CN111218520A - 转基因大豆gts-40-3-2品系efirm检测探针及其应用 - Google Patents

转基因大豆gts-40-3-2品系efirm检测探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开转基因大豆GTS‑40‑3‑2品系EFIRM检测探针及其应用。所述检测探针包括SEQ ID NO.1‑4的核苷酸序列。本发明针对转基因大豆GTS‑40‑3‑2品系特异性基因，自主设计了EFIRM法检测转基因大豆GTS‑40‑3‑2品系的特异性捕获探针和杂交探针，采用EFIRM技术对食品及饲料中转基因大豆GTS‑40‑3‑2品系成分进行定性检测。本发明对提高食品和饲料中转基因大豆GTS‑40‑3‑2品系的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测进出口和国内市场上相关转基因产品，进行食品安全转基因监测和提高转基因检测技术具有重要意义，具有广阔发展前景。

Description

转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM检测探针及其应用
技术领域
本发明属于食品和农产品转基因安全检测和监测领域，具体涉及一种食品和饲料中转基因大豆GTS-40-3-2品系应用EFIRM法特异性检测探针，以及相关的试剂盒、 检测方法、其方法建立等。
背景技术
电场诱导的释放与检测技术(Electric Field-induced Release andMeasurement， EFIRM)是一项革新的技术，创造性地采用超高活性分子探针固定、电场瞬间捕获靶 标分子、捕获分子信号特异放大三大核心专利技术，从而实现无需PCR扩增，直接检测痕量靶标分子。与传统的PCR技术相比，兼具精准可靠、快速便捷、经济的明显优 势。EFIRM技术主要用于液体活检无创基因精准检测、肿瘤早期诊断，外泌体生物标 志物和多重生物标志物的检测。目前，EFIRM技术在食品安全、转基因检测领域的应 用仍为空白。本发明创新性将EFIRM技术应用于转基因大豆检测，自主设计转基因大 豆GTS-40-3-2品系EFIRM特异性检测捕获探针和杂交探针，建立转基因大豆 GTS-40-3-2品系EFIRM特异性检测方法，研制转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM特异 性检测试剂盒。
转基因大豆GTS-40-3-2品系是美国孟山都公司研发的抗草胺磷除草剂的转基因大豆品种，1994年已获美国官方批准用于生产种植、食用和饲用，并相继在欧盟、加 拿大、巴西、阿根廷、澳大利亚、日本、韩国、墨西哥、南非等国获准进行商业化种 植或作为食品原料进口。经对相关检测结果报告进行严格审查后，该品系已于2004 年被我国批准许可进口及使用。
目前，国内对转基因大豆GTS-40-3-2及其衍生品种的检测方法主要有实时荧光PCR方法、基因芯片方法、LAMP检测方法、普通PCR方法和PCR-DHPLC检测方法。 这些方法各有优缺点，由于以上方法均需要通过PCR反应来扩增目标基因片段的数 量，因此都无法避免基因扩增造成的气溶胶污染，对实验环境以及实验人员的要求很 高，标准实验室造价高昂，整体运行成本高，也无法进行现场检测，影响进出口转基 因大豆快速通关。
转基因产品检测方法是转基因产品安全监管实施的核心技术依据，更快速高效、更准确灵敏和低成本的转基因检测技术能为转基因产品安全监管提供更有力的技术支撑。电场诱导的释放与检测技术(EFIRM)是一项革新的技术，采用EFIRM技术不存 在基因扩展造成的污染问题，无需建立扩增实验室，使得检测操作更简便易行。如果 针对具体的检测物建立准确灵敏、高效便捷的检测过程是该技术得以深入利用的关键。
发明内容
本发明将EFIRM检测技术应用于转基因大豆GTS-40-3-2品系检测，利用EFIRM检测技术可以探测两种电流信号，针对大豆GTS-40-3-2品系特异性序列和大豆内源 Lectin基因设计合适的探针，旨在通过一次实验同时测得品系特异序列和内源基因的电 流信号。藉此为我国进出口贸易提供更加准确、可信的转基因成分检测数据，满足欧 盟及其他国家标识要求，打破国外对我国出口产品所设置的转基因技术壁垒，并为相 关部门对转基因大豆及其制品的监控、安全评价和风险预警等提供技术支持。
基于以上目的，本发明首先针对转基因大豆GTS-40-3-2品系特异性基因片段，设计并筛选出灵敏度及特异性最高的捕获探针和杂交探针。本发明的转基因大豆 GTS-40-3-2品系EFIRM检测探针，包括GTS-40-3-2检测探针和Lectin检测探针，其中：
GTS-40-3-2检测探针包括碱基序列为SEQ ID NO.1的GTS-40-3-2捕获探针以及碱基序列为SEQ ID NO.2的GTS-40-3-2杂交探针；
SEQ ID NO.1：AGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCAAAAAAAA；
SEQ ID NO.2：biotin-GCGCGCGTTAATTTGTGCCATTCTTGAAAGATCTGCT；
Lectin检测探针包括碱基序列为SEQ ID NO.3的Lectin捕获探针以及碱基序列为SEQ ID NO.4的Lectin杂交探针：
SEQ ID NO.3：TTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGGAAAAAAAA；
SEQ ID NO.4：biotin-GTAGTAGTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAG。
进一步，结合电场及洗涤条件优化，建立转基因大豆GTS-40-3-2品系高通量、精准鉴定方法，并开发了基于EFIRM技术的转基因成分快速检测试剂盒。该试剂盒中特 征性地含有上述本发明的转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM检测探针。
再一方面，本发明提供转基因大豆GTS-40-3-2品系的EFIRM检测方法，包括使用上述本发明的转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM检测探针对样品DNA进行EFIRM检 测的步骤。
本发明成功筛选出转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM检测探针，建立转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM检测方法。该方法能够实时监测反应进程，无需电泳，闭管操 作，能够避免样品中受到操作人员和环境的污染等；并能够对结果进行快速判定。并 且具有良好的稳定性和特异性，方法简单，检验时间短，易于推广。其推广应用对提 高食品中转基因大豆GTS-40-3-2品系的检测效率及灵敏度，降低检测成本，进行食品 安全监测和提高检验检疫技术具有重要意义。
附图说明
本发明附图1是大豆样品EFIRM检测信号值。
具体实施方式
本发明首先提供用于转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM检测的探针，并在此基础上设计含有所述探针化合物的试剂盒，以及应用探针进行EFIRM检测的方法。
所述的试剂盒中，除了含有碱基序列为SEQ ID NO.1～4的检测探针外，还包含表面固定特异性探针的96孔e-plate板，反应试剂，检测试剂和洗涤溶液。容易理解，除 特异性探针外的其他组分及其含量可以根据本领域现有技术进行设计。将微量待测样 品基因组DNA样本与检测试剂加入相应反应孔当中，整个检测在半小时至一小时之内 完成；并实现一次检测，即可同时完成大豆转基因品系高效、精准鉴定目的。
更为具体地，本试剂盒中还可以包括阳性对照、阴性对照、空白对照。其中，阳 性对照可以选择转基因大豆GTS-40-3-2品系标准品提取的DNA，内参照可以选择大 豆Lectin内源基因DNA，阴性对照可以选择不含有转基因大豆GTS-40-3-2成分的样 品提取的DNA，空白对照可以选择灭菌水，也可以每组各设置两个或多个平行的反应 体系。
进一步地，基于上述特异性探针及试剂盒设计，本发明进一步提供转基因大豆GTS-40-3-2品系的EFIRM检测方法，包括使用本发明的特异性EFIRM检测探针对样 品DNA进行EFIRM检测的步骤。具体的实施方式中，所述检测方法包括如下步骤：
①打开EFIRM软件，完成Layout设置；
②在不同的E-plate反应孔内分别加入GTS-40-3-2捕获探针和Lectin捕获探针，启动EFIRM软件，完成捕获探针固定步骤，使用EFIRM洗液清洗反应孔；
③把待检的大豆核酸样本与杂交液按体积比1:1的比例混合均匀后上样，对照品直接上样检测，启动EFIRM软件，完成样本与捕获探针杂交步骤，使用EFIRM洗液 清洗反应孔；
④在相应的E-plate反应孔内分别加入GTS-40-3-2检测探针和Lectin检测探针，启动EFIRM软件，完成样本与检测探针杂交步骤，使用EFIRM洗液清洗反应孔；
⑤把HRP反应液加入E-plate反应孔内，启动EFIRM软件，完成标记固定步骤， 使用EFIRM洗液清洗反应孔；
⑥将显色液到加入E-plate反应孔内，启动EFIRM软件，进行电流信号读数,使 用超纯水清洗反应孔。
检测结果依据下述标准进行判定：以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
①阈值设定：GTS-40-3-2和Lectin检测孔阈值设定100nA(杂交液信号值+42)；
②阴性对照(NC)，电流值应小于100nA，否则此次实验结果无效，需重新试验；
③阳性对照(PC)，电流值应大于100nA，否则此次实验结果无效，需重新试验。
在符合质量控制标准的情况下，结果判定标准如表1:
表1
Figure BDA0002248959150000041
当样品检测结果电流值小于或等于临界值时，则该样品为非转基因大豆 GTS-40-3-2品系或低于本方法的检测下限。
上述检测方法中所述及的待检的大豆核酸样本可由本领域通常技术方案制备，本发明中举例由下述方法制备：
①称取100mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB缓冲液和 10μL浓度为20mg/μL蛋白酶K，65℃30min振荡混匀；12000r/min离心5min，吸 取上清液至一新离心管中，加400μL的体积比为24:1的三氯甲烷-异戊醇混合溶液， 充分混匀；
②12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇， 室温下沉淀1～2h；
③12000r/min离心10min，弃上清液；70％乙醇洗涤一次，晾干；加入50μL TE， 溶解DNA沉淀；
④DNA浓度和纯度的测定：取步骤③获得的DNA溶液加水稀释，至浓度为10 μg/mL～100μg/mL，A260/A280比值在1.7～1.9之间，备用。
通过以上技术方案，本发明最后确定所述方法对转基因大豆GTS-40-3-2品系的最低检出限(LOD)为0.1％。本发明建立了对食品和饲料中转基因大豆GTS-40-3-2品 系的定性检测方法，具有广泛的应用价值，还能对我国转基因大豆GTS-40-3-2品系的 国际贸易起到积极的作用。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
(一)待测样品：检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以转基因 大豆GTS-40-3-2标准品提取的DNA为阳性对照，以已知不含有转基因大豆 GTS-40-3-2品系的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照，每组各设置 两个平行的反应体系。
(二)检测方法
(1)DNA提取
下述DNA提取方法，均为本领域技术人员的常规操作，所有试剂及溶液均为常 规途径制备或者由商业途径获得。
①称取100mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB缓冲液(55 mmol/LCTAB，1400mmol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris，用10％盐 酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。)和10μL蛋白酶K(20mg/μL)， 振荡混匀，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀；12000r/min离心5min，吸取上 清液至一新离心管中，加400μL三氯甲烷：异戊醇(24：1)，充分混匀；
②12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇， 室温下沉淀1～2h；
③12000r/min离心10min，弃上清液；70％乙醇洗涤一次，晾干；加入50μL TE， 溶解DNA沉淀。
④DNA浓度和纯度的测定：
取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分 光光度计测260nm和280nm处的吸收值。当浓度为10μg/mL～100μg/mL，A260/A280 比值在1.7～1.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。
(2)EFIRM检测
①引物信息：
捕获探针(CP)和杂交探针(DP)由宝生物工程(大连)有限公司合成；
针对转基因大豆GTS-40-3-2品系特异性序列和大豆内源Lectin基因设计合适的探 针详见表1。
②EFIRM检测方法
I.打开EFIRM软件，完成Layout设置。
II.在不同的E-plate反应孔内分别加入GTS-40-3-2捕获探针和Lectin捕获探针反 应液，启动EFIRM软件，完成捕获探针固定步骤，使用EFIRM洗液清洗反应孔。
III.待检的大豆核酸样本与杂交液按1:1的比例混合均匀后上样，对照品直接上样 检测，启动EFIRM软件，完成样本与捕获探针杂交步骤，使用EFIRM洗液清洗反应 孔。
IV.在相应的E-plate反应孔内分别加入GTS-40-3-2检测探针和Lectin检测探针反 应液，启动EFIRM软件，完成样本与检测探针步骤，使用EFIRM洗液清洗反应孔。
V.把HRP反应液加入E-plate反应孔内，启动EFIRM软件，完成标记固定步骤， 使用EFIRM洗液清洗反应孔。
VI.把显色液到加入E-plate反应孔内，启动EFIRM软件，进行电流信号读数,使 用超纯水清洗反应孔。
实施例2特异性试验
使用Lectin探针检测信号作为内参，EPSPS探针检测信号作为判定是否为转基因大豆GTS-40-3-2品系。测试结果与实时荧光PCR检测结果进行对比，使用转基因大 豆GTS-40-3-2品系核酸提取物在EFIRM电化学检测平台上进行准确性和特异性验 证。检测电流信号如图1所示，检测结果判断如表2所示。结果表明检测了32例转基 因大豆GTS-40-3-2样本和32例非转基因大豆GTS-40-3-2样本，与实时荧光PCR比 较结果均符合；转基因大豆DP356043品系、DP305423品系、DAS 68416-4品系、 A5547-127以及非转基因大豆、小麦、糙米、绿豆、玉米、雪豆、花豆、黑小豆、豌 豆等样品均未出现GTS-40-3-2品系检测信号，因此，转基因大豆GTS-40-3-2品系 EFIRM特异性和准确度均达100％。
实施例3检测灵敏度及添加试验
将含GTS-40-3-2品系探针和Lectin探针对所对应序列的DNA，分别稀释至1nM、100pM、50pM、10pM、5pM、1pM、0.5pM、0.1pM作为模板。本测试中，不同检测 样本包括阴性组和阳性组，阴性组为探针对的不对应序列(本文使用Lectin-oligo作为 GTS-40-3-2品系探针对的阴性组，GTS-40-3-2-oligo作为Lectin探针对的阴性组)， 阳性组为探针对所对应的序列(使用GTS-40-3-2-oligo作为GTS-40-3-2探针对的阳性 组，Lectin-oligo作为Lectin探针对的阳性组)，每个样本设置10平行孔，重复3次 实验，确认方法的测试灵敏度。灵敏度试验结果如表2示，使用EFIRM技术检测转基 因大豆可检测低至0.5pM的序列含量的样本，检测灵敏度高；检测得到的数值的变动 范围均在15％以下，有的甚至低至1％左右，均符合要求(小于20％)，检测稳定性 好。此外，检测不同浓度的阴性样品和阳性样本，其检测数值均有很好的线性关系。
表2最低检测浓度测试结果
Figure BDA0002248959150000071
按表3称取所需质量大豆样本，以已知非转基因大豆为基质，混合后使掺杂比分别为100％、60％、30％、10％、0％，提取核酸样本后进行EFIMR检测。1％混杂提取DNA 进行10倍稀释至0.1，检测结果如表3示，EFIRM电化学检测可检测出0.1％转基因大豆 GTS-40-3-2，即方法的检测低限为0.1％。
表3转基因大豆GTS-40-3-2品系掺杂检测结果
Figure BDA0002248959150000081
实施例4方法的应用
选取实际检测样品，样品来源为大连海关进出口送检样品，或商业途径采购的大豆制品等。采用本发明实施例1所述方法，检测待测样品中是否含有转基因大豆 GTS-40-3-2品系成分。同时应用传统实时荧光PCR法进行方法学比对。样品名称及结 果如表4。
表4实际样品检测结果
Figure BDA0002248959150000082
表4中，
a：不含有转基因大豆GTS-40-3-2品系成分的样品数
b：含有转基因大豆GTS-40-3-2品系成分的样品数
c：含有转基因大豆GTS-40-3-2品系成分(与标识不符)的样品数
d：不含有转基因大豆GTS-40-3-2品系成分(与标识不符)的样品数
由以上检测结果可见，运用本标准方法检测大豆样品共133份。其中94份大豆为非转基因大豆GTS-40-3-2品系样品，3份样品检测出含有转基因大豆GTS-40-3-2品系 成分，其中有7份样品申报或标识为非转基因大豆，但是检测出转基因大豆GTS-40-3-2 品系成分，与样品标识不符。检测已知标识含有转基因大豆GTS-40-3-2品系豆粕等饲 料加工品21份，都检测出转基因大豆GTS-40-3-2品系成分。检测豆腐、豆浆、豆奶、 腐竹、豆皮等豆制加工食品45份，其中36份未检测出含有转基因大豆GTS-40-3-2品 系成分；9份样品未标识为转基因大豆，但是检测出转基因大豆GTS-40-3-2品系成分， 与样品标识不符。以上检测结果均与实时荧光PCR法检测结果相符。由大量的实际应 用结果可见，应用本方法设计的探针、建立的EFIRM快速检测方法及试剂盒，检测食 品及饲料中转基因大豆GTS-40-3-2品系具有很好适用性、良好的稳定性，特异性，可 以有效地定性检测转基因大豆GTS-40-3-2品，可用以满足转基因产品检测的要求。
序列表
<110> 大连海关技术中心
<120> 转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM检测探针及其应用
<130> GZ191076
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
agagtcagct tgtcagcgtg tcaaaaaaaa 30
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
gcgcgcgtta atttgtgcca ttcttgaaag atctgct 37
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
ttgaaggaag cggcgaagct ggaaaaaaaa 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
gtagtagtgt caggggcata gaaggtgaag 30

Claims (5)

1.转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM检测探针，包括GTS-40-3-2检测探针和Lectin检测探针，其中：
GTS-40-3-2检测探针包括碱基序列为SEQ ID NO.1的GTS-40-3-2捕获探针以及碱基序列为SEQ ID NO.2的GTS-40-3-2杂交探针；
SEQ ID NO.1：AGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCAAAAAAAA；
SEQ ID NO.2：biotin-GCGCGCGTTAATTTGTGCCATTCTTGAAAGATCTGCT；
Lectin检测探针包括碱基序列为SEQ ID NO.3的Lectin捕获探针以及碱基序列为SEQID NO.4的Lectin杂交探针：
SEQ ID NO.3：TTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGGAAAAAAAA；
SEQ ID NO.4：biotin-GTAGTAGTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAG。
2.转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM检测探针。
3.转基因大豆GTS-40-3-2品系的EFIRM检测方法，其特征在于包括使用权利要求1所述的转基因大豆GTS-40-3-2品系EFIRM检测探针对样品DNA进行EFIRM检测的步骤。
4.根据权利要求3所述的转基因大豆GTS-40-3-2品系的EFIRM检测方法，包括如下步骤：
①打开EFIRM软件，完成Layout设置；
②在不同的E-plate反应孔内分别加入GTS-40-3-2捕获探针和Lectin捕获探针，启动EFIRM软件，完成捕获探针固定步骤，使用EFIRM洗液清洗反应孔；
③把待检的大豆核酸样本与杂交液按体积比1:1的比例混合均匀后上样，对照品直接上样检测，启动EFIRM软件，完成样本与捕获探针杂交步骤，使用EFIRM洗液清洗反应孔；
④在相应的E-plate反应孔内分别加入GTS-40-3-2检测探针和Lectin检测探针，启动EFIRM软件，完成样本与检测探针杂交步骤，使用EFIRM洗液清洗反应孔；
⑤把HRP反应液加入E-plate反应孔内，启动EFIRM软件，完成标记固定步骤，使用EFIRM洗液清洗反应孔；
⑥将显色液到加入E-plate反应孔内，启动EFIRM软件，进行电流信号读数,使用超纯水清洗反应孔。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述待检的大豆核酸样本通过下述方法制备：
①称取100mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB缓冲液和10μL浓度为20mg/μL蛋白酶K，65℃30min振荡混匀；12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加400μL的体积比为24:1的三氯甲烷-异戊醇混合溶液，充分混匀；
②12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1～2h；
③12000r/min离心10min，弃上清液；70％乙醇洗涤一次，晾干；加入50μL TE，溶解DNA沉淀；
④DNA浓度和纯度的测定：取步骤③获得的DNA溶液加水稀释，至浓度为10μg/mL～100μg/mL，A260/A280比值在1.7～1.9之间，备用。
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