CN113215287A - 一种基于荧光定量pcr检测石蒜绵粉蚧的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的引物和探针，以及采用了该引物和探针的试剂盒和检测方法。检测引物组包括上游引物PsF1、下游引物PsR1和探针PsProbe；检测试剂盒包括引物、探针、模板、阳性样品、阴性样品、预混液。其检测方法是通过提取待检样品DNA,利用荧光定量PCR技术对待检样品DNA进行快速检测，通过荧光定量PCR扩增情况判断待检样品是否为石蒜绵粉蚧。本发明具有快速、灵敏、特异、易操作等优点，便于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术
石蒜绵粉蚧Phenacoccussolani Ferris，属于半翅目(Hemiptera)蚧总科(Coccoidea)粉蚧科(Pseudococcidae)绵粉蚧亚科(Phenacoccinae)绵粉蚧属Phenacoccus，是2008年7-9月份发现的我国大陆未曾报道的一种新害虫，也是目前我国口岸进出境检验检疫中的重要检疫性害虫。石蒜绵粉蚧的寄主范围十分广泛，已有的研究表明它的寄主植物有30余科，涵盖蔬菜、药材、观赏植物及烟草等。石蒜绵粉蚧是我国莴苣、茄子、马铃薯等蔬菜作物以及风靡我国的多肉园艺植物的重要潜在危险性害虫，若管控不当，将造成其大规模扩散蔓延。因此，加强对石蒜绵粉蚧的监测检测，是保障我国蔬菜花卉产业和中药产业健康发展的必要前提。随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR技术目前已广泛应用于蚧虫的检测。其与常规PCR检测方法相比，具有耗时短、操作简便、特异性好的特点，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。但石蒜绵粉蚧与其它绵粉蚧属近缘种有着较高的同源性，如木薯绵粉蚧、Phenacoccus sp.、扶桑绵粉蚧、槭绵粉蚧Phenacoccusaceris等。因此提供一种用于石蒜绵粉蚧的实时荧光定量PCR检测方法，具有高度特异性、准确度高，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
目前，针对石蒜绵粉蚧的检验方案即使用特异性SS-COI引物对石蒜绵粉蚧蛾进行普通PCR检测，公开号CN104745576A，该种采用普通PCR检测方法容易产生交叉污染，特异性有所欠缺；需做电泳检测，耗时较长，且凝胶产品污染环境；而实时荧光定量PCR技术不需电泳检测，省时省力，且特异性强、灵敏度高、重复性好，但目前尚无针对石蒜绵粉蚧的实时荧光定量PCR检测方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明所解决的技术问题在于提供一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的引物。
本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的探针。
本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的试剂盒。
本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案加以实现：
一方面，本发明提供了一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的引物和探针，包括上游引物PsF1、下游引物PsR1、特异性探针PsProbe，其核苷酸序列分别如下所示：
PsF1:5’-TAGATTCTGACTTCTTTTACCTTCT-3’；
PsR1：5’-TTAAGGTAATAAAATTTTGATT-3’，所述PsF1/ PsR1的扩增产物长度为125bp；
PsProbe：5’-ATACAGGTTGAACTTTATATCCTCCTT-3’， 5’端标记的荧光基团是FAM，3’端标记的淬灭基团是BHQ1。
另一方面，本发明还公开了一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2中所述的检测引物和探针。
优选地，该基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的试剂盒，还包括以下成分的部分或全部：(1)模板；(2)阳性对照和阴性对照；(3)PCR预混液。
优选地，所述阳性对照为重组质粒，阴性对照为ddH2O,所述PCR预混液为大连宝生物公司生产的Takara Premix Ex Tag。
再有，本发明还公开了一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的方法，包括以下步骤：
1）待检样品DNA的提取；
2）荧光定量PCR反应体系的配制：将步骤1）中提取的待检样品DNA加入荧光定量PCR反应体系，所述荧光定量PCR反应体系中含有权利要求1或2中所述的引物和探针；
3）标准质粒构建：利用引物对PsF1/PsR1对石蒜绵粉蚧DNA进行常规PCR扩增；得到目的片段与PUC57连接，再对连接产物进行转化，得到转化了质粒的菌落；挑取单克隆菌落接种于培养液中培养；利用质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，用于PCR鉴定并送杭州擎科生物有限公司进行测序验证；质粒鉴定正确后，用分光光度计测定质粒浓度，定量后作为本发明方法的基因标准品；
4）荧光定量PCR扩增：设置阳性对照和阴性对照，将配好的荧光定量PCR反应体系于荧光定量PCR扩增仪上进行反应，反应程序如下：预变性95℃5min；然后变形95℃10sec，58℃30sec，循环40次，反应结束后，保存文件，打开分析软件；
5）结果判断：通过观察荧光定量PCR的扩增情况判断检测结果。
优选地，荧光定量PCR反应体系为20μL反应体系，其含有10μM上下游引物各0.4μL，ROX Reference DyeⅡ 0.5μL，DNA模板2μL，10μM TaqMan探针0.8μL，加ddH2O至20μL。
本发明可快速准确实现石蒜绵粉蚧与绵粉蚧属、灰粉蚧属其他昆虫的鉴定，避免形态鉴定可能产生的混淆；与常规PCR相比，实时荧光定量PCR耗时大大缩短，仅需1h就能得到检测结果，同时特异性更强，灵敏度更高，检测的最低DNA浓度可达100fg/uL，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。本发明的石蒜绵粉蚧的实时荧光定量PCR检测的引物、探针及试剂盒，能快速、准确地对石蒜绵粉蚧进行检测。
附图说明
图1为本发明的引物PsF1/PsR1和探针PsProbe在石蒜绵粉蚧mtDNA上的位置示意图；
图2为基于Taqman探针的实时荧光PCR检测的标准曲线；
图3为荧光引物和探针的种特异性检验，图中，数字1：质粒DNA；2：石蒜绵粉蚧；3-8：木薯绵粉蚧、Phenacoccus sp.、扶桑绵粉蚧、槭绵粉蚧、新菠萝灰粉蚧和阴性对照；
图4为石蒜绵粉蚧荧光定量检测体系所用荧光引物和探针的灵敏性检测，图中，a-g分别代表10ng/uL，1.0ng/ul，100pg/ul，10pg/uL，1.0pg/uL和100fg/uL。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
依据目前的研究成果，石蒜绵粉蚧在我国不同地区出现了种群分化，为保证所设计引物的覆盖性，本发明选择了石蒜绵粉蚧及近缘种木薯绵粉蚧（P. manihoti）及近缘种石蒜绵粉蚧（P. solani）、绵粉蚧（Phenacoccus sp.）、扶桑绵粉蚧（P. solenopsis）、槭绵粉蚧（P. aceris）和外缘种新菠萝灰粉蚧（Dysmicoccus neobrevipes），，基于石蒜绵粉蚧线粒体基因组的COI基因序列使用primer5设计特异性引物PsF1/PsR1后，再根据扩增出来的特异性片段使用Primer Exprss设计探针PsProbe，可特异性扩增石蒜绵粉蚧，引物和探针均由杭州擎科生物公司合成。
实施例1：DNA提取
使用以上六种成虫进行DNA提取，取绵粉蚧放入研钵，加液氮磨成粉末状，DNA提取采用德国QIAGEN公司的DNeasy®Tissue Kit提取试剂盒，具体步骤参考试剂盒说明书进行。
实施例2：目标序列选取
对石蒜绵粉蚧的mtDNA中COI基因的序列进行分析，选择突变率较高的序列片段作为扩增的目的片段。设计了多组实时荧光定量PCR引物与探针，经过试验初步筛选，最终确定了一组用于检测石蒜绵粉蚧的荧光定量PCR引物和探针。
实施例3：特异性引物和探针设计
如图1所示，针对所做类群，设计上游引物PsF1、下游引物PsR1、特异性探针为PsProbe，
PsF1:5’-TAGATTCTGACTTCTTTTACCTTCT-3’,
PsR1:5’-TTAAGGTAATAAAATTTTGATT-3’，PsF1/PsR1的扩增产物长度为125bp；
PsProbe：5’-ATACAGGTTGAACTTTATATCCTCCTT-3’，探针的5’端以FAM报告荧光基团标记，3’端以BHQ1淬灭基团标记。
探针PsProbe是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，引物与石蒜绵粉蚧mtDNA完成高温变性、低温复性延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，同时加入的探针PsProbe与石蒜绵粉蚧mtDNA互补，在低温复性延伸阶段，反应体系中的Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针PsProbe酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
实施例4：标准质粒构建
利用引物对PsF1/PsR1对石蒜绵粉蚧DNA进行常规PCR扩增；得到目的片段与PUC57连接，再对连接产物进行转化，得到转化了质粒的菌落；挑取单克隆菌落接种于培养液中培养；利用质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，用于PCR鉴定并送杭州擎科生物有限公司进行测序验证；质粒鉴定正确后，用分光光度计测定质粒浓度，定量后作为本发明方法的基因标准品。
实施例5：实时荧光PCR检测
实时荧光定量PCR扩增体系为20μL：2×TaqMan probe Real-time PCR MasterMixture 10μL (大连宝生物公司 Takara Premix Ex Tag)，上下游引物（10μM）分别0.4μL，ROX Reference DyeⅡ0.5μL，DNA模板2μL，TaqMan探针（10μM）0.8μL，加ddH2O至20μL。实时荧光PCR扩增在CFX Opus 96 Real-Time PCR System定量PCR扩增仪上进行。打开“CFXOpus 96 Real-Time PCR SystemSoftware”,设置PCR反应条件,两步法扩增反应程序:预变性95℃5min；然后95℃10sec，58℃30sec，循环40次。点击运行,进行PCR反应，1h左右反应结束，保存文件，打开分析软件。
实施例6：标准曲线建立
以重组质粒为标准模板，以空质粒为阴性对照，将重组质粒进行10倍递减梯度稀释，每一浓度取2μL作为模板进行实时荧光定量PCR检测。分析结果显示，模板浓度越高，C t 值越小，平行试验结果显示，DNA浓度（x）与C t （y）具有相关性(x单位为ng/ul)，其关系式为Y=-5.035x+17.797，见图2，相关系数高，具体为R 2=0.989(大于0.98)，满足实时荧光定量PCR检测的要求，可用于石蒜绵粉蚧的定量快速检测分析。
实施例7：荧光引物和探针的种特异性检验
以6种绵粉蚧DNA为模板，重组质粒为阳性对照、ddH2O为阴性对照，进行TaqmanqRT-PCR特异性检测。检测结果显示，仅石蒜绵粉蚧和重组质粒发出明显的荧光信号，有明显的扩增曲线生成，见图3所示，而其他5种绵粉蚧和阴性对照均无扩增，说明本专利设计的引物和探针具有较好的特异性。此检测体系可用于石蒜绵粉蚧的检测鉴定分析。
实施例8：荧光引物和探针的灵敏性检测
对纯化各稀释度的重组质粒进行Taqman qRT-PCR检测检测,结果显示DNA含量为10ng/uL、1.0ng/ul、100pg/ul、10pg/uL、1.0pg/uL、100fg/uL时都能检测到明显的阳性扩增；而低于100fg/uL浓度的DNA表现为阴性扩增,无荧光信号的增加。由此可见,所建立的Taqman qRT-PCR最低可检测到100fg/uL，见图4所示。
Claims (7)
1.一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的引物，其特征在于，包括上游引物PsF1、下游引物PsR1，其核苷酸序列分别如下所示：
PsF1:5’-TAGATTCTGACTTCTTTTACCTTCT-3’；
PsR1：5’-TTAAGGTAATAAAATTTTGATT-3’；
所述PsF1/PsR1的扩增产物长度为125bp。
2.一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的探针，其特征在于，所述探针为PsProbe，其核苷酸序列为5’-ATACAGGTTGAACTTTATATCCTCCTT-3’， 5’端标记的荧光基团是FAM，3’端标记的淬灭基团是BHQ1。
3.一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括权利要求1所述的PCR引物和权利要求2所述的PCR探针。
4.如权利要求3所述的基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或全部：(1)模板；(2)阳性对照和阴性对照；(3)PCR预混液。
5.如权利要求4所述的基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为重组质粒，阴性对照为ddH2O,所述PCR预混液为大连宝生物公司生产的TakaraPremix Ex Tag。
6.一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）待检样品DNA的提取；
2）荧光定量PCR反应体系的配制：将步骤1）中提取的待检样品DNA加入荧光定量PCR反应体系，所述荧光定量PCR反应体系中含有权利要求1或2中所述的引物和探针；
3）标准质粒构建：利用引物对PsF1/PsR1对石蒜绵粉蚧DNA进行常规PCR扩增；得到目的片段与PUC57连接，再对连接产物进行转化，得到转化了质粒的菌落；挑取单克隆菌落接种于培养液中培养；利用质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，用于PCR鉴定并送杭州擎科生物有限公司进行测序验证；质粒鉴定正确后，用分光光度计测定质粒浓度，定量后作为本发明方法的基因标准品；
4）荧光定量PCR扩增：设置阳性对照和阴性对照，将配好的荧光定量PCR反应体系于荧光定量PCR扩增仪上进行反应，反应程序如下：预变性95℃5min；然后变形95℃10sec，58℃C30sec，循环40次，反应结束后，保存文件，打开分析软件；
5）结果判断：通过观察荧光定量PCR的扩增情况判断检测结果。
7.如权利要求6所述的一种基于荧光定量PCR检测石蒜绵粉蚧的方法，其特征在于荧光定量PCR反应体系为20μL反应体系，其含有10μM上下游引物各0.4μL，ROX Reference DyeⅡ0.5μL，DNA模板2μL，10μM TaqMan探针0.8μL，加ddH2O至20μL。
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