提供了一种检测APOE基因分型的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，所述样本中含有人APOE基因；
(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应：
其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、本发明第一方面所述的引物对组。
在一些优选的方案中，所述样本包括人外周全血。
在一些优选的方案中，所述方法为非诊断目的。
在一些优选的方案中，所述制备扩增反应体系包括步骤：
按照表5、表6所示的PCR反应液构成，将引物对和探针、热启动Taq酶、热启动Taq酶稀释液、UDG酶、dNTPs、PCR buffer混合，加入待测样本核酸2μL，分别制备得到APOE388PCR反应液和APOE 526PCR反应液。
表3.APOE 388PCR反应液
| APOE基因388T>C位点特异性引物和探针混合液 | 8μL |
| 10U/μL热启动Taq酶 | 0.4μL |
| 1U/μL UDG酶 | 0.1μL |
| 热启动Taq酶稀释液 | 2μL |
| 20mmol/L dNTPs | 0.5μL |
| PCR buffer | 7μL |
| 待测样本核酸 | 2μL |
表4.APOE 526PCR反应液
| APOE基因526C>T位点特异性引物和探针混合液 | 8μL |
| 10U/μL热启动Taq酶 | 0.4μL |
| 1U/μL UDG酶 | 0.1μL |
| 热启动Taq酶稀释液 | 2μL |
| 20mmol/L dNTPs | 0.5μL |
| PCR buffer | 7μL |
| 待测样本核酸 | 2μL |
本发明中PCR试剂盒的检测原理如下：应用实时荧光PCR技术，针对人类外周全血基因组中APOE基因388T>C位点和526C>T位点设计特异性引物和探针，PCR扩增并检测荧光信号以区分其型别。设计特异性引物和探针，配以热启动Taq酶等成分组成核酸扩增试剂，经核酸提取后的待测样本核酸加入PCR反应管中，使用荧光PCR仪进行PCR扩增，并检测荧光信号。仪器软件系统自动根据检测的荧光值的差异分析基因的型别，根据等位基因分型散点图对待测样本进行定性检测。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1、用于检测APOE基因分型的试剂盒
本实施例中提供了用于检测APOE基因分型的试剂盒，各组成成分、包装及数量(48反应/盒)如表7。
表7
实施例2、检测APOE基因分型的的方法
本实施例中构建了该试剂盒基于实时荧光PCR平台用于定性检测APOE基因388T>C位点和526C>T位点的检测体系，并提供该试剂盒的使用方法，本实施例中取人外周全血样本核酸进行检测。具体实施步骤如下：
步骤1)、待测样本采集和制备(样本处理区)
抽取受检者静脉血不少于1mL注入EDTA抗凝管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀。进行核酸提取，本试剂盒中阴性质控品需参与核酸提取。采用分光光度计对提取后的核酸进行检测，核酸浓度需稀释到20ng/μL。
步骤2)、PCR反应体系的制备(试剂准备区)
PCR体系配制前准备：取出试剂盒中APOE 388PCR反应液A、APOE 526PCR反应液A、APOE PCR反应液B、阴性质控品、APOE阳性质控品1、APOE阳性质控品2、APOE阳性质控品3，室温融化后，涡旋振荡混匀，8000rpm瞬时离心后使用。
PCR体系构成如表8和表9所示，其中，表8为APOE 388PCR反应液体系；表9为APOE526PCR反应管体系。
表8
表9
上述表9中，APOE基因APOE 388T>C位点和526C>T位点多态性的特异性引物和探针的核酸序列信息见表10。
表10
步骤3)、加样(样本制备区)
取步骤1)核酸提取所获得的待测样本核酸、阴性对照和阳性对照各2μL，加入至步骤二配置的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应液的总体积为20μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒；所述试剂盒的质控品如表11：
表11
表11中，阳性对照包含阳性质控品1,、阳性质控品2和阳性质控品3，
含APOE 388T和APOE 526C的质粒DNA是APOE阳性质控品1；
含APOE 388T和APOE 526C，APOE 388C和APOE 526T的质粒DNA混合液是APOE阳性质控品2；
含APOE 388C和APOE 526T的质粒DNA是APOE阳性质控品3。
阴性质控品为纯化水。
步骤4)PCR扩增
分别使用ABI7500荧光定量PCR仪和Bio-Rad CFX Connect荧光定量PCR仪进行PCR扩增。将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道和VIC通道，设置好对应的阳性对照和阴性对照孔；选择参比荧光(Passive Reference)为ROX(ABI7500需要设置参比荧光，Bio-Rad CFX Connect不需要设置参比荧光)。ABI7500和Bio-Rad CFX Connect设置循环条件分别如表12和表13，反应体系体积设置为20μL。设置完成后，保存文件，运行程序。
表12 ABI7500反应程序
表13 Bio-Rad CFX Connect反应程序
步骤5)结果读取及分析
(1)ABI7500仪器：运行结束后自动保存结果，点击Analysis，选择AllelicDiscrimination Plot窗口，自动获得分析结果。
(2)Bio-Rad CFX Connect仪器：运行结束后自动保存结果。APOE 388T>C位点结果分析：选择“Allelic Discrimination”窗口，只选择APOE 388T>C位点的所有检测孔，确认X轴(Allele 1)勾选为FAM通道，Y轴(Allele 2)勾选为VIC通道，勾选“View call map”自动获得分析结果。APOE 526C>T位点结果分析：选择“Allelic Discrimination”窗口，只选择APOE 526C>T位点的所有检测孔，确认X轴(Allele 1)勾选为VIC通道，Y轴(Allele2)勾选为FAM通道，勾选“View call map”自动获得分析结果。
ABI7500检测上述阳性质控品和阴性质控品所得图谱见图1和图2。
Bio-Rad CFX Connect检测人上述阳性质控品和阴性质控品所得图谱见图3和图4。
实施例3、最低检测限
以6种细胞核酸或质粒及阴性质控品、阳性质控品为待检样本，使用合格的人类APOE基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，按照试剂盒说明书进行检测。检测结果应为相应位点基因型别。试剂盒的样本最低检测限检测结果如下表14：
表14
实施例4、准确性及特异性检测
以多种不同的细胞核酸或质粒及阴性质控品、阳性质控品为待检样本，使用本发明提供的试剂盒进行检测，检测结果应为相应位点基因型别。试剂盒准确性及特异性检测结果如下表15：
表15
实施例5、重复性检测
对本发明试剂盒的重复性进行检测，分别取APOE基因型别已知的细胞核酸或质粒样本、阴性质控品及阳性质控品为待检样本。使用合格的“人类APOE基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”，按照试剂盒说明书进行检测，检测结果应为相应位点基因型别。重复性检测结果如下表16。
表16
以上结果表明，本发明的3批次试剂盒均能准确检测APOE基因型别，即本发明试剂盒的重复性检测符合要求。
实施例6、重复性检测
抽取60例人静脉血，每例不少于1mL置于EDTA采血管中，该血样已经通过核酸提取后，测序进行检测，并且明确分别为APOE基因388T>C位点型别和526C>T位点型别中的1种，做好样本标记并确保标签信息无误，-20℃保存。取每个样本核酸2μL，使用合格的“人类APOE基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”，按照试剂盒说明书进行检测，检测结果应为相应位点基因型别。60例人外周血样本检测结果检如下表17。
表17
检测结果：60例临床样本中，46例临床样本呈APOE基因388T>C位点野生型，13例临床样本呈APOE基因388T>C位点杂合突变型，1例临床样本呈APOE基因388T>C位点纯合突变型；48例临床样本呈APOE基因526C>T位点野生型，11例临床样本呈APOE基因526C>T位点杂合突变型，1例临床样本呈APOE基因526C>T位点纯合突变型，所检结果与测序检测结果一致性为100％，特异性为100％，灵敏度为100％。
本发明人深入比对分析人类载脂蛋白E(APOE)的基因序列，针对目标序列设计了数对引物和数条探针，期望能获得扩增效果好。灵敏度高、准确率高的引物组和检测探针。
引物特异性因引物设计差异而不同，不同的引物退火温度不同，试剂检测灵敏度对不同引物探针组合影响较大，获得较优的PCR扩增引物以及探针序列需通过大量的实验，对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了本试剂盒采用的引物、探针序列较优组合。
实验中发现，不同引物对组合得到的扩增效果有较大差异。
例如对比例1中，使用如下的对照引物对进行检测，其他检测步骤和条件同上述实施例。
对比例1、检测APOE基因分型的试剂盒
引物和探针序列信息：
表18
按照实施例4的方法进行对照引物和探针的准确性和特异性检测。通过对已知APOE基因388T>C位点和526C>T位点基因型别的核酸样本、阳性质控品、阴性质控品对对照引物和探针进行检测，结果发现对照引物和探针无法对样本进行准确分型，准确性和特异性较差。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州达安基因股份有限公司
<120> 用于多态性检测APOE基因分型的检测方法和PCR试剂盒
<130> P210738-1CNCNA9
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
agaggagacg ctggcacg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
atgtcctgca cctcgccg 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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aggacgtgtg cgaccgact 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
atggaggacg tgcgtggac 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
tgcgtaagcg gctcgtcc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
ttccaccagg ggctccag 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
gcagaagcgc atggcagta 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
tggagaagtg cctggctgt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
actggaggaa caactgacc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
cggtgctctg gccgagca 18
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 18
<212> DNA
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gcagccgctc gccccagg 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
gatgacctgc agaagcgcct g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
tgacctgcag aagtgcctgg c 21
Claims (14)
1.一种用于多态性检测APOE基因分型的引物对组，其特征在于，所述引物对组包括选自下组的一种或多种引物对：
第一引物对，所述第一引物对包括具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的引物；和
第二引物对，所述第二引物对包括具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的引物。
2.根据权利要求1所述的引物对组，其特征在于，所述第一引物对特异性检测APOE基因388T>C位点；
所述第二引物对特异性检测APOE基因526C>T位点。
3.一种用于多态性检测APOE基因分型的引物探针混合液，其特征在于，所述引物探针混合液包括本发明第一方面所述的PCR引物对组和选自下组的一个或多个探针：
第一探针，包括特异性靶向野生型APOE基因388T>C位点的核苷酸序列；
第二探针，包括特异性靶向突变型APOE基因388T>C位点的核苷酸序列；
第三探针，包括特异性靶向野生型APOE基因526C>T位点的核苷酸序列；和
第四探针，包括特异性靶向突变型APOE基因526C>T位点的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的引物探针混合液，其特征在于，所述第一探针具有如SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列；
所述第二探针具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
所述第三探针具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；
所述第四探针具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的引物探针混合液，其特征在于，所述第一探针具有第一荧光标记，所述第二探针具有第二荧光标记，所述第三探针具有第三荧光标记，所述第四探针具有第四荧光标记；
且所述第一荧光标记和所述第二荧光标记互不相同，所述第三荧光标记和所述第四荧光标记互不相同。
6.根据权利要求5所述的引物探针混合液，其特征在于，所述第一荧光标记和所述第四荧光标记相同，所述第二荧光标记和所述第三荧光标记相同。
7.一种用于检测APOE基因分型的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的引物对组。
8.一种用于检测APOE基因分型的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器包含如权利要求3至7中任一项所述的引物探针混合液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述第一容器包含第一引物对、第一探针和第二探针。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器第二引物对、第三探针和第四探针。
11.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器包含PCR反应酶系。
12.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品；
和/或，所述试剂盒还包括阴性质控品。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括：包含APOE388T>C野生型目的片段和APOE 526C>T野生型目的片段；和/或
APOE 388T>C纯合突变型目的片段和APOE 526C>T纯合突变型目的片段。
14.一种检测APOE基因分型的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，所述样本中含有人APOE基因；
(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应：
其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本和如权利要求1或2所述的引物对组。
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