CN106521018A - 一种高通量检测含nos终止子的转基因玉米的引物及方法 - Google Patents

一种高通量检测含nos终止子的转基因玉米的引物及方法 Download PDF

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郑秀婷
熊艳文
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Abstract

本发明涉及分子生物学，具体公开了一种高通量的利用竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)方法检测含NOS终止子的转基因玉米的引物及方法。所述引物如SEQ ID No.1～4所示，为了适用于KASP反应检测，在正向引物的5’端连接荧光标签序列。利用本发明所提供的引物进行检测，一次检测样本量最高可达5376个，检测的通量要大大地优于普通PCR和TaqMan探针法荧光定量PCR；检测时，只需要扫描PCR产物的荧光信号就可以判断结果，而不需要进行电泳，简单快捷；KASP反应利用的是通用型的探针，相比TaqMan探针法荧光定量PCR，极大节省了成本。

Description

一种高通量检测含NOS终止子的转基因玉米的引物及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及利用KASP技术检测含NOS终止子的转基因玉米的引物及方法。
背景技术
对转基因作物及其产品的检测是转基因生物安全管理的基础。目前大部分转基因作物品种都含有NOS终止子这个外源成分，因此对NOS终止子的筛查是转基因检测当中最重要的检测项目之一。
目前常用的转基因的检测方法为普通PCR技术和荧光定量PCR技术，但二者均存在不足与缺陷，限制了转基因检测的推广。普通PCR技术需要电泳以及紫外观察的过程，操作繁琐，耗时长，难以实现高通量检测。荧光定量PCR技术的不足包括：(1)检测成本昂贵。荧光定量PCR使用的荧光探针是基因特异性探针，成本很高。如果探针的效果不好，还需要重新设计探针。(2)难以实现高通量检测。一般情况下，一台荧光定量PCR仪器一次只能做96或者384个反应，能检测的样本数量有限，不适合大批量检测。(3)自动化程度不高。目前情况下，构建荧光定量PCR反应体系的过程主要依靠手工操作，容易导致实验误差和实验污染。
因此，亟需开发一种高通量、低成本、简单快捷以及低错误率的转基因作物的检测方法。竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)是一种基于荧光检测的基因分型技术。进行检测的时候，每个反应孔采用双色荧光(一般是FAM荧光和HEX荧光)检测样本某一位点可能的两种基因型。该技术现阶段主要被应用于SNP基因分型研究中，成为分子辅助育种、性状基因的精细定位以及种子资源鉴定的主要技术手段。但是目前尚未见到利用KASP技术来检测含NOS终止子的转基因玉米的报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高通量检测含NOS终止子的转基因玉米的引物及方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了用于检测含NOS终止子的转基因玉米的引物组合，包括：
(1)NOS终止子特异性检测引物：
NOS终止子正向引物：5’-CGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’；
NOS终止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；
(2)内源基因zSSIIb特异性检测引物：
zSSIIb正向引物：5’-ATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’；
zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’。
进一步地，为了适用于KASP反应检测，在上述正向引物的5’端连接荧光标签序列，如下：
(1)NOS终止子特异性检测引物：
连接FAM荧光标签序列的NOS终止子正向引物：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’(下划线处是FAM标签序列)；
NOS终止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；
(2)内源基因zSSIIb特异性检测引物：
连接HEX荧光标签序列的zSSIIb正向引物：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’(下划线处是HEX标签序列)；
zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’。
检测内源基因的目的在于监控DNA提取和KASP反应等过程中是否出现了问题。
进一步地，含有前述引物组合的试剂和试剂盒也在本发明的保护范围之内。
第二方面，本发明提供了前述引物组合在检测含NOS终止子的转基因玉米中的应用。
具体可体现为一种检测含NOS终止子的转基因玉米的方法，包括如下步骤：
S1、提取样品基因组DNA；
S2、以基因组DNA为模板，利用前述引物组合进行KASP反应检测；其中，NOS终止子正向引物的5’端连接FAM荧光标签序列，zSSIIb正向引物的5’端连接HEX荧光标签序列；
即：
连接FAM荧光标签序列的NOS终止子正向引物：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’(下划线处是FAM标签序列)；
NOS终止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；
连接HEX荧光标签序列的zSSIIb正向引物：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’(下划线处是HEX标签序列)；
zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’；
S3、KASP反应结束后检测产物的荧光信号，如果从样品中仅检测到HEX荧光，则判定该样品为不含NOS终止子的玉米；如果从样品中同时检测到HEX荧光和FAM荧光时，则判定该样品为含NOS终止子的玉米。
作为优选，本发明优化了KASP反应的反应条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。
满足上述条件的KASP反应，能提高扩增产物的特异性。
进一步地，本发明优化了KASP反应的反应体系，具体为：
反应体系组分 终浓度 体积(μL)
100μM NOS终止子正向引物 0.17μM 0.0051
100μM NOS终止子反向引物 0.42μM 0.0126
100μM zSSIIb正向引物 0.17μM 0.0051
100μM zSSIIb反向引物 0.42μM 0.0126
2x KASP Master Mix 1x 1.5
超纯水 1.4646
总体积 3
(注：为节省反应体积，DNA模板已经提前加入到PCR反应板中并且烘干。)
更进一步地，为了提高检测结果的准确性，本发明检测方法中还设有正对照模板，负对照模板以及空白对照。其中，正对照模板为含NOS终止子的转基因玉米DNA以及含NOS终止子的质粒；负对照模板为不含NOS终止子的非转基因玉米DNA；空白对照为水。
通过LGC SNPLine仪器平台的replicator或者96通道的移液器将玉米样品及其对照样品的DNA转移到384孔反应板中，DNA样品分配之后，反应板在2000rpm离心5分钟，然后放在65℃温箱里干燥30分钟，之后取出备用。
KASP反应完成后利用LGC SNPLine仪器平台的Pherastar对KASP反应产物进行扫描并且将收集到的荧光信号转化成样品基因分型的散点图。在散点图中，横坐标是代表是KASP反应产物的FAM荧光值，纵坐标代表的它的HEX荧光值。
根据样品产物荧光值可以判断它们是否含有NOS终止子。如果从某样品中仅检测到HEX荧光，则判定该样品为不含NOS终止子的玉米；如果从某样品中同时检测到HEX荧光和FAM荧光时，则判定该样品为含NOS终止子的玉米；当样品出现在原点附近，即该样品通过KASP反应没有生成zSSIIb或NOS终止子，表明该样品在DNA提取或者KASP反应体系构建过程中出现了问题，需要重新检测其基因型。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了对含有外源基因片段NOS终止子的转基因玉米进行KASP检测的方法以及相应的引物组合。所述引物组合中，一对引物用于扩增植物内源基因，另外一对引物用于扩增外源NOS终止子片段。在引物设计的时候，内源基因zSSIIb正向引物的5'端添加了HEX的标签序列，外源NOS终止子的正向引物的5'端添加了FAM的标签序列。
本发明通过对引物设计与严格筛选，选择到了一组特异性好、灵敏度高的引物组合。该引物组合应用于KASP检测时，能够表现出优异的特异性，能够准确地区分含有NOS终止子的玉米和不含NOS终止子的玉米。
不仅如此，本发明还具有以下优势：
(1)高通量：不同于荧光定量PCR是每个循环都进行荧光的检测，KASP反应的荧光扫描是在反应终点进行，所以KASP可以先进行大批量的PCR扩增，反应结束后再集中进行荧光扫描检测。利用水浴PCR仪可以同时进行14块384孔板即5376个KASP反应，目前荧光定量PCR的仪器每次能进行的反应数一般是96或者384，所以KASP检测的通量是荧光定量PCR的14倍，检测效率远远高于荧光定量PCR。
(2)自动化程度高：KASP反应体系构建已经实现了自动化，这样不仅能省了操作者的时间和人力，而且能有效降低了出错的概率。
(3)低成本：KASP的荧光探针是通用的。试剂盒本身就含有通用的荧光探针，不需要为了某一个基因而去合成特异性的探针，相比于TaqMan探针法荧光定量PCR，能大大地节省成本。另外KASP的反应体系可以少至1～3μL，而荧光定量PCR需要至少5μL，所以KASP节省了反应液的使用。
(4)过程简单：由于KASP检测是通过荧光扫描的方式对产物进行检测，整个扫描的过程能在1分钟之内完成，不要做电泳，所以相对普通PCR，KASP检测能大大地节省时间。
本发明成功地利用KASP技术对含有NOS终止子的玉米进行了筛选。由于KASP检测只需要扫描产物的荧光信号就可以判断结果，而不需要进行电泳，因此简单快捷；不同于荧光定量PCR需要针对目标基因设计特异性的荧光探针，KASP利用的是通用型的探针，极大节省了成本；另外KASP技术的操作平台LGC具有高通量和自动化的优点。基于上述优点，KASP方法将有机会在未来的转基因检测中发挥重要的作用。
附图说明
图1为KASP法检测样品基因型的点簇分布图。
图2为利用不同引物组合检测样品基因型的点簇分布图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、DNA模板的准备
分别取1个非转基因玉米先玉335和8个含NOS终止子的转基因玉米样品(表1)的幼嫩叶片100mg，按照CTAB的方法提取DNA。准备含NOS终止子的大肠杆菌的质粒pLangutou-1，同时准备pLangutou-1与先玉335DNA的混合物。pLangutou-1是本实验室构建的质粒，大小为5865bp。上述DNA将作为KASP反应的模板，每个样品设2个平行重复，同时以无菌水代替模板作为阴性对照。
表1：样品的基因型
样品名称 样品基因型
pLangutou-1 含NOS终止子
pLangutou-1和先玉335混合物 含NOS终止子、zSSI Ib
LPM20 含NOS终止子、zSSI Ib
LPM82 含NOS终止子、zSSI Ib
LPM83 含NOS终止子、zSSI Ib
LPM88 含NOS终止子、zSSI Ib
LPM92 含NOS终止子、zSSI Ib
LPM95 含NOS终止子、zSSI Ib
LPM98 含NOS终止子、zSSI Ib
LPM100 含NOS终止子、zSSI Ib
先玉335 含zSSI Ib
2、引物的设计和合成
根据Genbank中基因片段的序列及KASP反应对引物的要求，我们分别设计了NOS终止子和玉米内源基因zSSIIb特异性引物，其中NOS终止子的正向引物kTNOS-F4的5'端连接FAM标签序列，zSSIIb基因的正向引物zSSIIb-F4的5'端连接HEX标签序列(表2)。引物由invitrogen公司合成。
表2：KASP反应的引物
注:kTNOS-F4引物序列中下划线区域为FAM标签序列，zSSIIb-F4引物序列中下划线区域为HEX标签序列
3、KASP反应体系的构建
为了减少DNA所占体积，首先在PCR反应板中加入适量DNA，一般情况下玉米样品的DNA上样量为60ng，pLangutou-1上样量为0.0001ng。DNA样品转移到PCR板的过程是通过LGCSNPLine仪器平台的全自动化液体处理工作站Replicator实现的。DNA样品转移完成之后，将PCR反应板在2000rpm离心1分钟，然后放在65℃温箱里烘干30分钟，之后取出反应板放置常温备用。
将KASP Master Mix、NOS终止子引物(kTNOS-F4和kTNOS-R4)以及zSSIIb引物(zSSIIb-F4和zSSIIb-R4)按表4所示的比例进行混合，其中KASP Master Mix从LGC公司购买，它含有FAM、HEX荧光染料、淬灭基团、高保真的Taq酶、dNTP以及缓冲液。
通过LGC SNPLine仪器平台的Meridian将表3的混合液转移到到步骤1中已经加了DNA模板的PCR反应板。加样完成之后，反应板需要封膜和离心。
表3：KASP反应体系的构建
反应体系组分 终浓度 体积(μL)
100μM kTNOS-F4 0.17μM 0.0051
100μM kTNOS-R4 0.42μM 0.0126
100μM zSSIIb-F4 0.17μM 0.0051
100μM zSSIIb-R4 0.42μM 0.0126
2x KASP Master Mix 1x 1.5
超纯水 1.4646
总体积 3
(注：为节省反应体积，DNA模板已经提前加入到PCR反应板中并且烘干。)
3、KASP反应
将加样完毕的PCR反应板放置于LGC SNPLine仪器平台的水浴PCR仪中进行KASP反应，反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个TouchDown循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。
4、结果分析
反应结束后，利用LGC SNPLine仪器平台的Pherastar对KASP反应产物进行扫描，可以得到每一个样品产物的FAM和HEX荧光值。系统对这些荧光值处理并且生成散点图，图形中每一个点代表相对应了一个样品的荧光值，横坐标是代表是这个样品KASP反应产物的FAM荧光值，纵坐标代表的它的HEX荧光值。
根据样品产物荧光值可以判断它们是否含有NOS终止子。如果从某样品中仅检测到HEX荧光，则判定该样品为不含NOS终止子的玉米；如果从某样品中能检测到HEX荧光和FAM荧光时，则判定该样品为含NOS终止子的玉米；如果从样品中仅检测到FAM荧光，则判定该样品为含NOS终止子的质粒。由表4可以发现对样品基因型的判定和它们本身基因型的信息是完全一致的，表明在该检测中所使用的引物以及方法是准确和可靠的。
表4：对检测样品基因型的判定
实施例2引物的选择
在KASP检测当中，引物对于样品基因型的鉴别至关重要。为了能准确和高效地鉴定含NOS终止子的转基因玉米，为NOS终止子和zSSIIb各设计了三对特异性扩增的引物(表5)并且进行了两两配组(表6)，利用不同的引物配组对表1的样品进行了检测。根据KASP产物的基因型点簇分布图(图2)可以发现：当利用引物配组A、B、C、D、E、F、I进行KASP检测时，检测的结果跟样品本身的基因型不完全一致。利用引物配组G和H进行KASP检测，检测的结果跟样品本身的基因型一致，但是引物配组H的效果要优于G。因此选择引物配组H来进行NOS终止子检测。
表5：NOS终止子和zSSIIb的引物序列
表6：NOS终止子和zSSIIb的KASP引物配组
实施例3与TaqMan探针法荧光定量PCR的一致性
为了验证本发明的准确性，实验室选取了101份未知基因型的玉米叶片样本，分别采用TaqMan探针法荧光定量PCR与KASP方法对样品进行了检测，分析两种方法检测结果的一致性。由表7可以看出，在101份样品中，只有3份样品的结果不一致，两种方法检测结果的一致性达97％，因此认为用KASP检测含NOS终止子玉米的方法是准确和可靠的。
表7:不同方法检测结果的对比分析
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 华智水稻生物技术有限公司
<120> 一种高通量检测含NOS终止子的转基因玉米的引物及方法
<130> KHP161117614.2
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgttcaaaca tttggcaata aa 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aagaccggca acaggattc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atctgctccg aagcaaagtc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cactcgttcc gttttgcatt 20
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc tcgttcaaac atttggcaat aaa 43
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat tatctgctcc gaagcaaagt c 41

Claims (9)

1.一种高通量检测含NOS终止子的转基因玉米的引物组，其特征在于，包括：
(1)NOS终止子特异性检测引物：
NOS终止子正向引物：5’-CGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’；
NOS终止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；
(2)内源基因zSSIIb特异性检测引物：
zSSIIb正向引物：5’-ATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’；
zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，包括：
(1)NOS终止子特异性检测引物：
连接了FAM荧光标签序列的NOS终止子正向引物：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’；
NOS终止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；
(2)内源基因zSSIIb特异性检测引物：
连接了HEX荧光标签序列的zSSIIb正向引物：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’；
zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’。
3.含有权利要求1或2所述引物组合的试剂或试剂盒。
4.权利要求1或2所述的引物组合在检测含NOS终止子的转基因玉米中的应用。
5.一种高通量检测含NOS终止子的转基因玉米的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、提取样品的基因组DNA；
S2、以基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组合进行KASP反应检测；
S3、KASP反应结束后检测产物的荧光信号，若只检测到HEX荧光信号，则判断该样品为不含NOS终止子的玉米；若同时检测到FAM与HEX两种荧光信号，则判断该样品为含NOS终止子的转基因玉米。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，KASP反应的反应条件为：
94℃预变性15分钟；
第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；
第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，KASP反应的反应体系为：
终浓度 体积(μL) 100μM kTNOS-F4 0.17μM 0.0051 100μM kTNOS-R4 0.42μM 0.0126 100μM zSSIIb-F4 0.17μM 0.0051 100μM zSSIIb-R4 0.42μM 0.0126 2x KASP Master Mix 1x 1.5 DNA 60ng 总体积 加超纯水至3μL。
8.根据权利要求5～7任一项所述的方法，其特征在于，所述检测方法中还设有正对照模板，负对照模板以及空白对照。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，正对照模板为含NOS终止子的转基因玉米DNA以及含NOS终止子的质粒；负对照模板为不含NOS终止子的非转基因玉米DNA；空白对照为水。
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