CN107727864A - 一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法，属于蛋白检测技术。其特征在于：所述蛋白芯片的基质载片上至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；所检测亚区内设置有检测斑区域和对照斑区域，所述检测斑区域有固定DCP特异性抗体形成检测斑，所述对照斑区域有固定牛血清白蛋白形成对照斑；同一个检测斑区域内的所有检测斑上的物质的浓度相同；每一个所述检测斑固定的DCP特异性抗体的总量为3nl,是进行10次喷涂，每次喷点300pl而成。本发明的蛋白芯片，试剂盒可准确地检测异常脱羧凝血酶原，临床使用中，具有灵敏度高、省时、便捷、经济等优点。

Description

一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其 制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白检测技术，特别涉及一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法。
背景技术
脱-r-羧基凝血酶原(Des--carboxy-prothrombin,DCP)是肝细胞癌产生的异常凝血酶原，与正常凝血酶原相比，DCP的分子结构特点是其丙氨酸结构域(Gla domain)中的一个或者多个谷氨酸(Glu)残基没有被完全羧化成为Gla,从而失去凝血功能。正常的凝血酶原是在肝细胞微粒体内，主要依赖维生素K的γ谷氨酰羧化酶及辅酶和Vitamin Kreductase参与下，将结构Gla Domain中的第6,7,14,16,19,20,25,26,29和32位的10个Glu残基羧化为Gla,成为有活性的凝血酶原，上述任何一点或多个Glu残基羧化不全，都将可能形成DCP,失去凝血功能。原发性肝癌血清中的DCP明显升高。
目前检测DCP一般用常规的ELISA方法，据陆枫林等人发表的《去γ-羧基凝血酶原对原发性肝细胞癌的诊断价值》，中国肿瘤临床2009年07期的记载，采用ELISA方法，对门诊诊断为原发性肝癌的患者血清进行检测，结果显示灵敏度和特异性分别为78.95％和85.42％，须采血3-5ml，而且该方法所需抗体、血清量都较高，这一方面导致成本高，另一方面，由于灵敏度不够，导致假阴性比例较大。
在门诊中准确检测血清中是否存在DCP以及其水平，对于临床诊断肝癌具有重要意义。低成本、快速高效、准确、高通量检测手段是最好的选择，但是目前没有关于高通量检测DCP的报道，普通的Elisa方法虽然达到灵敏度和特异性分别为78.95％和85.42％，须采血3-5ml，而高通量检测中采用这么大的血清量则对应地需要大量捕获抗体，检测斑的尺寸势必非常大，无法做成集成的高通量芯片，成本非常高，在门诊中普及并不现实。DCP在血清中含量非常低，如果降低血清用量和抗体量，做成高通量芯片，则很难提高检测灵敏性和特异性，发明人推测这是目前没有检测DCP的蛋白芯片的原因。
发明内容
本发明基于蛋白芯片领域在血清中DCP的检测技术的需求及空白，提供了一种适合于检测生物样品中DCP的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法。专门针对血清中的DCP具有省时、经济、准确、便捷的优点。
本发明的技术方案如下：
一种检测异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片，其特征在于：
所述蛋白芯片的基质载片上至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；
所检测亚区内设置有检测斑区域和对照斑区域，所述检测斑区域有固定DCP特异性抗体形成检测斑，所述对照斑区域有固定牛血清白蛋白形成对照斑；
同一个检测斑区域内的所有检测斑上的物质的浓度相同；
每一个所述检测斑固定的DCP特异性抗体的总量为3nl,是进行6-10次喷涂，每次喷点300-500pl而成。
喷点温度为4-8℃。
所述DCP的特异性抗体为鼠抗人DCP。
所述基质载片上具有多个所述检测亚区，所述每个检测斑区域包括排列成1排的4个检测斑，所述对照斑区域包括排列成1排的4个对照斑；所述检测斑和对照斑排成平行的两列。
所述检测亚区之间设置有凸起作为物理隔断。
上述用于检测异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片的制备方法，其特征在于：每一个所述检测斑上固定的DCP特异性抗体进行6-10次喷点，每次喷点300-500pl，喷点总量为3nl。
所述检测斑在4-8℃摄氏度下喷点而成。
一种检测异常脱羧凝血酶原的试剂盒，其特征在于：包括上述蛋白芯片。
还包括，HRP标记的凝血酶原多克隆抗体，HRP化学发光底物液；所述HRP标记的凝血酶原多克隆抗体为兔源抗体，与所述检测斑上固定的DCP特异性抗体来源于不同物种。
还包括用于洗涤和稀释的常规试剂PBST和PBS。
一种检测凝血酶原和DCP的方法，其特征在于：采用上述任一化学发光蛋白芯片，包括如下步骤：
将待测血清样本稀释后滴加在所述化学发光蛋白芯片的检测亚区上，孵育后，用PBST洗涤检测亚区，去除非特异结合物；
加入用PBS稀释的HRP标记的凝血酶原抗体,孵育后，用PBST洗涤，去除非特异结合物；
加入HRP底物发光液，用化学发光扫描仪对蛋白芯片进行扫描，分别得到稀释后待测血清样本中的DCP发光像素值；
所述孵育指37℃孵育30分钟。
本发明提供一种检测DCP的化学发光蛋白芯片，基于抗体抗原抗体夹心反应原理及化学发光原理，固定有DCP特异性抗体用于结合血清中的DCP(凝血酶原的异常脱羧部位)，同时设置有对照斑点。本发明提供的化学发光蛋白芯片至少包括一个亚检测区，可以检测一个血样。本发明的蛋白芯片针对的靶标为结构Gla Domain中的第6,7,14,16,19,20,25,26,29和/或32位的10个Glu残基羧化不全形成的没有活性的凝血酶原。上述任何一点或多个Glu残基羧化不全，都将可能形成DCP包括血清中第6,7,14,16,19,20,25,26,29和/或32位的10个Glu残基异常脱羧的凝血酶原，为了提供能够准确定性检测血清中是否存在脱-r-羧基凝血酶原(DCP)的蛋白芯片，本发明通过芯片点样工艺、检测斑抗体量的选择和优化入手，确保芯片的检测准确性。喷点方式确保捕获抗体需求量低于接触式点样蛋白芯片上捕获抗体需用量；一个检测斑上的捕获抗体采用多次喷点的方式，使得检测斑上抗体均匀，而且能有效避免/降低检测斑空心现象，确保捕获抗体的捕获活性。
本发明提供的蛋白芯片，在大部分实施例中，优选设置至少两个检测亚区，其中一个亚区用于检测对照血清，另一个亚区用于检测待测血样。进一步地，为了实现高通量检测，优选为多个，例如，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个或十个检测亚区，这样就可以在一张芯片上检测多个血清样品，提高临床检测效率，降低成本。如图1所示，本发明的一个优选实施例中，一个所述检测亚区内包括4个固定DCP特异抗体的检测斑和4个对照斑；两种检测斑和对照斑各排成平行的两列。
本发明还提供了一种检测DCP的化学发光试剂盒，其中包括上述蛋白芯片以及化学发光的常规试剂。
本发明蛋白质芯片的使用有三方面的优势：
一、检测血清中的DCP。
二、允许同时检测多个样品。多个重复的样品，或者不同时间点取的样品以获得动态值，或者各个不同的样品，总之，实现高通量检测。整体上降低检测成本和提高检测效率。
三、采用本发明的蛋白质芯片需要的血样及抗体量都大为减少。每个点样斑采用每次喷点300-500pl，每点喷涂6-10次，共计3nl点样抗体。每个检测方格4个检测点，需要12nl捕获抗体，低于接触式蛋白芯片捕获抗体需用量；应用非接触式点样仪，喷点体积精确，并且点样均一性得到了保证，有效的降低了空心现象的发生。并且仅需原始血清量或稀释后血清10ul,而ELISA方法检测需原始血清量或稀释后血清50ul同时，本发明还提供了利用所述试剂盒对DCP进行检测的方法。
本发明提供的检测血清DCP的方法，是在上述蛋白芯片上，利用抗体和抗原特异性结合的特点，芯片上固定的DCP抗体与血清或者血浆中的DCP(异常脱羧凝血酶原的异常脱羧部位)结合；然后加入HRP标记的凝血酶原多克隆抗体，凝血酶原多克隆抗体与DCP(异常脱羧凝血酶原)异常脱羧部位以外的抗原表位结合；最后加入HRP发光底物，通过化学发光扫描仪对发光信号进行扫描量化。
实验结果证明，本发明的方法可通过发光强度对凝血酶原和DCP进行检测。与ELISA方法进行对比，敏感性和特异性均优于ELISA方法，从时间上比较，ELISA检测至少需要3小时，本发明仅需要1.5小时；从检测血清需要量上比较，仅需原始血清量或稀释后血清10ul,而ELISA方法检测需原始血清量或稀释后血清至少50ul；从捕获抗体用量上比较，需要量远远低于ELISA方法，本发明的芯片使用非接触式喷墨式喷点方法，每个检测斑每次喷点300pl，每点喷涂10次，共计3nl点样抗体。每个检测方格4个检测点，需要12nl捕获抗体；精确控制喷点体积，多次喷点，点样均一性得到了保证，有效的降低了空心现象的发生，大大提高了检测准确率，并节省了抗体使用量和血清用量，降低了检测成本和费用。
因此，本发明提供的试剂盒和检测方法具有灵敏度高、省时、经济等特点，可以大大地降低血液蛋白检测的成本和时间。
综上，本发明的方法结合了异常脱羧特异抗体、化学发光检测方法以及蛋白芯片技术的应用，确保了利用试剂盒进行DCP检测结果的高灵敏性，准确性、高效性和低成本。本发明提供的检测方法一种可行、可靠、经济，且简单、省时的方法。本发明的技术方案将为大规模、高通量检测血清中DCP提供了一种经济、可靠的试剂盒和检测方法。
附图说明
图1.DCP蛋白质芯片点样示意图；
图2.DCP抗体夹心法蛋白质芯片流程图；
图3.DCP抗体点样芯片检测肝癌和正常血清样本扫描图。
其中1-8：肝癌血清；9健康对照血清；10空白对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
主要仪器设备
化学发光扫描仪，由美国GE公司。
主要试剂及其来源
鼠源单克隆抗体DCP抗体(日本富士瑞必欧株式会社公司)、醛基芯片(上海百傲公司)、HRP标记的凝血酶原兔源抗体(美国Fitzgerald公司)、HRP化学发光底物液A液和B液，按照1：1比例混合，新鲜配置。(美国Millipore公司)。
实施例1蛋白质芯片制备及使用流程
实验所用试剂和仪器：DCP抗体(日本富士瑞必欧株式会社)；醛基芯片(上海百傲公司)；HRP标记的兔源抗体(美国Fitzgerald公司)；化学发光扫描仪。(美国GE公司)
PBS配方:氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.44g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g，调pH 7.4,定容1L
PBST配方：PBS,1L+Tween-20,1ml
芯片为醛基芯片(上海百傲公司)，每张芯片包含10个检测方格(检测亚区)，每个方格检测一份血清，一次检测10份血清。
每个检测方格内，将鼠DCP抗体依次点在芯片上，点样四次，点样浓度DCP抗体4mg/ml，点成一排四个检测斑；10％牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照，同样点样四次，点成对照斑；
应用德国GESIM公司Nano-Plotter NP2.1型号非接触式皮升级点样仪，采用压电点样针，喷点体积控制在50pl-500pl，而且控制点样仪内舱温度4-8摄氏度，每次喷点300pl-500pl，每点喷涂6-10次，共计3nl点样抗体。每个检测亚区4个检测点，需要12nl捕获抗体。
蛋白芯片操作流程：
用制备好的蛋白质芯片检测健康对照组和肝癌实验组动态血清标本中的肿瘤标志物。
用血清样本10ul,(或者2.5ul稀释4倍),滴加在芯片上，37℃孵育30分钟，利用抗原抗体相结合的特性，使血清中的DCP与DCP抗体结合形成抗原抗体复合物。
用PBST洗涤4次，去除非特异结合，再加入PBS稀释的HRP标记兔源一抗，37℃孵育30分钟。兔源抗体与抗原结合，形成DCP抗体-DCP-兔源HRP标记凝血酶原抗体复合物。
用PBST洗涤4次，去除非特异结合，加入HRP发光底物，37℃孵育30分钟，化学发光扫描仪进行扫描。
固相载体上的化学发光像素与标本中受检抗原的量成正向相关,芯片捕获点样抗体(鼠源一抗)和检测用的抗体(兔源一抗)分别取自不同种属的动物，针对DCP抗原的不同抗原表位。如图示2抗体夹心法蛋白芯片流程图。
实施例2样品检测检验结果
血清样本：
8份肝癌血清：来源于首都医科大学附属佑安医院标本库，1份正常健康人血清；
1份空白对照(空白对照为1×PBS)。
本芯片的检测结果：
空白对照和健康对照没有检测到异常凝血酶原：说明本实验采用的芯片有效。正常人体内没有异常凝血酶原，健康血清没有检测到凝血酶原。说明本发明提供的芯片及方法检测的假阳性为0，检测结果能准确区分肝癌血清和正常血清。
8份肝癌血清的检测斑扫描结果显示阳性，说明8份肝癌血清中尤其是晚期肝癌患者体内有异常脱羧凝血酶原，8个阳性检测亚区的检测斑显示出不同程度的亮度，说明8份肝癌血清含有不同浓度的异常脱羧凝血酶原如图3，其中3和5显示弱阳性，检测斑亮度微弱，而1，2，4，6，7，8都显示强阳性。检测结果说明本发明的蛋白芯片能够准确检测肝癌血清，而且能够半定量地检测血清中异常脱羧凝血酶原的浓度。上述数据说明，本发明的芯片和方法准确性和可靠性良好。
在另外的数十份门诊确定为肝癌的患者血清检测中，检测灵敏度和特异性在80％以上。
采用不同喷点工艺参数制作的芯片，例如，采用等量的抗体，但是进行1-2次而不是6-10次喷点形成检测斑的芯片，检测上述血清样本时，灵敏度和特异性显著降低。

Claims (10)

1.一种检测异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片，其特征在于：
所述蛋白芯片的基质载片上至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；所检测亚区内设置有检测斑区域和对照斑区域，所述检测斑区域有固定DCP特异性抗体形成检测斑，所述对照斑区域有固定牛血清白蛋白形成对照斑；同一个检测斑区域内的所有检测斑上的物质的浓度相同；
每一个所述检测斑固定的DCP特异性抗体的总量为3nl,是进行6-10次喷涂，每次喷点300－500pl而成。
2.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述检测斑是在4-8摄氏度环境下喷点而成。
3.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述DCP的特异性抗体为鼠抗人DCP。
4.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述基质载片上具有多个所述检测亚区，所述每个检测斑区域包括排列成1排的4个检测斑，所述对照斑区域包括排列成1排的4个对照斑；所述检测斑和对照斑排成平行的两列。
5.根据权利要求1-4任一所述的蛋白芯片，其特征在于，所述检测亚区之间设置有凸起作为物理隔断。
6.权利要求1-5任一所述用于检测异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片的制备方法，其特征在于：
每一个所述检测斑上固定的DCP特异性抗体进行6-10次喷点，每次喷点300－500pl，喷点总量为3nl。
7.一种检测异常脱羧凝血酶原的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-5任一所述的蛋白芯片。
8.权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括，HRP标记的凝血酶原多克隆抗体，HRP化学发光底物液；所述HRP标记的凝血酶原多克隆抗体为兔源抗体，与所述检测斑上固定的DCP特异性抗体来源于不同物种。
9.权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于洗涤和稀释的常规试剂PBST和PBS。
10.一种检测凝血酶原和DCP的方法，其特征在于：采用权利要求1-5任一所述的蛋白芯片，包括如下步骤：
将待测血清样本稀释后滴加在所述蛋白芯片的检测亚区上，孵育后，用PBST洗涤检测亚区，去除非特异结合物；
加入用PBS稀释的HRP标记的凝血酶原抗体,孵育后，用PBST洗涤，去除非特异结合物；
加入HRP底物发光液，用化学发光扫描仪对蛋白芯片进行扫描，分别得到稀释后待测血清样本中的DCP发光像素值；
所述孵育指37℃孵育30分钟。
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