CN105018643A - 检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒的可视化基因芯片以及试剂盒 - Google Patents

检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒的可视化基因芯片以及试剂盒 Download PDF

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CN105018643A CN201510306864.0A CN201510306864A CN105018643A CN 105018643 A CN105018643 A CN 105018643A CN 201510306864 A CN201510306864 A CN 201510306864A CN 105018643 A CN105018643 A CN 105018643A
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黄小波
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曹三杰
伍锐
文翼平
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杨国淋
马锐
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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Abstract

本发明公开了一种检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒的可视化基因芯片和试剂盒。本发明特定方法制备的可视化基因芯片，可以用肉眼直观地看到检测结果，不需要价格昂贵的激光共聚扫描仪，成本低廉，同时，灵敏度较高，与现有荧光标记方法的灵敏度相当，特异性强，耗时短，检测快速，临床应用前景良好。

Description

检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒的可视化基因芯片以及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒的可视化基因芯片以及试剂盒。
背景技术
多病原混合感染是当前猪场疫病的普遍现象，猪瘟、猪流行性乙型脑炎这两种猪病毒引起的疾病症状相似且常常呈混合感染,是当前危害养猪业的两种重要病毒性疾病，因此早期鉴别诊断并及时了解流行状况对控制这两种病的流行显得尤其重要。目前对这两种病的诊断多采用病原的分离及常规的血清学方法，但需时间较长。最近国外和国内均建立了病原的分离鉴定、免疫胶体金技术、酶联免疫吸附试验、血清中和实验、聚合酶链反应等，但是还不能更加快速的检测多种病原的混合感染。
基因芯片技术是近年来新兴起的一种生物高新技术，该技术可以同时定量或定性的检测成千上万个基因信息，具有无选择性、客观、高通量的特点。基因芯片计划开展后,许多部门、大学、重点实验室及制药公司参与了该项目的研发,我国相继也成立了一大批基因芯片公司。随着基因组数据的增长以及分子生物学相关学科的快速发展,基因芯片技术得到迅猛发展和广泛应用。但生物芯片技术发展时间较短，很多技术还处于初级研发阶段，要成为实验室研究或临床可以普遍采用的技术仍有诸多关键问题亟待解决。(1)基因芯片的特异性的提高；(2)增加信号检测的灵敏度；(3)简化样品制备和标记操作；(4)设备与操作人员的要求较高；(5)应用标准的统一。
公开号为：CN104293981A的专利申请文件公开了一种检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒的芯片，其是采用荧光标记引物进行检测，虽然其灵敏度高，但是因为其需要价格昂贵的激光共聚扫描仪来扫描和分析结果，成本太高，不利于推广使用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的特异性强、灵敏度高的检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒的可视化基因芯片和试剂盒。
本发明检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒的可视化基因芯片，其特征在于：它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；
所述探针包括SEQ ID NO：1所示寡核苷酸片段和/或SEQ ID NO：2所示寡核苷酸片段，用于检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒；
所述基因芯片按照如下方法制备：
(1)制备探针溶液：取探针，用稀释至200ng/ul，得探针溶液；
(2)采用微喷头喷点方式，在压力为10KPa的情况下，将探针溶液点样于氨基玻片上，重复两次，即可。
微喷头喷点方式：通过微喷头将样品点到基片上的方式。
其中，它还包括定位探针，定位探针是SEQ ID NO：3所示的基因片段。
本发明检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒的试剂盒，它包括前述的可视化基因芯片、扩增试剂以及显色试剂；
其中，扩增试剂包括SEQ ID NO：4～5和/或6～7所示引物对，用于分别扩增猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒；
显色试剂包括金标链霉亲和素以及银染试剂。
其中，所述扩增试剂还包括SEQ ID NO：8～9所示引物对。
所述金标链霉亲和素是Nanogold-Streptavidin稀释10～40倍后的溶液。优选地，所述金标链霉亲和素的是Nanogold-Streptavidin稀释40倍后的溶液。
本发明特定方法制备的可视化基因芯片能够准确检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒，可以用肉眼直观地看到检测结果，不需要价格昂贵的激光共聚扫描仪，成本低廉，同时，灵敏度较高，与现有荧光标记方法的灵敏度相当，特异性强，耗时短，检测快速，临床应用前景良好。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1点样仪的位置标定
图2点样仪的喷样参数
图3因芯片阵列点样模式图
图4图2-4基因芯片点制的基本参数设置。A:玻片设置B:点阵设置C:阵列设置D:清洗设置E:样品设置
图5质粒菌的复苏与鉴定结果。M:100bp DNA Ladder；1：JEV基因；2：PS8基因。M:100bp DNA Ladder；1：λDNA
图6基因芯片的有效性检测结果。A：阳性质控单独杂交结果；B：全部探针杂交结果
图7基因芯片的特异性检测结果。A:乙脑病毒质粒杂交结果；B:猪瘟病毒质粒杂交结果
图8基因芯片灵敏性检测结果
图9基因芯片的稳定性检测结果
图10点样缓冲液的选择结果。A:无菌超纯水；B:3×SSC；C:博奥点样缓冲液
图11点样次数的优化结果
图12基因芯片杂交温度的优化结果
图13杂交时间的优化结果
图14 Nanogold-Streptavidin稀释倍数的优化结果
具体实施方式
一、实验材料和仪器
1.1生物材料
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株、猪瘟病毒(CSFV)毒株和猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)毒株，购自中国兽药监察所。
1.2主要试剂
氨基基片：氨基载玻片，购自上海百傲生物科技股份有限公司；点样缓冲液：点样缓冲液，购自上海百傲生物科技股份有限公司，晶芯芯片点样液，购自北京博奥生物有限公司；杂交缓冲液：杂交缓冲液，购自上海百傲生物科技股份有限公司；银染试剂：Silver buffer A，Silver buffer B，购自美国Sigma公司；金标链霉亲和素：Nanogold-Streptavidin，购自美国Nanogold公司；阳性质控(λDNA)为宝生物工程(大连)有限公司产品；小量质粒抽提试剂盒购自Omega公司。
1.3主要仪器设备 
空气恒温摇床，美国Thermo公司；AllegraTM64R高速冷冻离心机，美国Thermo公司；POWER PacTM电泳仪及水平电泳槽，美国BIO-RAD公司；UNIVERSAL HOOD凝胶成像系统，美国BIO-RAD公司；MyCyclerTMPCR仪，美国BIO-RAD公司；SmartSpecTMPlus核酸蛋白仪，美国BIO-RAD公司；超纯水仪，Milli Qplus，法国产；梯度PCR仪，美国BIO-RAD公司；分子杂交仪，美国Thermo公司；SmartArrayerTM 16，微阵列芯片点样系统：Capitalbio Corporation，北京博奥生物公司； LuxScanTM 10K微阵列芯片扫描仪：Capitalbio Corporation，北京博奥生物有限公司；多样品围栏、多样品围栏粘贴工具、多样品围栏盖片，芯片杂交盒均为北京博奥生物有限公司。
实施例1本发明可视化基因芯片的制备及用其检测的方法
1、材料和仪器 
同前述实验材料和仪器。
2本发明基因芯片的制备及性能检测
2.1引物与探针的制备
本研究将固定到氨基基片上的病毒特异DNA片段称作探针，而用生物素标记的待检样品称为靶基因。
2.1.1引物的合成 
引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中反向引物合成两条，一条无标记，一条5’端用生物素Biotin标记修饰。
表1靶基因扩增引物
表2定位基因引物
2.1.2探针基因及定位基因
JEV-C(SEQ ID NO：1)：
基因大小及序列：238bp
GCTTGTTGGACGGCAGAGGGCCAGTACGTTTCGTGCTGGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTTACAGCATTAGCCCCGACCAAGGCGCTTTCAGGCCGATGGAAAGCAGTGGAAAAGAGTGTGGCAATGAAACATCTTACTAGTTTCAAACGAGAACTTGGAACACTCATTGACGCCGTGAACAAGCGGGGCAGAAAGCAAAACAAAAGAGGAGGAAATGAAGGCTCAATCATGTGGCT 
CSFV-PS8(SEQ ID NO：2)：
基因大小及序列：248bp
TCAATGGAACCTGAGTGACAACGGCACTAATGGTATTCAGCATGCTATGTACCTTAGAGGGGTTAGCAGAAGCTTGCATGGGATCTGGCCGGAAAAAATATGCAAAGGAGTCCCCACCTACCTGGCCACAGACACGGAACTGAAAGAAATACAGGGAATGATGGATGCCAGCGAGGGGACAAACTATACGTGCTGTAAGTTACAGAGACATGAATGGAACAAACATGGATGGTGTAACTGGTACAATA 
λDNA：
基因大小及序列(SEQ ID NO：3)：500bp
GTCCTATGACGACAGCTATCTCGATGATGAAGATGCAGACTGGACTGCGACCGGGCAGGGGCAGAAATCTGCCGGAGATACCAGCTTCACGCTGGCGTGGATGCCCGGAGAGCAGGGGCAGCAGGCGCTGCTGGCGTGGTTTAATGAAGGCGATACCCGTGCCTATAAAATCCGCTTCCCGAACGGCACCGCTGGCGTGGATGCCCGGAGAGCAGGGGCAGCAGGCGCTGCTGGCGTGGTTTAATGAAGGCGATACCCGTGCCTATAAAATCCGCTTCCCGAACGGCACCACGGTAACAGCGGCAACCGGCATGACCGTGA CGCCTGCCAGCACCTCGGTGGTGAAAGGGCAGAGCACCACGCTGACCGTGGCCTTCCAGCCGGAGGGCGTAACCGACAAGAGCTTTCGTGCGGTGTCTGCGGATAAAACAAAAGCCACCGTGTCGGTCAGTGGTATGACCATCACCGTGAACGGCGTTGCTGCAGGCAAGGTCAACATT 
制备好的探针基因和定位基因稀释成一定倍数后，用紫外核酸蛋白检测仪进行DNA浓度测定。
2.1.3各阳性质粒的制备
采用天根的总RNA提取试剂盒，参照说明，提取病毒的总RNA。用宝生物的反转录试剂盒参照说明将病毒的RNA反转录为cDNA，进行PCR扩增。扩增后的探针基因，采用OMEGA小量胶回收试剂盒进行胶回收。采用pMD19-T Simple Vector克隆试剂盒，进行探针基因的连接重组，4℃连接过夜，连接产物转入DH5α感受态细胞，最后进行鉴定与保种，获得分别含有2.1.2节JEV-C、CSFV-PS8的重组T载体T/JEV-C、T/PS8。
2.2仪器调试与校正
在点样之前，需要对点样仪进行位置标定，包括清洗位置、抽干位置、排空位置、第一片玻片位置和样品孔板A24孔位置等(如图1)，并对其基本喷样参数进行设定(如图2)。
2.3基因芯片点制过程中的条件
2.3.1点制芯片点样方式
微喷头喷点方式。
2.3.2点样缓冲液 
博奥点样缓冲液。
2.3.3点样次数
喷样3次，经过后处理，杂交，观察结果。
2.4 CSFV-JEV可视化基因芯片的制备
2.4.1 CSFV-JEV可视化基因芯片点阵的设计
每张基因芯片共设计分为4个阵列，4个阵列为重复阵列，需要时用杂交围栏隔开，以便同时进行4个不同样品的平行检测。每个阵列包含4×3＝12点，基因芯片阵列点样模式图见图3。
2.4.2 CSFV-JEV可视化基因芯片的点制
本试验使用博奥生物公司的SmartArrayer 16基因芯片点样仪喷点，首先将探针浓度调整到400ng/ul(用无菌超纯水调整)，用点样缓冲液将探针稀释至200ng/ul，然后将探针轻轻加至384孔板相应的孔中充分混合均匀(混合液中不能留有气泡)，将384孔板和芯片基片放于点样仪上。将室温平衡过的氨基玻片置于点样仪的模块上，在点样之前，对点样仪进行一次校正，并按照设计好的检测阵列的排布进行点样(如图4)，点样压力为10KPa，并重复两次(一共点样三次)。
2.4.3 CSFV-JEV可视化基因芯片的点样后处理
点样后处理主要包括探针的固定和储存。点制完成的基片在预设为80℃的烘箱中烘焙4h，紫外交联30min，密封、4℃保存。
2.5基因芯片的杂交
2.5.1靶基因的扩增标记
三个靶基因分别按照如下方法扩增：
以稀释50倍的质粒DNA为模板，进行靶基因的标记扩增，加样的过程需要避光进行。
PCR体系：
反应程序如下：95.0℃变性5min；95.0℃变性30sec，56.0℃退火30sec，72.0℃延伸30sec，35个循环；72.0℃延伸8min，12.0℃保存。
2.5.2基因芯片的预杂交
取制备保存的基因芯片，在沸腾的超纯水中预变性5min(上下抽提防止表面产生气泡)，然后将其取出迅速浸入无水乙醇中冷却1min，离心干燥。将干燥的芯片加上围栏，并用围栏粘贴工具固定，置于杂交舱中，于芯片点样区加入预杂交液30ul，将盖玻片轻放其上，以免形成气泡，使预杂交液均匀覆盖芯片区，将芯片置于密封的湿盒内于44℃下预杂交1h。
预杂交液的配置：甲酰胺5.0ml，20×SSC 2.5ml，100×Denhardt 0.5ml，0.2mol/ml Na3PO41.0ml，10mg/ml鲑鱼精DNA 0.5ml(鲑鱼精DNA需变性煮沸5min后，立即放入冰中冷却)，纯水0.5ml，用孔直径为0.2nm滤膜过滤，混匀分装lml/管，4℃保存备用。
2.5.3基因芯片的杂交
吸除预杂交液，将PCR扩增的核酸样品与杂交缓冲液混匀于95℃变性5min后，立即置冰中冷却3min，取该混合液50ul加到芯片区，以盖玻片轻放其上，将芯片放入杂交舱内于一湿盒内杂交，于一定的杂交温度下杂交一定时间。杂交完成后，盖玻片除去后，用温热的马来酸缓冲液清洗3次，每次2min，低速离心干燥。
2.5.4基因芯片杂交温度的优化
将芯片分别在46℃、48℃、52℃的温度中杂交1h，观察结果。 
2.5.5基因芯片杂交时间的优化
将所有探针进行杂交，分别杂交60min，观察对比结果。
2.6基因芯片的显色与结果判定
在已经完成杂交的芯片反应区域加入50ul稀释一定倍数的Nanogold-Streptavidin，将芯片置于杂交舱中，盖上盖玻片，37℃孵育30min。后用温热的马来酸缓冲液洗3次，每次2min，低速离心干燥。在避光的环境中，向每个点阵加200ul的银染试剂(Silver buffer A，Silver buffer B等体积混合，现配现用)，待芯片上出现清晰的可视化信号，用超纯水清洗芯片，终止显色，观察结果。
2.6.1 Nanogold-Streptavidin(nanocs公司的金标链霉亲和素)稀释倍数
以杂交阳性质控为例，将Nanogold-Streptavidin用超纯水分别稀释40倍，在相同的条件下与芯片孵 育，后经过银染显色，观察和对比结果。
2.6.2基因芯片银染时间
在加上银染试剂之后，染色8-10min。
2.7基因芯片的性能研究
2.7.1基因芯片的有效性检测
单独以阳性质控λDNA为模板，PCR扩增标记，标记产物在标准条件下与基因芯片杂交，经过洗涤、离心干燥和显色后观察结果，以验证基因芯片阳性质控和阴性质控的有效性。再以重组质粒菌T/JEV-C、T/PS8的质粒为模板，PCR分别扩增标记，标记产物混合后在标准条件下与基因芯片经杂交、洗涤、离心干燥后显色观察结果，以验证基因芯片全部探针的有效性。
2.7.2基因芯片的特异性研究
猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性乙脑病毒和猪瘟病毒的重组质粒菌的质粒DNA作为模板，50倍稀释后分别进行PCR扩增标记，将标记产物与基因芯片经预杂交、杂交、洗涤、离心干燥后，显色观察结果，以验证基因芯片的特异性。
2.7.3基因芯片的灵敏性研究
分别提取猪流行性乙脑病毒和猪瘟病毒的重组质粒菌的质粒DNA作为模板，50倍稀释后分别进行PCR扩增标记，将产物10倍梯度稀释，再将稀释后的标记产物分别与基因芯片进行杂交检测，靶基因的用量和杂交条件完全一样，显色并观察结果。同时将PCR产物取7uL进行电泳鉴定，观察和比较两种方法的灵敏性。
2.7.4基因芯片的稳定性研究
从两批不同时间制备的基因芯片中随机抽出3张，采用2.5构建并优化好的条件与芯片进行杂交，靶核酸的使用量和杂交检测条件完全一致，用来验证基因芯片的稳定性与可重复性。
2.7.5基因芯片的保存期试验
将制备好的CSFV-JEV可视化基因芯片，放置于芯片盒中，用真空机抽干密封，分别保存30d、60d、90d、120d和180d，利用定位基因和靶基因进行杂交检测验证。
3结果与分析 
3.1探针的制备及纯化结果
3.1.1质粒菌复苏与鉴定结果
重组质粒菌T/PS8、T/JEV-C经过PCR鉴定，扩增出的目的条带大小与预期大小一致，PS8：248bp；JEV-C：238bp；定位基因：500bp(见图5)。
3.2点样仪位置标定结果
通过对点样仪进行调试，位置标定的具体参数见表3。
表3点样仪位置标定结果
3.3基因芯片的性能研究结果
3.3.1基因芯片的有效性检测结果
单独以阳性质控λDNA为模板，PCR扩增标记，标记产物在标准条件下与基因芯片杂交，经过洗涤、离心干燥和显色后，结果如图6，再以重组质粒菌T/JEV-C、T/PS8为模板，PCR分别扩增标记，标记产物混合后在标准条件下与基因芯片经杂交、洗涤、离心干燥后显色后结果如图。
3.3.2基因芯片的特异性检测结果
分别以CSFV、JEV的质粒DNA为模板，进行PCR扩增标记，将标记产物与基因芯片经预杂交、杂交、洗涤、离心干燥后，显色并观察结果如图7。相应的探针都有明显的阳性信号，彼此间无交叉反应，说明基因芯片的特异性良好。
3.3.3基因芯片的灵敏性检测结果
分别提取猪流行性乙脑病毒和猪瘟病毒的重组质粒菌的质粒DNA作为模板，50倍稀释后分别进行PCR扩增标记，将产物10倍梯度稀释，再将稀释后的标记产物分别与基因芯片进行杂交检测，靶基因的用量和杂交条件完全一样，显色并观察结果如图8所示。
最初，JEV和PS8靶基因浓度分别为162ng/uL和183ng/uL，经过稀释之后，可视化基因芯片技术在稀释到104时还有明显的信号，此时靶基因的浓度分别为16.2pg/uL和18.3pg/uL说明可视化基因芯片技术的灵敏度高。
3.3.4基因芯片的稳定性检测结果
从两批不同时间制备的基因芯片中随机抽出3张，应用阳性质控基因和三种病毒的探针基因与基因芯片进行杂交反应，其中靶核酸的使用量、杂交条件完全一致。结果如图9所示，对于同一批次生产的基因芯片和不同批次生产的基因芯片，其检测结果符合预期，信号的灰度相近，无大幅波动，阳性对照斑点明显而阴性对照斑点不明显，稳定性和可重复性良好。
3.3.5基因芯片的保存期试验结果
分别在30d、60d、90d、120d和180d抽取一张CSFV-JEV可视化基因芯片对其保存期进行检验，在180d时芯片仍能够有效检测。
综上，成功地构建了CSFV-JEV可视化共检基因芯片，制备的基因芯片在48℃杂交60min，Nanogold-Streptavidin稀释40倍，银染时间8-10min时可以有效检测CSFV和JEV，且特异性好，灵敏度可达16.2pg/uL和18.3pg/uL，密封在4℃至少可保存180d。
对比例 基因芯片的制备以及使用
1基因芯片点制过程中的条件
1.1点样缓冲液 
其余条件同实施例1，仅改变点样缓冲液：
将定位基因进行纯化，分别用无菌超纯水、3×SSC(20×SSC：NaCl 17.53g，柠檬酸钠8.82g，ddH2O80ml，用NaOH调pH至7.0，定容至100.0ml，用孔直径为0.2nm滤膜过滤后保存备用。3×SSC在20×SSC的基础上进行稀释。)、博奥点样缓冲液(本发明缓冲液)稀释到200ng/ul左右，点制到基片上，经过后处理固定，模拟真实杂交后观察点样形态，如图10。
由图可明显观察到，用无菌超纯水点样时，探针固定上的很少，而且扩散效果不好；用自制的3×SSC点样后，所得的点不够均匀；用博奥点样缓冲液和百傲点样缓冲液点样后，效果较佳。
实验结果说明，只有选用本发明缓冲液才能制备得到本发明性能良好的基因芯片。
1.2点样次数
其余条件同实施例1，仅改变点样次数：
分别喷样1-4次，经过后处理，杂交，结果如图11所示。
由图可知，喷样1-2次，探针固定上的不多，所以显色出来颜色较淡；喷样3次(本发明喷样次数)时，显色明显，喷4次后颜色加深但同时也产生了点的移位。
实验结果说明，只有采用本发明特定浓度的探针溶液，使用特定点样方式，在特定的压力下，采用本发明特定点样次数才能制备得到本发明性能良好的基因芯片，可以准确检测，而点样次数增加或者减少，或者其他参数的变化均会导致检测结果不准确。
2基因芯片的杂交过程
2.1基因芯片杂交温度
其余条件同实施例1，仅改变杂交温度：
将芯片分别在42℃、46℃、48℃、52℃的温度中杂交相同的时间。
结果表明(图12)，在42℃时，部分探针没有杂交上，芯片在46-52℃(本发明杂交温度)中均能看到明显的斑点，在48℃杂交的效果最好。
实验结果说明，采用本发明基因芯片，只有采用本发明特定的杂交温度，才能有效检测，其中，48℃为优选的杂交温度，而温度过高或者过低则无法有效检测。
2.2基因芯片杂交时间
其余条件同实施例1，仅改变杂交时间：
将所有探针进行杂交，分别杂交30min、60min(本发明杂交时间)和120min，观察对比结果(图13)。
结果表明，在杂交30min时，斑点较淡；杂交60min后，斑点清晰可见；杂交120min后，斑点略有加深但不明显，但是背景值高。
实验结果说明，采用本发明基因芯片，只有采用本发明特定的杂交时间，才能有效检测，而时间过长或者过短则无法有效检测。。
3基因芯片显色过程中
3.1 Nanogold-Streptavidin稀释倍数
其余条件同实施例1，仅改Nanogold-Streptavidin的稀释倍数
以杂交阳性质控为例，将Nanogold-Streptavidin用超纯水分别稀释10倍至80倍，在相同的条件下与芯片孵育，后经过银染显色，结果如图14所示：在Nanogold-Streptavidin稀释10倍时，染色结果颜色最深；在Nanogold-Streptavidin稀释20至40倍时，颜色稍微变浅，但仍然能够被明显识别出；在Nanogold-Streptavidin稀释50至60倍时，颜色变得很浅，判定结果可能会出现误差；在Nanogold-Streptavidin稀释70倍时，颜色变得模糊，不能判定结果；在Nanogold-Streptavidin稀释80倍时，完全看不到斑点。
本研究最终采用将Nanogold-Streptavidin稀释40倍，既节约了试剂成本，也保证了可视化的效果。
实验结果说明，只有采用本发明Nanogold-Streptavidin稀释10～40后的溶液才能有效检测，其中，优选Nanogold-Streptavidin稀释40后的溶液，而采用本发明以外的显色试剂则无法有效检测。
3.2基因芯片的银染时间
其余条件同实施例1，仅改银染时间：
在加上银染试剂之后，密切观察芯片的染色和着色情况。
结果显示，在银染显色8-10min(本发明银染时间)时，显色清晰，没有背景值和假阳性；12min以后，背景值升高明显，影响判断。
实验结果说明，采用本发明基因芯片，只有采用本发明特定的银染时间，才能有效检测。
以下用实验例进一步说明本发明的有益效果：
实验例1 CSFV-JEV可视化共检基因芯片检测临床样本
1材料
1.1阳性和阴性样本
1.1.1阳性样本
CSFV：猪瘟活疫苗(细胞源)，购自山东亚康药业；乙型脑炎病毒：JEV SCYA20120201株，分自雅安某猪场具有流产症状的病例。
1.1.2阴性样本
阴性样本取自雅安某猪场的健康猪的淋巴结、肺脏等组织。
1.2临床样本
2014年1月至2015年1月来源于四川眉山、绵阳、乐山、双流、达州、西昌、重庆等地的102份临床样品，采集于临床表现为疑似猪繁殖障碍性疾病的患病猪的组织或流产胎儿。
1.3主要试剂
总RNA提取试剂盒(DP419)购自天根生化科技公司、Trizol Reagent购自TAKARA公司；100bp Ladder DNA Marker(MD109)购自天根生化公司；PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司产品。
2实验方法
2.1芯片制备
实施例1制备的基因芯片。
2.2病毒核酸的提取
采用天根的RNA提取试剂盒，提取阳性病毒和临床样本的RNA，提取方法如下：
1)将采集的病料剪碎，用裂解液研磨；
2)取250ul上述病料溶液，加750ul裂解液，在室温放置5min-10min；
3)12000r/min，4℃离心5min，吸取上清转入新的EP管中；
4)加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；
5)12000r/min，4℃离心10min，液体分层，将最上层无色的液体转到新的EP管中；
6)加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，转到吸附柱内，12000r/min，4℃离心30s；
7)加入500μL去蛋白液，12000r/min，4℃离心30s；
8)加入600μL漂洗液，静置2min，12000r/min，4℃离心30s；重复一次
9)12000r/min，4℃空离2min；
10)将吸附柱转到RNase-Free离心管中，加50μL RNase-Free超纯水，室温静置2min，12000r/min，4℃离心2min。得到的病毒RNA，-70℃保存备用
使用PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，反转录产物于-20℃保存备用，体系如下：
反应程序：37℃，15min；85℃，5sec；4℃，保存。
2.3靶基因的PCR扩增及标记 
以上述反转录产物为模板，进行PCR标记扩增，扩增体系和程序同第二章2.5.1。
2.4基因芯片的杂交
将制备好的基因芯片在44℃预杂交1h后，吸除与杂交液，与上述标记的靶基因在48℃杂交1h，再与稀释40倍的金标链霉亲和素在37℃孵育30min，在温热的马来酸缓冲液中清洗3次，每次2min。将芯片晾干，每个点阵加入200ul银染试剂，银染8min，用超纯水清洗终止显色，观察结果。
3结果与分析 
3.1已知阳性和阴性样品的检测评估
将三种病的阳性样本和阴性样本分别抽取RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR标记扩增，扩增的标记产物与CSFV‐JEV共检可视化基因芯片杂交、银染。在阳性样品的评估检测中，所有探针均与阳性样本结合，并产生明显的阳性信号；在阴性样品的检测评估中，只有阳性质控的探针有明显的阳性信号，其他探针均显示为阴性。
3.2临床样品检测应用
将四川眉山、绵阳、乐山等地102份临床样本提取RNA后反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR标记扩增，扩增的标记产物与CSFV-JEV共检可视化基因芯片杂交、银染后结果如表4所示：102份临床样本中，流行性乙型脑炎病毒的检出率为3％，猪瘟病毒的检出率为38％；存在混合感染的现象。
表4临床样品检测结果
实验结果说明，采用本发明基因芯片，按照本发明方法使用，可以有效检测临床样本是否有流行性乙型脑炎病毒和猪瘟病毒。
综上，本发明试剂盒和基因芯片可以有效检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒，特异性强、敏感性高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

Claims (7)

1.一种检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒和的可视化基因芯片，其特征在于：它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1所示寡核苷酸片段和/或SEQ ID NO：2所示寡核苷酸片段，用于检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒；
所述基因芯片按照如下方法制备：
(1)制备探针溶液：取探针，用稀释至200ng/ul，得探针溶液；
(2)采用微喷头喷点方式，在压力为10KPa的情况下，将探针溶液点样于氨基玻片上，重复两次，即可。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它还包括定位探针，定位探针是SEQ ID NO：3所示的基因片段。
3.一种制备权利要求1或2所述可视化基因芯片的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)制备探针溶液：取探针，用稀释至200ng/ul，得探针溶液；
(2)采用微喷头喷点方式，在压力为10KPa的情况下，将探针溶液点样于氨基玻片上，重复两次，即可。
4.一种检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：它包括权利要求1或2所述的可视化基因芯片、扩增试剂以及显色试剂；
其中，扩增试剂包括SEQ ID NO：4～5和/或6～7所示引物对，用于分别扩增猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪瘟病毒基因；
显色试剂包括金标链霉亲和素以及银染试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增试剂还包括SEQ ID NO：8～9所示引物对。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述金标链霉亲和素是Nanogold-Streptavidin稀释10～40倍后的溶液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述金标链霉亲和素的是Nanogold-Streptavidin稀释40倍后的溶液。
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