CN110031635A - 闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白i/t的方法 - Google Patents

闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白i/t的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法，以血清作为待测样品；包括以下步骤：抗体Ⅰ偶联发光底物，得抗体Ⅰ‑A；抗体Ⅱ偶联辣根过氧化物酶，抗体Ⅱ‑HRP；设计两种检测体系，将检测体系孵育后加入激发液，立即检测发光信号；先将cTnI/cTnT样品进行梯度稀释后作为样本进行检测，从而获得发光信号和心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T浓度所对应的公式；然后将待测样品作为样本进行检测，从而最终获得待测样品中心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的浓度。采用该方法检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T，具有快速、高灵敏度的特点。

Description

闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/T的方法
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种闪光型均相化学发光法检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法。
背景技术
心肌肌钙蛋白是一种蛋白络合物，分布于心肌原肌球蛋白上的规则间隙，调控心脏肌肉收缩。由心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)和心肌肌钙蛋白C(cTnC)三种亚单位组成。其中，cTnT和cTnI有独特的氨基酸序列，具有很好的心肌特异性。cTnT和cTnI在正常人体血清中含量极微，当心肌细胞受损后游离的cTnT和cTnI从心肌细胞内迅速释放进入血液，使血中浓度迅速升高。CTnT半衰期很短只有2小时，游离cTnI的半衰期为2小时到5天。在临床使用中，心肌肌钙蛋白T(cTnT)是能预测急性冠状动脉综合症(ACS)短期、中期甚至长期结局的一种独立的预后诊断标志物。CTnT还常用于判断急性心肌梗死大小，也可用于评估患者的溶栓疗法成功与否。心肌肌钙蛋白I(cTnI)是一个十分敏感和特异的急性心肌梗死标志物，心肌损伤后4～6小时释放入血，达到诊断决定值。对其连续测定可用于急性心肌梗死的诊断、动态检测及疗效观察。也可用于评估溶栓治疗的效果，对不稳定心绞痛预后判断有极其重要的意义。
心肌肌钙蛋白检测方法最早都是使用放射免疫法(RIA)测定，操作复杂，反应时间长，且存在放射污染的危险，因此逐步被更安全简单的方法取代。自八十年代开始，由于各种非放免技术的发展和相应自动化仪器的诞生，逐渐代替了RIA方法。目前临床应用比较普遍的检测cTnI的方法主要有胶体金免疫检测、酶联免疫检测和化学发光免疫检测等。胶体金试纸检测法具有操作简单快捷使用方便，不受时间地点限制，适合于床旁检测等优点，然而只能够定性的检测样本的结果，并受主观因素影响，检测灵敏度低常有假阴性发生。也有研究者开发一种辅助检测设备读取光信号值，达到相对定量避免主观因素的效果。相对于胶体金免疫检测法，酶联免疫检测和化学发光免疫检测更加准确，误差更小，可以实现定量检测，并且灵敏度更高。但是检测体系中需要载体，检测过程中需要洗涤等步骤，操作繁琐检测用时长，也增加检测的成本，并且仪器成本也相对较高。
目前现有的利用化学发光免疫技术检测心肌肌钙蛋白I的方法为：磁微粒化学发光免疫分析法。该方法是将生物素标记的抗体、待测抗原与碱性磷酸酶标记的抗体形成“三明治”结构的复合物。随后加入连有链霉亲和素的磁性微粒，通过链霉亲和素与生物素的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离。去上清后清洗磁微粒复合物，加入发光底物，通过发光仪检测反应的发光强度，发光强度与待测抗原含量呈正比，使用相应的计算方法即可计算出样本中待测抗原的浓度。该方法使用磁微粒作为固相支持物，检测过程中需要外加磁场，并且需要洗涤步骤，因此存在操作繁琐，检测用时长的缺陷。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏度的闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法，以血清作为待测样品；包括以下步骤：
1)、抗体Ⅰ偶联发光底物，得抗体Ⅰ-A；
2)、抗体Ⅱ偶联辣根过氧化物酶，抗体Ⅱ-HRP；
3)、检测：
分成以下两种方式：
方式一、当抗体Ⅰ、抗体Ⅱ为靶标cTnI/cTnT的两个特异性抗体时，在样本中加入本底抑制剂、抗体Ⅰ-A和抗体Ⅱ-HRP，从而组成检测体系；
方式二、当抗体Ⅰ、抗体Ⅱ为靶标cTnI/cTnT的两个特异性抗体的抗体时，在样本中加入本底抑制剂、抗体Ⅰ-A、抗体Ⅱ-HRP以及靶标cTnI/cTnT的两个特异性抗体，从而组成检测体系；
将上述检测体系(37±0.5)℃孵育(15±1)分钟；然后加入激发液，立即检测发光信号(立即检测1秒钟内产生的发光信号)；
4)、判定：
先将cTnI/cTnT样品进行梯度稀释后(为定标品，采用PBS缓冲液(PH＝7.4)进行稀释)作为样本按照上述步骤3)进行检测，从而获得发光信号和心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T浓度所对应的公式；
然后将待测样品作为样本按照上述步骤3)进行检测，从而获得待测样品发光信号，再将待测样品发光信号代入上式公式内，从而最终获得待测样品中心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的浓度。
作为本发明的闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法的改进：
当检测心肌肌钙蛋白I时：
抗体Ⅰ为cTnI单克隆抗体Ⅰ或山羊抗鼠IgG二抗，所述抗体Ⅰ-A为cTnI-A或GAM-A；
抗体Ⅱ为cTnI单克隆抗体Ⅱ或山羊抗兔IgG二抗，所述抗体Ⅱ-HRP为cTnI-HRP或GAR-HRP；
cTnI检测抗体：抗cTnI鼠单克隆抗体、抗cTnI兔单克隆抗体；
当检测心肌肌钙蛋白T时：
抗体Ⅰ为cTnT单克隆抗体Ⅰ或山羊抗鼠IgG二抗，抗体Ⅰ-A为cTnT-A或GAM-A；
抗体Ⅱ为cTnT单克隆抗体Ⅱ或山羊抗兔IgG二抗，抗体Ⅱ-HRP为cTnT-HRP或GAR-HRP；
cTnT检测抗体：抗cTnT鼠单克隆抗体、抗cTnT兔单克隆抗体。
作为本发明的闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法的进一步改进：
一、检测心肌肌钙蛋白I：
所述步骤1)中：抗体Ⅰ为cTnI单克隆抗体Ⅰ，发光底物为9，10-二氢吖啶，所得的得抗体Ⅰ-A为cTnI-A；
所述步骤2)中：抗体Ⅱ为cTnI单克隆抗体Ⅱ，所得的抗体Ⅱ-HRP为cTnI-HRP；
所述步骤3)中，采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将制备的cTnI-A和cTnI-HRP分别稀释1500倍和20000倍，检测时，cTnI-A稀释液、cTnI-HRP稀释液、待测样品分别加50ul，再加入10ul本底抑制剂；37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测(立即检测1秒钟内产生的发光信号)；
所述步骤4)中，所对应的公式为y＝3.60391+0.59661x(r^2＝0.98375)；
二、检测心肌肌钙蛋白T：
所述步骤1)中：抗体Ⅰ为cTnT单克隆抗体Ⅰ，发光底物为9，10-二氢吖啶，所得的得抗体Ⅰ-A为cTnT-A；
所述步骤2)中：抗体Ⅱ为cTnT单克隆抗体Ⅱ，所得的抗体Ⅱ-HRP为cTnT-HRP；
所述步骤3)中，采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将制备的cTnT-A和cTnT-HRP分别稀释800倍和10000倍，检测时，cTnT-A稀释液、cTnT-HRP稀释液、待测样品分别加50ul，再加入10ul本底抑制剂；37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测(立即检测1秒钟内产生的发光信号)；
所述步骤4)中，所对应的公式为y＝3.47698+0.67069x(r^2＝0.98503)。
作为本发明的闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法的进一步改进：
一、检测心肌肌钙蛋白I：
所述步骤1)中：抗体Ⅰ为山羊抗鼠IgG二抗，发光底物为9，10-二氢吖啶，所得的得抗体Ⅰ-A为GAM-A；
所述步骤2)中：抗体Ⅱ为山羊抗兔IgG二抗，所得的抗体Ⅱ-HRP为GAR-HRP；
所述步骤3)中，采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将制备的GAM-A和GAR-HRP分别稀释1000倍和15000倍，检测时，cTnI检测抗体、GAM-A稀释液、GAR-HRP稀释液、待测样品分别加50ul，再加入2ul本底抑制剂；37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测(立即检测1秒钟内产生的发光信号)
所述步骤4)中，所对应的公式为y＝3.86949+0.58246x(r^2＝0.98076)；
二、检测心肌肌钙蛋白T：
所述步骤1)中：抗体Ⅰ为山羊抗鼠IgG二抗，发光底物为9，10-二氢吖啶，所得的得抗体Ⅰ-A为GAM-A；
所述步骤2)中：抗体Ⅱ为山羊抗兔IgG二抗，所得的抗体Ⅱ-HRP为GAR-HRP；
所述步骤3)中，采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将制备的GAM-A和GAR-HRP分别稀释800倍和10000倍，检测时，cTnT检测抗体、GAM-A稀释液、GAR-HRP稀释液、待测样品分别加50ul，再加入2ul本底抑制剂；37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测(立即检测1秒钟内产生的发光信号)
所述步骤4)中，所对应的公式为y＝3.66056+0.64391x(r^2＝0.96360)。
上述方程是双对数直线拟合模型的直线回归方程，x＝lg cTnI/cTnT浓度，y＝lg发光强度，即x是cTnI/cTnT浓度(ng/ml)的以10为底的对数，y是发光强度的以10为底的对数。
作为本发明闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法的进一步改进：
本底抑制剂为浓度为10mM抗坏血酸水溶液、1mM 2-氨基苯酚水溶液。
本发明的方法，只需经过以下几个步骤：首先，用抗体Ⅰ连接发光底物；抗体Ⅱ连接辣根过氧化物酶；然后，加入待测样本以及本底抑制剂(方式二，还需要加入检测抗体)；最后，加入激发液后，立即检测发光信号值。
本发明提供一种闪光型均相化学发光技术，用于均相、快速、高灵敏度的cTnI/cTnT检测，与已知方法相比更简单化更高效。该技术的特征在于结合了抗体Ⅰ的发光底物可以与结合了抗体Ⅱ的辣根过氧化物酶，在靶标cTnI/cTnT存在的体系中发生免疫反应形成免疫复合物。其中抗体Ⅰ和抗体Ⅱ可以是靶标的两个特异性抗体，也可以靶标的两个特异性抗体的抗体。就靶标cTnI而言，抗体Ⅰ-A为cTnI-A或GAM-A，抗体Ⅱ-HRP为cTnI-HRP或GAR-HRP；就靶标cTnT而言，抗体Ⅰ-A为cTnT-A或GAM-A，抗体Ⅱ-HRP为cTnT-HRP或GAR-HRP；该复合物中发光底物与辣根过氧化物酶彼此靠近，在激发液的作用下产生闪光型化学发光反应，其化学发光强度与靶标cTnI/cTnT的多少成正比。未结合的过量抗体Ⅰ发光底物和抗体Ⅱ过氧化氢酶无需洗涤去除，在本底抑制剂的作用下，不影响化学发光反应和检测结果。因此，该检测cTnI/cTnT的方法不需要磁珠、微球、固相载体等支持物，均相反应体系无需洗涤操作，使免疫反应更加充分，操作简单高效。
本发明具有如下技术优势：
1、本检测方法不需要以微孔板、磁珠或微球等作为载体包被抗体，检测抗体能够与待测分析物充分进行免疫反应，没有洗涤操作，因此检测过程中无洗涤废液，是一种真正意义上的均相化学发光技术。
2、本检测方法是闪光型均相化学发光技术，通过加入本底抑制剂消除干扰，降低背景信号值，加入激发液后可以立即检测发光信号值，检测灵敏度高，重复性好。
3、本检测方法抗体用量少成本低，生产工艺简单易于放大生产，并且检测过程便捷对于检测仪器要求低，易于实现全自动化。
4、操作简单用时少，灵敏度高、重复性好，对检测仪器要求低。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是闪光型均相化学发光法检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的示意图(实施例1-1、实施例2-1)。
图2是闪光型均相化学发光法检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T示意图；其应用靶标cTnI/cTnT不同种属检测抗体相对应的二抗进行标记，发生免疫反应进行检测(实施例1-2、实施例2-2)。
图3是应用闪光型均相化学发光法检测cTnI的计算公式，其中cTnI分别稀释在PBS缓冲液和血清中。
图4是闪光型均相化学发光法应用cTnI不同种属检测抗体相对应的二抗进行标记，检测cTnI的计算公式，其中cTnI分别稀释在PBS缓冲液和血清中。
图5是应用闪光型均相化学发光法检测cTnT的计算公式，其中cTnT分别稀释在PBS缓冲液和血清中。
图6是闪光型均相化学发光法应用cTnT不同种属检测抗体相对应的二抗进行标记，检测cTnT的计算公式，其中cTnT分别稀释在PBS缓冲液和血清中。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明中：
室温是指15～25℃；旋转的转速为20转/分钟～40转/分钟。
本发明中的各项成分均能通过常规的市购方式获得，例如：
cTnI单克隆抗体Ⅰ为购自艾博抗(上海)贸易有限公司的ab47003，采用PBS缓冲液(PH＝7.4)溶剂稀释至所需浓度；
cTnI单克隆抗体Ⅱ为购自杭州南仙生物技术公司的NX021，采用PBS缓冲液(PH＝7.4)溶剂稀释至所需浓度；
cTnI标准品为购自杭州南仙生物技术公司的NX001；
cTnI阴性血清由杭州南仙生物技术有限公司提供；
cTnT单克隆抗体Ⅰ为购自杭州南仙生物技术公司的NX031，采用PBS缓冲液(PH＝7.4)溶剂稀释至所需浓度；
cTnT单克隆抗体Ⅱ为购自杭州南仙生物技术公司的NX032，采用PBS缓冲液(PH＝7.4)溶剂稀释至所需浓度；
cTnT标准品为购自杭州南仙生物技术公司的NX005；
cTnT阴性血清由杭州南仙生物技术有限公司提供；
山羊抗鼠IgG二抗为购自艾比玛特医药科技(上海)有限公司的B30008型号/代号，采用PBS缓冲液(PH＝7.4)溶剂稀释至所需浓度；
山羊抗兔IgG二抗为购自艾比玛特医药科技(上海)有限公司的B30009型号/代号，采用PBS缓冲液(PH＝7.4)溶剂稀释至所需浓度；
抗cTnI鼠单克隆抗体为购自杭州南仙生物技术公司的NX022；
抗cTnI兔单克隆抗体为购自艾博抗(上海)贸易有限公司的ab52862；
抗cTnT鼠单克隆抗体为购自杭州南仙生物技术公司的NX033；
抗cTnT兔单克隆抗体为购自艾博抗(上海)贸易有限公司的ab92546；
PBS缓冲液为0.01M PBS缓冲液(PH＝7.4)。
没有明确告知的溶液，均以水为溶剂。
实施例1-1、一种闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I的方法
cTnI单克隆抗体Ⅰ与发光底物9，10-二氢吖啶偶联，cTnI单克隆抗体Ⅱ与辣根过氧化物酶偶联，用于闪光型均相化学发光法检测心肌肌钙蛋白I；依次进行以下步骤：
1)、cTnI单克隆抗体Ⅰ偶联9，10-二氢吖啶：
将1mg发光底物9，10-二氢吖啶溶解于2ml DMF中，得9，10-二氢吖啶溶液；
取9，10-二氢吖啶溶液100ul加入100ul浓度为10mg/ml的cTnI单克隆抗体Ⅰ中，然后加入0.05M硼酸缓冲液(PH8.8)800ul，室温旋转反应1小时。
将所得的反应溶液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于PBS缓冲液(PH＝7.4)中4℃透析1天(24h)，期间更换3次PBS缓冲液(PH＝7.4)，透析结束后，保留于透析袋内的截留液即为连接9，10-二氢吖啶的cTnT单克隆抗体Ⅰ(cTnI-A)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
保存液的制备方法为：在1000ml的PBS缓冲液(PH＝7.4)中加入0.5ml的Proclin-300。
2)、cTnI单克隆抗体Ⅱ与辣根过氧化物酶偶联：
称取0.5mg HRP(辣根过氧化物酶)溶解于100ul去离子水中再加入200ul新配的0.1M过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌30分钟。将上述反应液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜(12h)。
透析结束后，向保留于透析袋内的截留液加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液20ul后，立即加入100ul浓度为10mg/ml的cTnI单克隆抗体Ⅱ，然后加入0.01M碳酸盐缓冲液(PH9.5)600ul，室温避光轻轻搅拌2小时。再加100ul新配的4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后置于4℃反应2小时。
将所得的反应液加入SUPERDEX 200凝胶过滤柱纯化，具体为：将150ml SUPERDEX200填料装柱，用PBS缓冲液(PH＝7.4)冲洗平衡2个柱体积，流速为2ml/min。平衡结束后，将上述反应液上样，用PBS缓冲液(PH＝7.4)进行冲洗，流速2ml/min，收取OD值0.5以上的第一个吸收峰，得到纯化的cTnI单克隆抗体Ⅱ与辣根过氧化物酶偶联产物(cTnI-HRP)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
3)、检测：
配制激发液：25mM tris(pH 8.0)，8mM对羟基肉桂酸，1mM EDTA，0.2％吐温-20和100mM过氧化脲。
即，激发液的制备方法为：在25mmol tris，8mmol对羟基肉桂酸，1mmol EDTA，2ml吐温-20、100mmol过氧化脲中加入去离子水定容至1000ml；然后调节pH 8.0。
配制本底抑制剂：浓度为10mM抗坏血酸水溶液。
即，1000ml本底抑制剂由10mmol抗坏血酸和作为余量的去离子水组成。
cTnI样品：取cTnI标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至以下不同浓度值100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml，4℃保存，作为定标品。另取cTnI标准品用cTnI阴性血清稀释至100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml，作为待测样品。
先将每个浓度的定标品作为样本进行如下的加样检测：
加样检测：
采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将上述制备的cTnI-A和cTnI-HRP分别稀释1500体积倍和20000体积倍，从而分别获得cTnI-A稀释液和cTnI-HRP稀释液；
反应体系为：cTnI-A稀释液、cTnI-HRP稀释液、定标品(作为样本)各50ul，10ul本底抑制剂；
将上述反应体系于透明反应管中37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测(立即检测1秒钟内产生的发光信号)。
检测于PLM01均相发光检测仪器上进行，设定该仪器的参数为100毫秒读值一次，读取100次，从而获得发光信号值。
根据每个浓度的定标品所得的发光信号值和其所对应的cTnI浓度值，建立相应的检测cTnI的曲线Ⅰ和计算公式，计算公式为y＝3.60391+0.59661x(r^2＝0.98375)。
再将每个浓度的待测样品替代定标品作为样本，按照如上的加样检测法进行检测，所得结果为：根据每个浓度的待测样品所得的发光信号值和其所对应的cTnI浓度值，建立相应的检测cTnI的曲线Ⅱ。
如图3所述，曲线Ⅰ与曲线Ⅱ非常接近。
如图3，应用闪光型均相化学发光法检测cTnI，PBS梯度稀释的cTnI最低检测限为0.01ng/ml，与在血清中检测的灵敏度基本相同。线性范围为4个数量级。
实施例1-2、一种闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I的方法：
山羊抗鼠IgG二抗与发光底物9，10-二氢吖啶偶联，山羊抗兔IgG二抗与辣根过氧化物酶偶联，用于闪光型均相化学发光法检测心肌肌钙蛋白I。依次进行以下步骤：
1)、山羊抗鼠IgG二抗偶联9，10-二氢吖啶：
将1mg发光底物9，10-二氢吖啶溶解于2ml DMF中，得9，10-二氢吖啶溶液；
取9，10-二氢吖啶溶液100ul加入100ul浓度为10mg/ml的山羊抗鼠IgG二抗中，然后加入0.05M硼酸缓冲液(PH8.8)800ul，室温旋转反应1小时。
将所得的反应溶液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于PBS缓冲液(PH＝7.4)中4℃透析1天(24h)，期间更换3次PBS缓冲液(PH＝7.4)；透析结束后，保留于透析袋内的截留液即为连接9，10-二氢吖啶的山羊抗鼠IgG二抗(GAM-A)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
2)、山羊抗兔IgG二抗与辣根过氧化物酶偶联：
称取0.5mg HRP溶解于100ul去离子水中再加入200ul新配的0.1M过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌30分钟。将上述反应液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜(12h)。
透析结束后，向保留于透析袋内的截留液加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液20ul后，立即加入100ul浓度为10mg/ml的山羊抗兔IgG二抗，然后加入0.01M碳酸盐缓冲液(PH9.5)600ul，室温避光轻轻搅拌2小时。再加100ul新配的4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后置于4℃反应2小时。
将所得的反应液加入SUPERDEX 200凝胶过滤柱纯化，具体为：将150ml SUPERDEX200填料装柱，用PBS缓冲液(PH＝7.4)冲洗平衡2个柱体积，流速为2ml/min。平衡结束后，将上述反应液上样，用PBS缓冲液(PH＝7.4)进行冲洗，流速2ml/min，收取OD值0.5以上的第一个吸收峰，得到纯化的山羊抗兔IgG二抗与辣根过氧化物酶偶联产物(GAR-HRP)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
3)、检测
配制激发液：25mM tris(pH 8.0)，8mM对羟基肉桂酸，1mM EDTA，0.2％吐温-20和8mM过氧化脲。
配制本底抑制剂：1mM 2-氨基苯酚水溶液。
cTnI样品：取cTnI标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至不同浓度值100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml，4℃保存，作为定标品。另取cTnI标准品用cTnT阴性血清稀释至100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml；作为待测样品。
cTnI检测抗体溶液：0.4ug/ml抗cTnI鼠单克隆抗体，0.02ug/ml抗cTnI兔单克隆抗体于PBS缓冲液(PH＝7.4)中。
即，cTnI检测抗体溶液的制备方法为：0.4ug抗cTnI鼠单克隆抗体、0.02ug抗cTnI兔单克隆抗体中加入PBS缓冲液(PH＝7.4)定容至1ml。
先将每个浓度的定标品作为样本进行如下的加样检测：
加样检测：
采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将上述制备的GAM-A和GAR-HRP分别稀释1000倍(体积倍)和15000倍(体积倍)，从而分别获得GAM-A稀释液和GAR-HRP稀释液；
反应体系为：cTnI检测抗体溶液、GAM-A稀释液、GAR-HRP稀释液、定标品各50ul，2ul本底抑制剂；
将上述反应体系于透明反应管中37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测(立即检测1秒钟内产生的发光信号)。
检测于PLM01均相发光检测仪器上进行，设定该仪器的参数为100毫秒读值一次，读取100次，从而获得发光信号值。
根据每个浓度的定标品所得的发光信号值和其所对应的cTnI浓度值，建立相应的检测cTnI的曲线Ⅰ和计算公式，计算公式为y＝3.86949+0.58246x(r^2＝0.98076)。
再将每个浓度的待测样品替代定标品作为样本，按照如上的加样检测法进行检测，所得结果为：根据每个浓度的待测样品所得的发光信号值和其所对应的cTnI浓度值，建立相应的检测cTnI的计曲线Ⅱ。
如图4所述，曲线Ⅰ与曲线Ⅱ非常接近。
如图4，应用闪光型均相化学发光法检测cTnI，PBS梯度稀释的cTnI最低检测限为0.01ng/ml，与在血清中检测的灵敏度基本相同。线性范围为4个数量级。
实验一、以下述5种血清作为待测样本，分别按照上述实施例1-1、实施例1-2所述方法进行检测，所得结果如下表1所述。
血清样品A：事先经化学发光免疫分析法检测为cTnI阴性血清；
血清样品B：在事先经化学发光免疫分析法检测为cTnI阴性血清中加入心肌肌钙蛋白I至浓度为0.1ng/ml；
血清样品C：在事先经化学发光免疫分析法检测为cTnI阴性血清中加入心肌肌钙蛋白I至浓度为10ng/ml；
血清样品D：在事先经化学发光免疫分析法检测为cTnI阴性血清中加入心肌肌钙蛋白I浓度为0.45ng/ml的血清；
血清样品E：在事先经化学发光免疫分析法检测为cTnI阴性血清中加入心肌肌钙蛋白I浓度为25.32ng/ml的血清；
表1
对比例1-1、将实施例1-1中的本底抑制剂改成1mM抗坏血酸水溶液；其余等同于实施例1-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例1-2、将实施例1-1中的本底抑制剂改成50mM抗坏血酸水溶液；其余等同于实施例1-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例1-3、将实施例1-1中的本底抑制剂改成10mM二乙基羟胺水溶液；其余等同于实施例1-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例2-1、将实施例1-1中的发光底物由9，10-二氢吖啶改成吖啶酯；用量不变；其余等同于实施例1-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例2-2、将实施例1-1中的发光底物由9，10-二氢吖啶改成AMPPD(1，2-二氧环已烷衍生物)；用量不变；其余等同于实施例1-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例3-1、将实施例1-1中的HRP(辣根过氧化物酶)改成碱性磷酸酶；用量不变；其余等同于实施例1-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例3-2、将实施例1中的HRP(辣根过氧化物酶)改成β-半乳糖苷酶；用量不变；其余等同于实施例1-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比实验1、按照上述对比例所示方法对实验一所述的5种血清样品进行检测，最终所得的浓度结果如下表2所述。
表2、浓度结果(ng/ml)
血清样品A 血清样品B 血清样品C 血清样品D 血清样品E
实施例1-1 0 0.1 10.69 0.44 24.56
对比例1-1 0 0 2.05 0 5
对比例1-2 0 0 1.54 0 2.3
对比例1-3 0 0.45 27 1.1 77
对比例2-1 0 0 0 0 0
对比例2-2 0 0 0 0 0
对比例3-1 0 0 0 0 0
对比例3-2 0 0 0 0 0
实施例2-1、一种闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白T的方法
cTnT单克隆抗体Ⅰ与发光底物9，10-二氢吖啶偶联，cTnT单克隆抗体Ⅱ与辣根过氧化物酶偶联，用于闪光型均相化学发光法检测心肌肌钙蛋白T；依次进行以下步骤：
1)、cTnT单克隆抗体Ⅰ偶联9，10-二氢吖啶：
将1mg发光底物9，10-二氢吖啶溶解于2ml DMF中，得9，10-二氢吖啶溶液；
取9，10-二氢吖啶溶液100ul加入100ul浓度为10mg/ml的cTnT单克隆抗体Ⅰ中，然后加入0.05M硼酸缓冲液(PH8.8)800ul，室温旋转反应1小时。
将所得的反应溶液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于PBS缓冲液(PH＝7.4)中4℃透析1天(24h)，期间更换3次PBS缓冲液(PH＝7.4)，透析结束后，保留于透析袋内的截留液即为连接9，10-二氢吖啶的cTnT单克隆抗体Ⅰ(cTnT-A)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
保存液的制备方法为：在1000ml的PBS缓冲液(PH＝7.4)中加入0.5ml的Proclin-300。
2)、cTnT单克隆抗体Ⅱ与辣根过氧化物酶偶联：
称取0.5mg HRP(辣根过氧化物酶)溶解于100ul去离子水中再加入200ul新配的0.1M过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌30分钟。将上述反应液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜(12h)。
透析结束后，向保留于透析袋内的截留液加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液20ul后，立即加入100ul浓度为10mg/ml的cTnT单克隆抗体Ⅱ，然后加入0.01M碳酸盐缓冲液(PH9.5)600ul，室温避光轻轻搅拌2小时。再加100ul新配的4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后置于4℃反应2小时。
将所得的反应液加入SUPERDEX 200凝胶过滤柱纯化，具体为：将150ml SUPERDEX200填料装柱，用PBS缓冲液(PH＝7.4)冲洗平衡2个柱体积，流速为2ml/min。平衡结束后，将上述反应液上样，用PBS缓冲液(PH＝7.4)进行冲洗，流速2ml/min，收取OD值0.5以上的第一个吸收峰，得到纯化的cTnT单克隆抗体Ⅱ与辣根过氧化物酶偶联产物(cTnT-HRP)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
3)、检测：
配制激发液：25mM tris(pH 8.0)，8mM对羟基肉桂酸，1mM EDTA，0.2％吐温-20和100mM过氧化脲。
配制本底抑制剂：浓度为10mM抗坏血酸水溶液。
cTnT样品：取cTnT标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至以下不同浓度值100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml，4℃保存，作为定标品。另取cTnT标准品用cTnT阴性血清稀释至100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml，作为待测样品。
先将每个浓度的定标品作为样本进行如下的加样检测：
加样检测：
采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将上述制备的cTnT-A和cTnT-HRP分别稀释800体积倍和10000体积倍，从而分别获得cTnT-A稀释液和cTnT-HRP稀释液；
反应体系为：cTnT-A稀释液、cTnT-HRP稀释液、定标品(作为样本)各50ul，10ul本底抑制剂；
将上述反应体系于透明反应管中37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测(立即检测1秒钟内产生的发光信号)。
检测于PLM01均相发光检测仪器上进行，设定该仪器的参数为100毫秒读值一次，读取100次，从而获得发光信号值。
根据每个浓度的定标品所得的发光信号值和其所对应的cTnT浓度值，建立相应的检测cTnT的曲线Ⅰ和计算公式，计算公式y＝3.47698+0.67069x(r^2＝0.98503)。
再将每个浓度的待测样品替代定标品作为样本，按照如上的加样检测法进行检测，所得结果为：根据每个浓度的待测样品所得的发光信号值和其所对应的cTnT浓度值，建立相应的检测cTnT的曲线Ⅱ。
如图5所述，曲线Ⅰ与曲线Ⅱ非常接近。
如图5，应用闪光型均相化学发光法检测cTnT，PBS梯度稀释的cTnT最低检测限为0.01ng/ml，与在血清中检测的灵敏度基本相同。线性范围为4个数量级。
实施例2-2、一种闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白T的方法：
山羊抗鼠IgG二抗与发光底物9，10-二氢吖啶偶联，山羊抗兔IgG二抗与辣根过氧化物酶偶联，用于闪光型均相化学发光法检测心肌肌钙蛋白T。依次进行以下步骤：
1)、山羊抗鼠IgG二抗偶联9，10-二氢吖啶：
将1mg发光底物9，10-二氢吖啶溶解于2ml DMF中，得9，10-二氢吖啶溶液；
取9，10-二氢吖啶溶液100ul加入100ul浓度为10mg/ml的山羊抗鼠IgG二抗中，然后加入0.05M硼酸缓冲液(PH8.8)800ul，室温旋转反应1小时。
将所得的反应溶液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于PBS缓冲液(PH＝7.4)中4℃透析1天(24h)，期间更换3次PBS缓冲液(PH＝7.4)；透析结束后，保留于透析袋内的截留液即为连接9，10-二氢吖啶的山羊抗鼠IgG二抗(GAM-A)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
2)、山羊抗兔IgG二抗与辣根过氧化物酶偶联：
称取0.5mg HRP溶解于100ul去离子水中再加入200ul新配的0.1M过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌30分钟。将上述反应液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜(12h)。
透析结束后，向保留于透析袋内的截留液加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液20ul后，立即加入100ul浓度为10mg/ml的山羊抗兔IgG二抗，然后加入0.01M碳酸盐缓冲液(PH9.5)600ul，室温避光轻轻搅拌2小时。再加100ul新配的4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后置于4℃反应2小时。
将所得的反应液加入SUPERDEX 200凝胶过滤柱纯化，具体为：将150ml SUPERDEX200填料装柱，用PBS缓冲液(PH＝7.4)冲洗平衡2个柱体积，流速为2ml/min。平衡结束后，将上述反应液上样，用PBS缓冲液(PH＝7.4)进行冲洗，流速2ml/min，收取OD值0.5以上的第一个吸收峰，得到纯化的山羊抗兔IgG二抗与辣根过氧化物酶偶联产物(GAR-HRP)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
3)、检测
配制激发液：25mM tris(pH 8.0)，8mM对羟基肉桂酸，1mM EDTA，0.2％吐温-20和8mM过氧化脲。
配制本底抑制剂：1mM 2-氨基苯酚水溶液。
cTnT样品：取cTnT标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至不同浓度值100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml，4℃保存，作为定标品。另取cTnT标准品用cTnT阴性血清稀释至100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml；作为待测样品。
cTnT检测抗体溶液：0.4ug/ml抗cTnT鼠单克隆抗体，0.02ug/ml抗cTnT兔单克隆抗体于PBS缓冲液(PH＝7.4)中。
即，cTnT检测抗体溶液的制备方法为：0.4ug抗cTnT鼠单克隆抗体、0.02ug抗cTnT兔单克隆抗体中加入PBS缓冲液(PH＝7.4)定容至1ml。
先将每个浓度的定标品作为样本进行如下的加样检测：
加样检测：
采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将上述制备的GAM-A和GAR-HRP分别稀释800倍(体积倍)和10000倍(体积倍)，从而分别获得GAM-A稀释液和GAR-HRP稀释液；
反应体系为：cTnT检测抗体溶液、GAM-A稀释液、GAR-HRP稀释液、定标品各50ul，2ul本底抑制剂；
将上述反应体系于透明反应管中37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测(立即检测1秒钟内产生的发光信号)。
检测于PLM01均相发光检测仪器上进行，设定该仪器的参数为100毫秒读值一次，读取100次，从而获得发光信号值。
根据每个浓度的定标品所得的发光信号值和其所对应的cTnT浓度值，建立相应的检测cTnT的曲线Ⅰ和计算公式，计算公式为y＝3.66056+0.64391x(r^2＝0.96360)。
再将每个浓度的待测样品替代定标品作为样本，按照如上的加样检测法进行检测，所得结果为：根据每个浓度的待测样品所得的发光信号值和其所对应的cTnT浓度值，建立相应的检测cTnT的曲线Ⅱ。
如图6所述，曲线Ⅰ与曲线Ⅱ非常接近。
如图6，应用闪光型均相化学发光法检测cTnT，PBS梯度稀释的cTnT最低检测限为0.01ng/ml，与在血清中检测的灵敏度基本相同。线性范围为4个数量级。
实验二、以下述5种血清作为待测样本，分别按照上述实施例2-1、实施例2-2所述方法进行检测，所得结果如下表3所述。
血清样品A：事先经化学发光免疫分析法检测为cTnT阴性血清；
血清样品B：在事先经化学发光免疫分析法检测为cTnT阴性血清中加入心肌肌钙蛋白T至浓度为0.1ng/ml；
血清样品C：在事先经化学发光免疫分析法检测为cTnT阴性血清中加入心肌肌钙蛋白T至浓度为10ng/ml；
血清样品D：在事先经化学发光免疫分析法检测为cTnT阴性血清中加入心肌肌钙蛋白T浓度为0.65ng/ml的血清；
血清样品E：在事先经化学发光免疫分析法检测为cTnT阴性血清中加入心肌肌钙蛋白T浓度为45.66ng/ml的血清；
表3
对比例4-1、将实施例2-1中的本底抑制剂改成1mM抗坏血酸水溶液；其余等同于实施例2-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例4-2、将实施例2-1中的本底抑制剂改成50mM抗坏血酸水溶液；其余等同于实施例2-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例4-3、将实施例2-1中的本底抑制剂改成10mM二乙基羟胺水溶液；其余等同于实施例2-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例5-1、将实施例2-1中的发光底物由9，10-二氢吖啶改成吖啶酯；用量不变；其余等同于实施例2-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例5-2、将实施例2-1中的发光底物由9，10-二氢吖啶改成AMPPD(1，2-二氧环已烷衍生物)；用量不变；其余等同于实施例2-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例6-1、将实施例2-1中的HRP(辣根过氧化物酶)改成碱性磷酸酶；用量不变；其余等同于实施例2-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比例6-2、将实施例2-1中的HRP(辣根过氧化物酶)改成β-半乳糖苷酶；用量不变；其余等同于实施例2-1(获得相应的计算公式后进行检测判定)。
对比实验2、按照上述对比例所示方法对实验二所述的5种血清样品进行检测，最终所得的浓度结果如下表4所述。
表4、浓度结果(ng/ml)
血清样品A 血清样品B 血清样品C 血清样品D 血清样品E
实施例2-1 0 0.09 10.66 0.68 43.30
对比例4-1 0 0 1.23 0 4.88
对比例4-2 0 0 0 0 3.12
对比例4-3 0 0 7.4 0 31.9
对比例5-1 0 0 0 0 0
对比例5-2 0 0 0 0 0
对比例6-1 0 0 0 0 0
对比例6-2 0 0 0 0 0
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法，其特征是以血清作为待测样品；包括以下步骤：
1)、抗体Ⅰ偶联发光底物，得抗体Ⅰ-A；
2)、抗体Ⅱ偶联辣根过氧化物酶，抗体Ⅱ-HRP；
3)、检测：
分成以下两种方式：
方式一、当抗体Ⅰ、抗体Ⅱ为靶标cTnI/cTnT的特异性抗体时，在样本中加入本底抑制剂、抗体Ⅰ-A和抗体Ⅱ-HRP，从而组成检测体系；
方式二、当抗体Ⅰ、抗体Ⅱ为靶标cTnI/cTnT的特异性抗体的抗体时，在样本中加入本底抑制剂、抗体Ⅰ-A、抗体Ⅱ-HRP以及靶标cTnI/cTnT的特异性抗体，从而组成检测体系；
将上述检测体系(37±0.5)℃孵育(15±1)分钟；然后加入激发液，立即检测发光信号；
4)、判定：
先将cTnI/cTnT样品进行梯度稀释后作为样本按照上述步骤3)进行检测，从而获得发光信号和心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T浓度所对应的公式；
然后将待测样品作为样本按照上述步骤3)进行检测，从而获得待测样品发光信号，再将待测样品发光信号代入上式公式内，从而最终获得待测样品中心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的浓度。
2.根据权利要求1所述的闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法，其特征是：
当检测心肌肌钙蛋白I时：
抗体Ⅰ为cTnI单克隆抗体Ⅰ或山羊抗鼠IgG二抗，所述抗体Ⅰ-A为cTnI-A或GAM-A；
抗体Ⅱ为cTnI单克隆抗体Ⅱ或山羊抗兔IgG二抗，所述抗体Ⅱ-HRP为cTnI-HRP或GAR-HRP；
当检测心肌肌钙蛋白T时：
抗体Ⅰ为cTnT单克隆抗体Ⅰ或山羊抗鼠IgG二抗，抗体Ⅰ-A为cTnT-A或GAM-A；
抗体Ⅱ为cTnT单克隆抗体Ⅱ或山羊抗兔IgG二抗，抗体Ⅱ-HRP为cTnT-HRP或GAR-HRP。
3.根据权利要求2所述的闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法，其特征是：
一、检测心肌肌钙蛋白I：
所述步骤1)中：抗体Ⅰ为cTnI单克隆抗体Ⅰ，发光底物为9，10-二氢吖啶，所得的得抗体Ⅰ-A为cTnI-A；
所述步骤2)中：抗体Ⅱ为cTnI单克隆抗体Ⅱ，所得的抗体Ⅱ-HRP为cTnI-HRP；
所述步骤3)中，采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将制备的cTnI-A和cTnI-HRP分别稀释，检测时，cTnI-A稀释液、cTnI-HRP稀释液、待测样品分别加50ul，再加入10ul本底抑制剂；37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测；
所述步骤4)中，所对应的公式为y＝3.60391+0.59661x；
二、检测心肌肌钙蛋白T：
所述步骤1)中：抗体Ⅰ为cTnT单克隆抗体Ⅰ，发光底物为9，10-二氢吖啶，所得的得抗体Ⅰ-A为cTnT-A；
所述步骤2)中：抗体Ⅱ为cTnT单克隆抗体Ⅱ，所得的抗体Ⅱ-HRP为cTnT-HRP；
所述步骤3)中，采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将制备的cTnT-A和cTnT-HRP分别稀释，检测时，cTnT-A稀释液、cTnT-HRP稀释液、待测样品分别加50ul，再加入10ul本底抑制剂；37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测；
所述步骤4)中，所对应的公式为y＝3.47698+0.67069x。
4.根据权利要求2所述的闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法，其特征是：
一、检测心肌肌钙蛋白I：
所述步骤1)中：抗体Ⅰ为山羊抗鼠IgG二抗，发光底物为9，10-二氢吖啶，所得的得抗体Ⅰ-A为GAM-A；
所述步骤2)中：抗体Ⅱ为山羊抗兔IgG二抗，所得的抗体Ⅱ-HRP为GAR-HRP；
所述步骤3)中，采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将制备的GAM-A和GAR-HRP分别稀释，检测时，cTnI检测抗体、GAM-A稀释液、GAR-HRP稀释液、待测样品分别加50ul，再加入2ul本底抑制剂；37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测；
所述步骤4)中，所对应的公式为y＝3.86949+0.58246x；
二、检测心肌肌钙蛋白T：
所述步骤1)中：抗体Ⅰ为山羊抗鼠IgG二抗，发光底物为9，10-二氢吖啶，所得的得抗体Ⅰ-A为GAM-A；
所述步骤2)中：抗体Ⅱ为山羊抗兔IgG二抗，所得的抗体Ⅱ-HRP为GAR-HRP；
所述步骤3)中，采用双抗夹心法，用PBS缓冲液(PH＝7.4)将制备的GAM-A和GAR-HRP分别稀释，检测时，cTnT检测抗体、GAM-A稀释液、GAR-HRP稀释液、待测样品分别加50ul，再加入2ul本底抑制剂；37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测；
所述步骤4)中，所对应的公式为y＝3.66056+0.64391x。
5.根据权利要求1～4任一所述的闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T的方法，其特征是：
本底抑制剂为浓度为10mM抗坏血酸水溶液、1mM2-氨基苯酚水溶液。
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