CN113985032A - 一种含内参的双标记免疫检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含内参的双标记免疫检测方法，用于检测样品中目标蛋白，通过将目标蛋白的第二结合蛋白和内参质控采用不同的标记物进行标记，并结合其标记物信号值代入发明人建立的校正公式进行计算，再将计算结果代入基于标准物建立的拟合曲线中，从而反求出实际样本的目标蛋白浓度。使用该方法可以有效减少免疫检测试剂检测结果受干扰因素影响导致精密度较差的问题，使得检测精密度能提高至CV<5％。同时，基于该方法，发明人还设计了一种检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒，采用其检测可有效降低干扰因素对检测结果的影响，从而提高检测精密度，为提高现有免疫定量分析检测准确性，提供有力保障。

Description

一种含内参的双标记免疫检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，特别是涉及一种含内参的双标记免疫检测方法及其应用。
背景技术
以抗体为基础的免疫反应是对特定对象检测的最基本、最普遍方法，并且已经广泛地应用到生命科学研究及临床检测领域，但是，目前常规的免疫分析技术中，由于光谱重叠等问题很难实现多组分的同时分析，即使荧光量子点标记的荧光免疫分析也很难实现较多组分同时分析，更为重要的是，这些常规的免疫分析方法最终都要经过一个反应过程，如显色反应或发光反应，才能够被检测器检测到，而这种反应的稳定性、一致性等都会直接影响定量结果的准确性，因此，发展一种精准的免疫定量分析，提高临床检测结果的可靠性就显得尤为重要。
目前的液相免疫检测试剂一般使用一个发光物作为示踪物，常用的发光物有碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素、镧系金属元素等，采用两种不同的发光物同时制备一个试剂盒可以检测样本中两种不同的物质，称之为双标记免疫检测试剂。但是受限于其他干扰因素的影响，包括光源稳定性，室内温度，仪器温度，取样精度，试剂精度等，试剂盒总精密度通常只能做到10％。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提出一种提高检测精确度的、含内参的用于样品中目标蛋白的检测方法。
包括如下技术方案：
一种用于样品中目标蛋白的检测方法，其包括如下步骤：
提供载体，所述载体上包被有第一结合蛋白和内参蛋白；
加入待测样本和双标记免疫检测试剂，其中，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的第二结合蛋白和发光物2标记的内参质控蛋白，所述发光物1与发光物2属于两种不同的发光物，所述第二结合蛋白能够与目标蛋白特异性结合，所述第一结合蛋白能够与目标蛋白和/或发光物1标记的第二结合蛋白结合，所述内参蛋白与发光物2标记的内参质控蛋白特异性结合；
孵育反应后，洗涤去除未结合的双标记免疫检测试剂；
检测得到发光物1的荧光信号值T’和发光物2的荧光信号值C’，将其按照T’rel＝(T’-B1)/(C’-B2)，进行运算得到T’rel，将T’rel代入拟合标准曲线函数中得到对应浓度值，得到校准后的待测样本中分析物的浓度值；其中，B1、B2分别为发光物1与发光物2的背景信号检测值。
在其中一些实施例中，上述载体为固相载体，进一步地包括包被板、微孔滤膜以及含铁的磁性微粒。
在其中一些实施例中，上述特异性结合是指有指向的、能被相应物质竞争阻断的某种配基在体外或体内与特异结构位点相互作用的生物结合过程。如抗原和抗体或受体和配体之间的结合，效应T细胞和靶细胞结合；有特异性的(抗体等)和相应的病毒或细胞结合。
在其中一些实施例中，上述拟合标准曲线函数的制备包括如下步骤：
(1)检测双标记免疫检测试剂中两种发光物的背景信号值，分别为B1、B2；
(2)准备n个不同浓度的目标蛋白标准品样本，将每个样本分别采用步骤(1)中的所述双标记免疫检测试剂进行检测，得到n个发光物1的荧光信号值T和n个发光物2的荧光信号值C；
(3)将步骤(2)中得到的荧光信号值T和荧光信号值C按照公式：Trel＝(T-B1)/(C-B2)，计算得到n个新数据Trel；
(4)曲线拟合：将步骤(3)得到的Trel值作为纵坐标，将目标蛋白标准品的浓度值作为横坐标，进行四参数回归得到对应的拟合曲线函数，作为试剂盒的校准曲线。
在其中一些实施例中，上述双标记免疫检测试剂中的发光物1和发光物2为分别独立选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素和镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意不同两种。
在其中一些实施例中，上述发光物1和发光物2不同，所述发光物1选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素中的任意一种，所述发光物2选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意一种；或，所述发光物1选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意一种，所述发光物2选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素中的任意一种。
在其中一些实施例中，上述发光物1和发光物2为分别独立选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意不同两种。
在其中一些实施例中，上述内参质控蛋白选自鸡IgY、羊抗鸡IgY、生物素、亲和素、兔IgG、羊抗兔IgG中的任意一种。
在其中一些实施例中，上述方法中，所述发光物1标记的第二结合蛋白的稀释比例为1:200～1:10000；所述发光物2标记内参质控的稀释比例为1:200～1:20000。
在其中一些实施例中，上述方法中，所述发光物1标记的第二结合蛋白的稀释比例为1:200～1:10000；所述发光物2标记内参质控的稀释比例为1:1000～1:10000。
在其中一些实施例中，上述中，所述发光物1标记的第二结合蛋白浓度为1.0×10- 3mg/mL～2.0×10-5mg/mL；发光物2标记内参质控浓度为2.0×10-4mg/mL～2.0×10-5mg/mL。
在其中一些实施例中，上述拟合标准曲线函数制备的步骤(2)中，所述不同浓度目标蛋白标准品样本数量n为5～8的整数，不同浓度间相差1-20倍。
在其中一些实施例中，上述检测方法为夹心免疫测定法或竞争性免疫测定法。
在其中一些实施例中，上述检测方法包括但不限于双抗体夹心法，双抗原夹心法，间接法，竞争法，中和抑制法。其中双抗体夹心法：使用特异性抗体与内参包被物包被固相载体，加入样本后，再加入含发光物1标记的特异性抗体与发光2标记的内参质控抗体，孵育洗涤后检测，含发光物1的信号与样本目标抗原的浓度呈正比，发光物2的信号值理论上为固定值；双抗原夹心法：使用特异性抗原与内参包被物包被固相载体，加入样本后，再加入含发光物1标记的特异性抗原与发光2标记的内参质控抗体，孵育洗涤后检测，含发光物1的信号与样本目标抗体的浓度呈正比，发光物2的信号值理论上为固定值；间接法：使用特异性抗原与内参包被物包被固相载体，加入样本后，再加入含发光物1标记的二抗与发光2标记的内参质控抗体，孵育洗涤后检测，含发光物1的信号与样本目标抗体的浓度呈正比，发光物2的信号值理论上为固定值；捕获法：使用鼠抗IgMμ链与内参包被物包被固相载体，加入样本后，再加入含发光物1标记的抗原与发光2标记的内参质控抗体，孵育洗涤后检测，含发光物1的信号与样本目标IgM抗体的浓度呈正比，发光物2的信号值理论上为固定值；竞争法：使用特异性抗原与内参包被物包被固相载体，加入样本后，再加入含发光物1标记的抗体与发光2标记的内参质控抗体，孵育洗涤后检测，含发光物1的信号与样本目标抗原的浓度呈反比，发光物2的信号值理论上为固定值；中和抑制法：使用特异性抗体与内参包被物包被固相载体，加入样本后与中和抗原，再加入含发光物1标记的抗体与发光2标记的内参质控抗体，孵育洗涤后检测，含发光物1的信号与样本目标抗体的浓度呈反比，发光物2的信号值理论上为固定值。
在其中一些实施例中，上述目标蛋白为抗原或抗体；进一步地，目标蛋白为抗原时，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的目标抗原的检测抗体，发光物2标记的内参质控抗体；目标蛋白为抗体时，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的目标抗体的检测抗原，发光物2标记的内参质控抗原。
本发明的目的之一还在于提出一种上述检测方法在抗原检测中的应用。
在其中一些实施例中，上述应用为在检测肌钙蛋白I中的应用。
本发明的目的之一还在于提出一种免疫检测试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下：
一种双标记免疫检测试剂盒，其包括有双标记免疫检测试剂，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的第二结合蛋白和发光物2标记的内参质控蛋白，发光物1与发光物2属于两种不同的发光物；以及包被有第一结合蛋白和内参蛋白的载体。
在其中一些实施例中，上述免疫检测试剂盒采用双抗体夹心法进行目标抗原检测，其包括针对目标抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体，分别作为固相抗体和标记抗体。
在其中一些实施例中，上述试剂盒为一种检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒。
在其中一些实施例中，上述检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒包括：包被板，双标记抗体工作液，肌钙蛋白I抗体标准品；所述包被板上包被有肌钙蛋白I抗体与鸡IgY；所述双标记抗体工作液包括铕标记肌钙蛋白I抗体和钐标记羊抗鸡IgY。
在其中一些实施例中，上述试剂盒的包被抗体中，肌钙蛋白I抗体浓度为1μg/mL-8μg/mL，鸡IgY浓度为0.1μg/mL-2μg/mL。
在其中一些实施例中，上述试剂盒的包被抗体中，肌钙蛋白I抗体浓度为2μg/mL-6μg/mL，鸡IgY浓度为0.2μg/mL-2.0μg/mL。
在其中一些实施例中，上述试剂盒的包被抗体中，肌钙蛋白I抗体浓度为3μg/mL-5μg/mL，鸡IgY浓度为0.5μg/mL-1.5μg/mL。
在其中一些实施例中，上述试剂盒的包被抗体中，肌钙蛋白I抗体浓度为4μg/mL，鸡IgY浓度为1μg/mL。
在其中一些实施例中，上述检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒的双标记抗体工作液中，铕标记肌钙蛋白I抗体浓度为0.5μg/mL-1.5μg/mL，钐标记羊抗鸡IgY浓度为0.05μg/mL-0.15μg/mL。
在其中一些实施例中，上述检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒的双标记抗体工作液中，铕标记肌钙蛋白I抗体浓度为1μg/mL，钐标记羊抗鸡IgY浓度为0.1μg/mL。
本发明的目的之一还在于提出一种定量检测肌钙蛋白I的方法。
包括如下技术方案：
一种定量检测肌钙蛋白I的方法，包括如下步骤：
(1)根据上述检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒，建立标准拟合曲线；
(2)取待测样本与双标记抗体工作液同时加入包被板；
(3)包被板在36℃～38℃孵育9～11分钟；
(4)孵育结束后，用洗涤工作液洗涤4～6次；
(5)包被板于室温下缓慢振荡后分别检测铕离子的荧光信号值T’和钐离子的荧光信号值C’，将通过公式T’rel＝(T’-B1)/(C’-B2)计算得到的T’rel作为该血清样本的相对信号值。将T’rel代入拟合曲线中，得到校准后的待测样本中肌钙蛋白I浓度值。
在其中一些实施例中，上述检测方法中的步骤(3)为包被板在37℃孵育10分钟；步骤(4)为孵育结束后，用洗涤工作液洗涤5次。
本发明的发明人基于对免疫检测技术的深入研究，提出了一种含内参的双标记免疫检测方法，用于检测样品中目标蛋白，通过将目标蛋白的第二结合蛋白和内参质控采用不同的标记物进行标记，包被于载体上的第一结合蛋白与目标蛋白和/或发光物1标记的第二结合蛋白特异性结合，包被于载体上的内参与发光物2标记的内参质控特异性结合，并结合其标记物信号值代入发明人建立的校正公式进行计算，再将计算结果代入基于标准物建立的拟合曲线中，从而反求出实际样本中目标蛋白浓度。使用该方法可以有效减少免疫检测试剂的检测结果受干扰因素影响导致精密度较差的问题，使得检测精密度能提高至CV<5％。
同时，基于该方法，发明人还设计了一种双标记免疫检测试剂盒，采用双抗体夹心法进行目标抗原检测，通过本发明方法制得的检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒，可降低干扰因素(包括孵育时间、孵育温度等)对检测结果的影响，从而提高检测精密度，为提高现有免疫定量分析检测准确性，确保在实际检测中得到更加准确的结果提供有力保障。
附图说明
图1为实施例1中发光物1、2标记原理图。
图2为实施例1中cTnI双标记检测试剂盒标准曲线图。
图3为实施例3中本发明双标试剂盒中不同内参浓度下检测结果图。
图4为实施例5中本发明双标试剂盒抗干扰能力检测结果图。
图5为实施例6中采用本发明双标试剂盒进行临床样本检测的结果统计对比图。
图6为实施例6中采用本发明双标试剂盒与贝克曼试剂盒检测结果对比分析图。
图7为实施例6中采用本发明双标试剂盒中的Eu信号结果与贝克曼试剂盒检测结果对比分析图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1cTnI的双标记试剂盒的制备及检测方法建立
以检测肌钙蛋白I(cTnI)为例，检测cTnI的双标记试剂盒的制备方法具体如下：
步骤一：cTnI抗体与鸡IgY的包被板制备。将4μg/mL的cTnI抗体(菲鹏生物cTnI-MCAB-29，表位24-40aa)与1μg/mL的鸡IgY(百奥莱博F050315)同时加入包被液，混匀半小时后，取100μl加入包被板，4℃静置22小时。洗涤包被板后，加入封闭液，37℃封闭3小时，晾干待用。
步骤二：铕标记cTnI抗体的制备。取β-二酮体类螯合剂铕与cTnI抗体(菲鹏生物cTnI-MCAB-22，表位86-90aa)进行常规标记。通过纯化，获得铕标记cTnI抗体，浓度为0.2mg/mL。
步骤三：钐标记羊抗鸡IgY的制备。取β-二酮体类螯合剂钐与羊抗鸡IgY(百奥莱博)于标记液中4℃静置反应24小时。通过纯化，获得钐标记羊抗鸡IgY，浓度为0.2mg/mL。
步骤四：cTnI双标记物的制备。铕标记cTnI抗体使用比例1:1000(铕标记cTnI抗体与标记缓冲液体积百分比为1:1000)，钐标记羊抗鸡IgY使用比例1:5000，同时加入标记缓冲液(50mM Tris，5％BSA，0.2％EDTA，0.1％P300防腐剂)混匀，作为cTnI双标记物。
涉及使用的仪器包括：酶标板孵育器、多通道洗板机、酶标检测仪、移液器。
根据上述制备方法制备得到的cTnI的双标记试剂盒的检测方法具体如下：
标准拟合曲线的建立
(1)检测双标记免疫检测试剂中两种发光物(铕离子与钐离子)的背景信号值B1、B2。
(2)准备6个不同浓度(具体浓度为：0、50、500、2500、10000、50000pg/mL)的目标抗原的标准品样本(购自海肽生物)，将每个样本分别采用步骤1中的双标记免疫检测试剂检测，得到6个铕离子的实测信号值T和6个钐离子的实测信号值C，即有6对数据(T，C)，具体为下表1-1所示。
表1-1
标准品浓度pg/mL T C
0 2146 49220
50 6325 52410
500 41033 48430
2500 179078 44240
10000 748733 46335
50000 2568727 45790
注：若检测试剂出现问题，Sm的信号值不在3.5W-6.5W之间，可以判定该次检测结果出现问题，则报告错误，再进行排查。
(3)将步骤(2)中得到的6对数据(T，C)按照运算公式：Trel＝(T-B1)/(C-B2)，得到6个新数据Trel，具体为下表1-2所示。
表1-2
Figure BDA0003262406560000091
Figure BDA0003262406560000101
(4)曲线拟合：将步骤(3)得到的Trel值作为纵坐标，将浓度值作为横坐标，进行四参数回归作为试剂盒的校准曲线，如图2所示，其中，横坐标为标准品浓度(pg/ml)，纵坐标为RLU(相对发光值)，得到对应的拟合曲线函数：y＝(155.26343-0.00300128)/(1+(x/85747.4)^-1.01845)+0.00300128。
实际待测样本采用双抗体夹心一步法检测，具体如下：
(1)取待测血清样本50ul与cTnI双标记物50ul同时加入cTnI抗体与鸡IgY的包被板。
(2)包被板在37℃孵育10分钟。
(3)孵育结束后，用洗涤工作液(100mM Tris-HCl，0.025％吐温20，0.1％P300防腐剂，PH7.2)洗涤5次。
(4)包被板于室温下缓慢振荡后分别检测铕离子信号(T’)与钐离子信号(C’)，将通过公式T’rel＝(T’-B1)/(C’-B2)计算得到的T’rel作为该血清样本的相对信号值。将相对信号值代入拟合曲线中，反求出该样本的cTnI浓度值。
实施例2 cTnI双标记试剂盒检测精密度比对
分别使用本发明检测cTnI的双标记试剂盒与采用自制的铕标记cTnI抗体的单标检测试剂盒(即与本发明cTnI双标记试剂盒相比)检测高低个两个质控(自制cTnI质控品，浓度分别为2500pg/mL和100pg/mL，抗原：海肽生物重组人心肌肌钙蛋白I8RTI7；质控品稀释液：100mM Tris-HCl，5％BSA，0.1％P300防腐剂，PH7.8)，其中双标记试剂盒采用实施例1所述检测方法，单标检测试剂盒按照常规单标记试剂盒的检测方法操作，各重复检测10次，计算精密度，结果如下：
表2-1
Figure BDA0003262406560000111
表2-2
Figure BDA0003262406560000112
备注：T1是指单标检测试剂盒的检测浓度结果；T2是指的双标记试剂盒的检测浓度结果。
根据上述检测结果统计对比可知，本发明检测cTnI的双标记试剂盒的结果精密度2.19％、3.4％，优于采用铕标记cTnI抗体的单标记试剂盒的检测精密度6.16％、5.18％，说明其检测性能良好。
实施例3内参标记浓度选择
1)质控浓度选择：钐标记羊抗鸡IgY(0.2mg/mL)使用比例选择1:2500，1:5000，1:10000，1:20000分别与铕标记cTnI抗体(0.2mg/mL)1:1000同时加入标记缓冲液混匀，作为cTnI双标记物(试剂)。
2)检测方法：
采用这4种双标记试剂，参考实施例1所述的双标记试剂盒制备方法及其检测方法，同时对相同来源的血清样本进行检测。
将分别检测得到的Eu3+信号与Sm3+信号，通过公式：(T-B1)/(C-B2)计算作为该血清样本的相对信号值。将相对信号值代入拟合曲线中，反求出该样本的cTnI浓度值。
3)检测结果
分别使用上述4组双标记试剂，重复检测10次，计算精密度，结果如图3所示，其中，Sm3+标记的质控信号随着使用浓度下降而降低，而信号值太低会导致质控信号的精密度变差，从而使质控的作用降低，检测样本浓度(Trel)的精密度变差。所以在不影响Eu3+检测样本的前提下，可以尽量选择保证检测样本浓度(Trel)较优的条件，即选择Sm3+使用浓度为1:5000作为最佳工作浓度，即内标抗体抗体：钐标记羊抗鸡IgY的最佳工作浓度为4×10-5mg/mL。
实施例4发光物的选择
1)发光物：根据如下实验组，对待检测抗体和内参质控抗体的标记物进行筛选。
A组：发光物1#:Eu3+(铕离子)；发光物2#:Sm3+(钐离子)
B组：发光物1#:吖啶酯；发光物2#:Eu3+
参考实施例1所述的双标记试剂盒制备方法及其检测方法，同时对实施例2中高浓度cTnI质控品(2500pg/mL)进行检测。
2)检测结果：分别使用2组双标记发光物，重复检测质控10次，计算精密度，结果如下表4-1所示：
表4-1
Figure BDA0003262406560000131
根据上表结果可知，A组均为时间分辨镧系金属元素的Eu3+与Sm3+对于仪器光源要求更单一，使用范围更广，但两种物质可能存在一定的交叉(<1％)。B组集成了发光物吖啶酯与时间分辨金属元素Eu3+的组合对仪器光源要求更高，但几乎不存在交叉。检测镧系元素可以通过时间分辨去除吖啶酯发光的干扰；检测吖啶酯发光时，不需要激光，故镧系元素也不发光，不存在镧系元素对吖啶酯的检测的干扰。以上结果可以看出使用不同的发光组检测精密度没有明显差异，均可以作为发光物的选择配对。
实施例5 cTnI双标记抗干扰能力
实际干扰因素：结合实际检测场景，分别设置如下干扰因素作为检测条件，通过使用本发明检测cTnI的双标记试剂盒与单标检测试剂盒(Eu试剂)各针对质控品(自制cTnI质控品，700pg/mL，抗原：海肽生物重组人心肌肌钙蛋白I8RTI7；质控品稀释液：100mMTris-HCl，5％BSA，0.1％P300防腐剂，PH7.8)进行3个测试，其中双标记试剂盒采用实施例1所述检测方法，单标检测试剂盒按照说明书方法操作，来评估试剂在实际检测中的抗干扰能力情况。
条件1：孵育时间分别为5min、10min、15min。
条件2：孵育温度分别为25℃、37℃、42℃。
条件3：样本加样量分别为25ul、50ul、75ul。
条件4：标记加样量分别为25ul、50ul、75ul。
对照条件(常规条件)：孵育时间10min、孵育温度37℃、样本加样量50ul、标记试剂加样量50ul。
检测结果如下表5-1所示：
表5-1
Figure BDA0003262406560000141
Figure BDA0003262406560000151
结合上表结果和图4，可以看出本发明检测cTnI的双标记试剂盒在孵育时常、孵育温度、标记加样量干扰下，针对质控检测结果的相对偏差仍然能控制在15％。较市售产品有显著优势，从结果看，Eu单标试剂(肌钙蛋白I测定试剂盒贝克曼)抗干扰能力比较差。但同时，样本加样量对两种试剂盒的检测结果仍然有一定影响，后续也将针对该情况进行进一步优化探索。
实施例6 cTnI双标记临床比对
使用本发明检测cTnI的双标记试剂盒与单标检测试剂盒(肌钙蛋白I测定试剂盒(化学发光法)贝克曼)同时检测30例阳性样本(样本于2021年1月11日收集于广州某医院)，对比检测结果。
检测结果如图5～7所示，其中图5为采用本发明双标试剂盒进行临床样本检测统计结果，图6为采用本发明双标试剂盒与贝克曼试剂盒检测结果对比分析，图7为采用本发明双标试剂盒中的Eu信号结果与贝克曼试剂盒检测结果对比分析，Eu的相对信号会随着Sm的信号改变，改变后相关测试的Eu信号结果通过与Sm信号结果通过(T-B1)/(C-B2)计算，可以提高检测试剂与对照试剂的相关性，R2相关性(T-B1)/(C-B2)试剂为0.9851；Eu试剂为0.9732，通过上述对比分析可知，双标试剂盒可以提高检测结果的准确度，达到与对照结果更优的相关性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (17)

1.一种用于样品中目标蛋白的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供载体，所述载体上包被有第一结合蛋白和内参蛋白；
加入待测样本和双标记免疫检测试剂，其中，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的第二结合蛋白和发光物2标记的内参质控蛋白，所述发光物1与发光物2属于两种不同的发光物，所述第二结合蛋白能够与目标蛋白特异性结合，所述第一结合蛋白与目标蛋白和/或发光物1标记的第二结合蛋白特异性结合，所述内参蛋白与发光物2标记的内参质控蛋白特异性结合；
孵育反应后，洗涤去除未结合的双标记免疫检测试剂；
检测得到发光物1的荧光信号值T’和发光物2的荧光信号值C’，将其按照T’rel＝(T’-B1)/(C’-B2)，进行运算得到T’rel，将T’rel代入拟合标准曲线函数中得到对应浓度值，得到校准后的待测样本中分析物的浓度值；其中，B1、B2分别为发光物1与发光物2的背景信号检测值。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述拟合标准曲线函数的制备包括如下步骤：
(1)检测双标记免疫检测试剂中两种发光物的背景信号值，分别为B1、B2；
(2)准备n个不同浓度的目标蛋白标准品样本，将每个样本分别采用步骤(1)中的所述双标记免疫检测试剂进行检测，得到n个发光物1的荧光信号值T和n个发光物2的荧光信号值C；
(3)将步骤(2)中得到的荧光信号值T和荧光信号值C按照公式：Trel＝(T-B1)/(C-B2)，计算得到n个新数据Trel；
(4)曲线拟合：将步骤(3)得到的Trel值作为纵坐标，将目标蛋白标准品的浓度值作为横坐标，进行四参数回归得到对应的拟合曲线函数，作为试剂盒的校准曲线。
3.根据权利要求1-2任一项所述检测方法，其特征在于，所述双标记免疫检测试剂中的发光物1和发光物2为分别独立选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素和镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意不同两种。
4.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，所述发光物1和发光物2不同，所述发光物1选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素中的任意一种，所述发光物2选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意一种；
或，所述发光物1选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意一种，所述发光物2选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素中的任意一种。
5.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，所述发光物1和发光物2为分别独立选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意不同两种。
6.根据权利要求1-2任一项所述检测方法，其特征在于，所述内参质控蛋白选自鸡IgY、羊抗鸡IgY、生物素、亲和素、兔IgG、羊抗兔IgG中的任意一种。
7.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述发光物1标记的第二结合蛋白浓度为1.0×10-3mg/mL～2.0×10-5mg/mL；发光物2标记内参质控蛋白浓度为2.0×10-4mg/mL～2.0×10-5mg/mL。
8.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，所述拟合标准曲线函数制备的步骤(2)中，所述不同浓度目标蛋白标准品样本数量n为5～8的整数，不同浓度间相差1-20倍。
9.根据权利要求1-8任一项所述检测方法，其特征在于，所述检测方法为夹心免疫测定法或竞争性免疫测定法。
10.根据权利要求9所述检测方法，其特征在于，所述目标蛋白为抗原或抗体；
进一步地，目标蛋白为抗原时，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的目标抗原的检测抗体，发光物2标记的内参质控抗体；
目标蛋白为抗体时，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的目标抗体的检测抗原，发光物2标记的内参质控抗原。
11.权利要求1-10任一项所述检测方法在抗原检测中的应用。
12.根据权利要求11所述应用，其特征在于，所述应用为在检测肌钙蛋白I中的应用。
13.一种双标记免疫检测试剂盒，其特征在于，所述免疫检测试剂盒包括有双标记免疫检测试剂，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的第二结合蛋白和发光物2标记的内参质控蛋白，发光物1与发光物2属于两种不同的发光物；以及包被有第一结合蛋白和内参蛋白的载体。
14.一种检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒，其特征在于，所述检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒包括：包被板，双标记抗体工作液，肌钙蛋白I抗体标准品；
所述包被板上包被有肌钙蛋白I抗体与鸡IgY；
所述双标记抗体工作液包括铕标记肌钙蛋白I抗体和钐标记羊抗鸡IgY。
15.根据权利要求14所述检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒，其特征在于，所述包被抗体中，肌钙蛋白I抗体浓度为1μg/mL-8μg/mL，鸡IgY浓度为0.1μg/mL-2μg/mL。
16.根据权利要求14-15任一项所述检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒，其特征在于，所述双标记抗体工作液中，铕标记肌钙蛋白I抗体浓度为0.5μg/mL-1.5μg/mL，钐标记羊抗鸡IgY浓度为0.2μg/mL-2.0μg/mL。
17.一种定量检测肌钙蛋白I的方法，包括如下步骤：
(1)根据权利要求14-16任一项所述检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒，建立标准拟合曲线；
(2)取待测样本与双标记抗体工作液同时加入包被板；
(3)包被板在36℃～38℃孵育9～11分钟；
(4)孵育结束后，用洗涤工作液洗涤4～6次；
(5)包被板于室温下缓慢振荡后分别检测铕离子的荧光信号值T’和钐离子的荧光信号值C’，将通过公式T’rel＝(T’-B1)/(C’-B2)计算得到的T’rel作为该血清样本的相对信号值。将T’rel代入拟合曲线中，得到校准后的待测样本中肌钙蛋白I浓度值。
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