CN112067823A - 一种鸡心肌肌钙蛋白i双抗体夹心elisa检测方法的建立 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法，主要步骤如下：1)抗体与蛋白标准品准备；2)抗体包被；3)洗板；4)封闭；5)加样；6)加检测抗体；7)加酶标抗体；8)加底物液；9)加终止液；10)测定：用酶标仪测定波长450nm处的OD值。本发明建立鸡心肌肌钙蛋白I的ELISA检测方法具有灵敏度高、特异性强、定量准确、简单易用等特点，用于肉鸡腹水综合征的早期非损伤性诊断，可作为一种非损伤性方法应用于针对肉鸡腹水综合征的育种方案中，该方法与蛋白质印迹法技术相比操作更为简便，具有更好的基层推广性。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立。
背景技术
肉鸡肺动脉高压综合征(pulmonaryhypertensionsyndrome，PHS)又称肉鸡腹水综合征(AscitesSyndrome，AS)，是一种发生于快速生长的肉鸡的一种，以腹水为主要特征的营养代谢性综合征，其临诊症状还包括：病鸡腹部膨大，皮肤菲薄，可视黏膜发绀；肝脏硬化出现结界；肺脏出血和淤血；右心肥大扩张等。PHS不但造成肉鸡发育不良、屠宰体重不达标，而且引起肉鸡死亡率、淘汰率大幅度上升。肉鸡腹水综合征的死亡率为2％-15％，最高可达10％，每年造成的经济损失达10亿美元。自1896年起，我国报道过该病发生的的已有十多个省份，由于该病的发病率和死亡率高，每年造成我国养鸡业巨大经济损失。研究结果显示,不同品系的鸡群或相同品系内不同的鸡只之间对PHS的易感性不同,表明PHS的发生具有遗传特性。世界上研究肉鸡PHS的大部分学者都认为防治该病的关键应该是从遗传方面着手,对肉鸡进行抗病育种。因此，通过建立早期肉鸡腹水综合征的ELISA检测方法，实现能在鸡的早期养殖过程中检测出心肌的损伤，从而应用到针对肉鸡腹水综合征的育种方案中。
肌钙蛋白是目前为止发现的辅助诊断心肌损伤的最佳确定标志物，2002年中华医学会检验学会在其公布的“心肌损伤标志物的应用准则”中建议:将心肌肌钙蛋白(cTnT或cTnI)取代CK-MB成为检出心肌损伤的金标准。当心肌细胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破坏时，游离的cTnI可迅速透过细胞膜进入血流，随着损伤加重，结合部分的cTnI被分解出来，成为游离的cTnI不断释放入血，导致cTnI持续升高。
目前使用的肉鸡肺动脉高压综合征的检测方法，有如下方法，(1)测定动脉血压，需要专业技术人员以及仪器，操作费时费力；(2)剖检鸡，测量右心与全心比，判断其PHS发病情况，该方法不适用于大规模检测；(3)测定血细胞压积作为PHS发病情况的参考指标，但该指标非金标准。因此，需要提供一种简便、快速、灵敏度高和特异性好的有效检测手段，对大量样本进行PHS发病情况进行检测。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立。
本发明的方案是：
一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，包括下列步骤：
1)抗体与蛋白标准品准备：兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和心肌肌钙蛋白I标准品由本实验室制备，使用专用的抗体稀释液将两种抗体稀释至固定浓度并分装，并使用1×PBS将心肌肌钙蛋白I标准品稀释至固定浓度并分装，兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体浓度为3mg/mL、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体浓度为2mg/mL、心肌肌钙蛋白I标准品浓度为10ng/mL。
2)抗体包被：将兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释混匀后加入到ELISA酶标板中，每孔100μL，4℃孵育16h；
3)洗板：弃包被液，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
4)封闭：加入封闭液，每孔200μL，37℃温育1h；弃封闭液，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
5)加样：向孔中加入鸡血清样本，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
6)加检测抗体：将鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释后，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
7)加酶标抗体：将山羊抗鼠IgG酶标抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释后，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
8)加底物液：每孔加入TMB底物显色液100μL，避光显色30min；
9)加终止液：每孔中加入ELISA终止液50μL；
10)测定，用酶标仪测定波长450nm处的OD值。
作为优选的技术方案，所述步骤2)抗体包被中兔源抗鸡cTnI多克隆抗体包被浓度与检测抗体鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体工作浓度的确定采用棋盘滴定法，其中横排加入包被浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4μg/mL，竖排加入检测抗体鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体工作浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4μg/mL，确定兔源抗鸡cTnI多克隆抗体的最佳包被浓度为1.6μg/mL，确定鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体的最佳工作浓度为3.2μg/mL：通过使用3种包被液Tris-Hcl(0.02mol/L)、PBS(0.01mol/L)和CBS(0.05mol/L)进行检测，确定PBS(0.01mol/L)为最佳包被液；通过3种包被抗体条件37℃包被2h条件、4℃包被16h条件与37℃2h加4℃16h条件进行检测，确定包被抗体条件为4℃包被16h条件。
作为优选的技术方案，通过已经确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液与抗体包被条件进行步骤4)封闭条件的确定，分别通过1％BSA、3％BSA、5％BSA、1％脱脂奶粉、3％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉以及37℃1h、37℃2h、4℃过夜、37℃1h+4℃过夜作为封闭条件进行检测，确定最佳封闭条件为1％脱脂奶粉，37℃2h。
作为优选的技术方案，通过已经确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件与封闭条件进行步骤5)血清孵育时间的确定，分别通过0.5h、1h、1.5h、2h的血清孵育时间进行检测，确定最佳血清孵育时间为1h。
作为优选的技术方案，通过已确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件、封闭条件与血清孵育时间进行步骤6)中检测抗体孵育时间的确定，分别通过0.5h、1h、1.5h、2h的检测抗体孵育时间进行检测，确定最佳检测抗体孵育时间为1h。
作为优选的技术方案，通过已确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件、封闭条件、血清孵育时间与检测抗体孵育时间进行步骤7)中酶标抗体的稀释倍数与作用时间的确定，分别通过稀释倍数为1：100、1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1：6000、1：8000、1：10000的HRP-羊抗鼠抗体以及15min、30min、45min、60min的酶标抗体孵育时间进行检测，确定最佳酶标抗体的稀释倍数为1：4000与最佳作用时间为60min。
作为优选的技术方案，通过已确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件、封闭条件、血清孵育时间、检测抗体孵育时间、酶标抗体的稀释倍数与酶标抗体孵育时间进行步骤8)的加底物液后底物显色作用时间的确定，分别通过15min、30min、45min、60min的底物显色时间进行检测，确定最佳底物显色作用时间为45min。
作为优选的技术方案，所述步骤10)测定结束后，在酶标仪测量OD450nm值。测定结束后进行ELISA检测方法的验证，结果判定的标准；ELISA特异性试验；ELISA灵敏度试验；ELISA重复性试验；所述ELISA方法的验证包括标准曲线的建立；临床样本检测；统计学分析。
本发明的优点：
本发明建立鸡心肌肌钙蛋白I的ELISA检测方法，用于肉鸡腹水综合征的早期非损伤性诊断，可作为一种非损伤性方法应用于针对肉鸡腹水综合征的育种方案中，该方法与蛋白质印迹法技术相比操作更为简便，具有更好的基层推广性。
说明书附图
图1为ELISA灵敏度试验检测结果；
图2为该双抗体夹心ELISA检测方法的标准曲线图；
图3为蛋白质印迹法方法检出的5份阳性样本。
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立以解决上述背景技术中的问题。一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，包括下列步骤：
2)抗体与蛋白标准品准备：兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和心肌肌钙蛋白I标准品由本实验室制备，使用专用的抗体稀释液将两种抗体稀释至固定浓度并分装，并使用1×PBS将心肌肌钙蛋白I标准品稀释至固定浓度并分装，兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体浓度为3mg/mL、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体浓度为2mg/mL、心肌肌钙蛋白I标准品浓度为10ng/mL。
2)抗体包被：将兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释混匀后加入到ELISA酶标板中，每孔100μL，4℃孵育16h；
3)洗板：弃包被液，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
4)封闭：加入封闭液，每孔200μL，37℃温育1h；弃封闭液，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
5)加样：向孔中加入鸡血清样本，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
6)加检测抗体：将鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释后，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
7)加酶标抗体：将山羊抗鼠IgG酶标抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释后，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
8)加底物液：每孔加入TMB底物显色液100μL，避光显色30min；
9)加终止液：每孔中加入ELISA终止液50μL；
10)测定，用酶标仪测定波长450nm处的OD值。
通过棋盘滴定法对兔源抗鸡cTnI多克隆抗体包被浓度与检测抗体鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体工作浓度进行确定，其中横排加入包被浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4μg/mL，竖排加入检测抗体鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体工作浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4μg/mL，确定兔源抗鸡cTnI多克隆抗体的最佳包被浓度为1.6μg/mL，确定鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体的最佳工作浓度为3.2μg/mL。
通过使用3种包被液Tris-Hcl(0.02mol/L)、PBS(0.01mol/L)和CBS(0.05mol/L)进行检测，确定PBS(0.01mol/L)为最佳包被液；通过3种包被抗体条件37℃包被2h条件、4℃包被16h条件与37℃2h加4℃16h条件进行检测，确定包被抗体条件为4℃包被16h条件。
通过已经确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液与抗体包被条件进行步骤4)封闭条件的确定，分别通过1％BSA、3％BSA、5％BSA、1％脱脂奶粉、3％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉以及37℃1h、37℃2h、4℃过夜、37℃1h+4℃过夜作为封闭条件进行检测，确定最佳封闭条件为1％脱脂奶粉，37℃2h。
通过已经确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件与封闭条件进行步骤5)血清孵育时间的确定，分别通过0.5h、1h、1.5h、2h的血清孵育时间进行检测，确定最佳血清孵育时间为1h。
通过已确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件、封闭条件与血清孵育时间进行步骤6)中检测抗体孵育时间的确定，分别通过0.5h、1h、1.5h、2h的检测抗体孵育时间进行检测，确定最佳检测抗体孵育时间为1h。
通过已确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件、封闭条件、血清孵育时间与检测抗体孵育时间进行步骤7)中酶标抗体的稀释倍数与作用时间的确定，分别通过稀释倍数为1：100、1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1：6000、1：8000、1：10000的HRP-羊抗鼠抗体以及15min、30min、45min、60min的酶标抗体孵育时间进行检测，确定最佳酶标抗体的稀释倍数为1：4000与最佳作用时间为60min。
通过已确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件、封闭条件、血清孵育时间、检测抗体孵育时间、酶标抗体的稀释倍数与酶标抗体孵育时间进行步骤8)的加底物液后底物显色作用时间的确定，分别通过15min、30min、45min、60min的底物显色时间进行检测，确定最佳底物显色作用时间为45min。
通过所述步骤10)在酶标仪测量OD450nm值。测定结束后进行ELISA检测方法的验证，结果判定的标准；ELISA特异性试验；ELISA灵敏度试验；ELISA重复性试验；所述ELISA方法的验证包括标准曲线的建立；临床样本检测；统计学分析。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例
鸡心肌肌钙蛋白I(cTnI)双抗体夹心ELISA检测方法的建立主要试剂
TMB显色液、ELISA终止液、酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体、Tris-Hcl(0.02mol/L)、抗体专用稀释液从试剂公司购买。
溶液配制
(1)稀释液：1×磷酸盐稀释液(1×PBS)，取8.0gNaCl，0.2gKCl，1.42gNa2HPO4，0.27gK2HPO4加去离子水定容至1L，pH调至7.4，4℃保存；0.05mol/L碳酸盐缓冲液(0.05mol/LCBSpH9.6)，1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3，加去离子水定容至1L，pH调至9.6，4℃保存。
(4)洗涤液(PBST):取1×PBS溶液500mL，加入Tween-20250μL(最终浓度为0.05％)混匀。
(5)封闭液：1％脱脂奶粉：每100mLPBS加入1g脱脂奶粉，4℃保存；3％脱脂奶粉：每100mLPBS加入3g脱脂奶粉，4℃保存；5％脱脂奶粉：每100mLPBS加入5g脱脂奶粉，4℃保存；1％BSA：每100mLPBS加入1g脱脂奶粉，4℃保存；3％BSA：每100mLPBS加入3g脱脂奶粉，4℃保存；5％BSA：每100mLPBS加入5g脱脂奶粉，4℃保存。
器材:
96孔聚苯乙烯塑料板(康为酶标板)；37℃恒温培养箱；酶标仪；移液枪。
鸡心肌肌钙蛋白I(cTnI)双抗体夹心ELISA基本操作步骤：
1)抗体与蛋白标准品准备：兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和心肌肌钙蛋白I标准品由本实验室制备，使用专用的抗体稀释液将两种抗体稀释至固定浓度并分装，并使用1×PBS将心肌肌钙蛋白I标准品稀释至固定浓度并分装，兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体浓度为3mg/mL、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体浓度为2mg/mL、心肌肌钙蛋白I标准品浓度为10ng/mL。
2)抗体包被：将兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释混匀后加入到ELISA酶标板中，每孔100μL，4℃孵育16h；
3)洗板：弃包被液，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
4)封闭：加入封闭液，每孔200μL，37℃温育1h；弃封闭液，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
5)加样：向孔中加入鸡血清样本，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
6)加检测抗体：将鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释后，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
7)加酶标抗体：将山羊抗鼠IgG酶标抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释后，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
8)加底物液：每孔加入TMB底物显色液100μL，避光显色30min；
9)加终止液：每孔中加入ELISA终止液50μL；
10)测定，用酶标仪测定波长450nm处的OD值。
实验条件的优化
包被抗体最佳包被浓度和检测抗体最佳工作浓度的确定
兔源抗鸡cTnI多克隆抗体包被浓度的选择采用棋盘滴定法，具体操作为：横排兔源抗鸡cTnI多克隆抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释至包被浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4μg/mL，按100μL/孔包被酶标板，4℃孵育16h；PBST洗板3次，每次5min，每孔加入200μL1％BSA，37℃封闭1h；PBST洗板3次，每次5min，竖排加入阳性标准液(2000pg/mL标准肌钙蛋白)以及阴性标准液(1×PBS)，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，竖排再加入鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐稀释液稀释至工作浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4μg/mL，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入1:5000稀释的HRP-羊抗鼠，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光作用30min，再加入ELISA终止液，每孔50μL，终止反应。读取OD450值，在P/N值最大，即确定为最佳抗体包被浓度和最佳检测抗体工作浓度。结果如下表1所示，当包被抗体兔源抗鸡cTnI多克隆抗体的包被浓度为1.6μg/mL，检测抗体鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体的工作浓度为3.2μg/mL时，P/N值最大，且阴性样本(N)OD值低，故该浓度确定为最佳抗体包被浓度和最佳检测抗体工作浓度。
表1包被抗体最佳包被浓度和检测抗体最佳工作浓度的确定结果
最佳包被稀释液的确定
用3种包被稀释液作将包被抗体进行稀释，这3种包被稀释液分别为Tris-Hcl(0.02mol/L)、PBS(0.01mol/L)和CBS(0.05mol/L)，使用这3种包被稀释液均将兔源抗鸡cTnI多克隆抗体稀释至最佳抗体包被浓度1.6μg/mL，按100μL/孔包被酶标板，4℃孵育16h；PBST洗板3次，每次5min，每孔加入200μL1％BSA，37℃封闭1h；PBST洗板3次，每次5min，加入阳性标准液(2000pg/mL标准肌钙蛋白)以及阴性标准液(1×PBS)，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入最佳检测抗体工作浓度3.2μg/mL的鼠源抗鸡cTn单克隆抗体，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入1:5000稀释的HRP-羊抗鼠，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光作用30min，再加入ELISA终止液，每孔50μL，终止反应。读取OD450值，在P/N值最大，即确定为最佳抗体包被液。结果如下表2所示，PBS为最佳包被稀释液类型。
表2最佳包被稀释液的确定结果
包被抗体最佳包被条件的确定
将兔源抗鸡cTnI多克隆抗体用0.01mol/LPBS稀释至包被浓度为1.6μg/mL，按100μL/孔包被酶标板，分别按37℃包被2h条件、4℃包被16h条件与37℃2h加4℃16h条件，对其进行包被；PBST洗板3次，每次5min，每孔加入200μL1％BSA，37℃封闭1h；PBST洗板3次，每次5min，加入阳性标准液(2000pg/mL标准肌钙蛋白)以及阴性标准液(1×PBS)，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入用稀释液稀释至3.2μg/mL的鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入1:5000稀释的HRP-羊抗鼠，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光作用30min，再加入ELISA终止液，每孔50μL，终止反应。读取OD450值，在P/N值最大，即确定为最佳抗体包被条件。结果如下表3所示，4℃包被16h是最佳包被条件。
表3包被抗体最佳包被条件的确定结果
最佳封闭条件的确定
将兔源抗鸡cTnI多克隆抗体用用0.01mol/LPBS稀释至包被浓度1.6μg/mL，按100μL/孔包被酶标板，按最佳抗体包被条件4℃包被16h对其进行包被；PBST洗板3次，每次5min，封闭条件按照下表4条件进行；PBST洗板3次，每次5min，加入阳性标准液(2000pg/mL标准肌钙蛋白)以及阴性标准液(1×PBS)，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入3.2μg/mL的鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入1:5000稀释的HRP-羊抗鼠，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光作用30min，再加入ELISA终止液，每孔50μL，终止反应。读取OD450值，在P/N值最大，即确定为最佳封闭条件。结果如表4所示，最佳封闭条件为1％脱脂奶粉，37℃2h。
表4最佳封闭条件的确定结果
血清孵育时间的确定
将兔源抗鸡cTnI多克隆抗体用用0.01mol/LPBS稀释至包被浓度1.6μg/mL，按100μL/孔包被酶标板，按最佳抗体包被条件4℃包被16h对其进行包被；PBST洗板3次，每次5min，封闭37℃2h；PBST洗板3次，每次5min，加入阳性标准液(2000pg/mL标准肌钙蛋白)以及阴性标准液(1×PBS)，每孔100μL，按照0.5h、1h、1.5h、2h的血清孵育时间进行；PBST洗板3次，每次5min，加入3.2μg/mL的鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入1:5000稀释的HRP-羊抗鼠，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光作用30min，再加入ELISA终止液，每孔50μL，终止反应。读取OD450值，在P/N值最大，即确定为最佳血清孵育时间。如表5所示，最佳血清孵育时间为1h。
表5血清孵育时间的确定结果
检测抗体最佳孵育时间的确定
将兔源抗鸡cTnI多克隆抗体用用0.01mol/LPBS稀释至包被浓度1.6μg/mL，按100μL/孔包被酶标板，按4℃包被16h对其进行包被；PBST洗板3次，每次5min，封闭37℃2h；PBST洗板3次，每次5min，加入阳性标准液(2000pg/mL标准肌钙蛋白)以及阴性标准液(1×PBS)，每孔100μL，按照1h的血清孵育时间进行；PBST洗板3次，每次5min，，加入3.2μg/mL的鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体，每孔100μL，按照0.5h、1h、1.5h、2h进行孵育；PBST洗板3次，每次5min，加入1:5000稀释的HRP-羊抗鼠，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光作用30min，再加入ELISA终止液，每孔50μL，终止反应。读取OD450值，在P/N值最大，即确定为最佳检测抗体孵育时间。如表6所示，最佳检测抗孵育时间为1h。
表6检测抗体最佳孵育时间的确定结果
酶标抗体最佳稀释倍数的确定
将兔源抗鸡cTnI多克隆抗体用用0.01mol/LPBS稀释至包被浓度1.6μg/mL，按100μL/孔包被酶标板，按4℃包被16h对其进行包被；PBST洗板3次，每次5min，封闭37℃2h；PBST洗板3次，每次5min，加入阳性标准液(2000pg/mL标准肌钙蛋白)以及阴性标准液(1×PBS)，每孔100μL，按照1h的血清孵育时间进行；PBST洗板3次，每次5min，，加入3.2μg/mL的鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体，每孔100μL，1h进行孵育；PBST洗板3次，每次5min，分别加入稀释倍数为1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶6000、1:8000、1:10000的HRP-羊抗鼠抗体，每孔100μL，37℃作用1h；PBST洗板3次，每次5min，加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光作用30min，再加入ELISA终止液，每孔50μL，终止反应。读取OD450值，在P/N值最大，即确定为酶标抗体最适稀释倍数。如表7所示，酶标抗体最适稀释倍数为1:4000。
表7酶标抗体最佳稀释倍数的确定结果
酶标抗体最适孵育时间的确定
将兔源抗鸡cTnI多克隆抗体用用0.01mol/LPBS稀释至包被浓度1.6μg/mL，按100μL/孔包被酶标板，按4℃包被16h对其进行包被；PBST洗板3次，每次5min，封闭37℃2h；PBST洗板3次，每次5min，加入阳性标准液(2000pg/mL标准肌钙蛋白)以及阴性标准液(1×PBS)，每孔100μL，按照1h的血清孵育时间进行；PBST洗板3次，每次5min，，加入3.2μg/mL的鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体，每孔100μL，1h进行孵育；PBST洗板3次，每次5min，加入稀释倍数为1∶4000的HRP-羊抗鼠抗体，每孔100μL，孵育时间按照15min，30min，45min，60min进行；PBST洗板3次，每次5min，加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光作用30min，再加入ELISA终止液，每孔50μL，终止反应。读取OD450值，在P/N值最大，即确定为酶标抗体最适孵育时间。如表8所示，酶标抗体最适孵育时间为60min。
表8酶标抗体最适孵育时间的确定结果
底物显色作用时间的确定
将将兔源抗鸡cTnI多克隆抗体用用0.01mol/LPBS稀释至包被浓度1.6μg/mL，按100μL/孔包被酶标板，按4℃包被16h对其进行包被；PBST洗板3次，每次5min，封闭37℃2h；PBST洗板3次，每次5min，加入阳性标准液(2000pg/mL标准肌钙蛋白)以及阴性标准液(1×PBS)，每孔100μL，按照1h的血清孵育时间进行；PBST洗板3次，每次5min，，加入3.2μg/mL的鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体，每孔100μL，1h进行孵育；PBST洗板3次，每次5min，加入稀释倍数为1∶4000的HRP-羊抗鼠抗体，每孔100μL，孵育时间按照60min进行；PBST洗板3次，每次5min，加入TMB显色液，每孔100μL，按照下表9中条件分别进行37℃避光作用，再加入ELISA终止液，每孔50μL，终止反应。读取OD450值，在P/N值最大，即确定为底物显色作用时间的确定。如表9所示，底物显色作用时间为45min.
表9底物显色作用时间的确定结果
样本采集
临床症状是肉鸡腹围明显增大，腹部下垂，腹部皮肤变薄发亮或变紫。运动呈鸭步样，精神抑郁，羽毛蓬松凌乱，胸腹部多无毛，皮肤发绀，两羽下垂。冠和肉髯发紫。采食量下降或废绝，体重损失，发育受阻，甚至生长停滞。解剖检查病鸡可见皮下肌肉瘀血，腹腔中积有大量的黄色液体，呈稻草色或淡红色，其中可能有絮状、白色纤维蛋白凝块。心脏高度扩张，体积扩大，以右心室最为明显心包腔沉积大量清亮液体。本检测方法建立以28d-42d发病的肉鸡(符合上述临床症状，剖检右心重量比全心重量大于0.28)血清样本作为阳性血清样本，以28d-42d正常肉鸡(无上述临床症状，剖检右心重量比全心重量小于0.25)作为阴性血清样本。
ELISA结果判定的标准
取上述的阴性血清样本20份，每个样本作3个平行孔，用建立的ELISA方法进行检测，计算OD450nm平均值和标准差(SD)。以样本的OD450nm值平均值+3SD为阳性临界值。测定20份阴性血清样本OD450nm的平均值为0.0605，标准方差为0.023，阴性与阳性血清样本的临界值为0.131。因此，当检测的血清样本OD450nm＞0.131，且P/N≥2时，判定为阳性，否则判为阴性。
ELISA特异性试验
用建立的ELISA方法进行检测检测心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白C、肌酸磷酸激酶(CK)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)，判断其结果是否为阴性，从而确定该方法的特异性。结果显示心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白C、肌酸磷酸激酶(CK)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)检测均为阴性，心肌肌钙蛋白I为阳性，表明该双抗体夹心ELISA法特异性较好。
ELISA灵敏度试验
使用1×PBS稀释阳性血清，稀释倍数分别为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024。同时，使用1×PBS稀释心肌肌钙蛋白I标准品，浓度分别为5000pg/mL、2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.625pg/mL、7.8125pg/mL。用所建立的ELISA方法进行检测，确定其最低可测的心肌肌钙蛋白I浓度，从而确定该方法的灵敏度。如图1所示，结果表明，随着cTnI含量的降低，其OD450nm值呈下降趋势，当cTnI浓度低于62.5pg/mL时，OD450nm趋于平稳，表明该双抗体夹心ELISA法的cTnI检测最低测限为62.5pg/mL。
ELISA重复性试验
选择上述阳性血清样本各5份进行板内和板间重复性试验。确定检测符合率，并计算变异系数(CV＝(SD÷MN)×100％)。板内重复性试验结果见表10，计算其变异系数在0.3％-2.5％。板间重复性试验结果见表11，计算其变异系数在1.1％-6.8％。两个重复性试验的变异系数均小于10％，说明本试验建立的双抗体夹心ELISA法具有良好的重复性。
表10板内重复性试验结果
注：SD表示标准差；Mean表示算术平均值；CV表示变异系数，CV％＝SD/Mean。同下
表11板间重复性试验
标准曲线的建立
分别将纯化的鸡心肌肌钙蛋白I分别稀释至浓度为2000、1000、500、250、125、0pg/mL，用建立的ELISA方法进行检测。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，如图2所示。
临床样本检测
将20份血清样本通过蛋白质印迹法方法和本研究建立的双抗体夹心ELISA方法检测结果进行对比。蛋白质印迹法方法共检出5份阳性样本，如图3所示，目的条带大小正确。双抗体夹心ELASA方法共检出5份阳性样本，结果见表12，与蛋白质印迹法方法检测结果相符。
表12双抗体夹心ELASA方法检出的20份样本的OD450nm结果
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，其特征在于，包括下列步骤：
1)抗体与蛋白标准品准备：兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和心肌肌钙蛋白I标准品由本实验室制备，使用专用的抗体稀释液将两种抗体稀释至固定浓度并分装，并使用1×PBS将心肌肌钙蛋白I标准品稀释至固定浓度并分装，兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体浓度为3mg/mL、鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体浓度为2mg/mL、心肌肌钙蛋白I标准品浓度为10ng/mL。
2)抗体包被：将兔源抗鸡心肌肌钙蛋白I多克隆抗体用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐稀释液稀释混匀后加入到ELISA酶标板中，每孔100μL，4℃孵育16h；
3)洗板：弃包被液，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
4)封闭：加入封闭液，每孔200μL，37℃温育1h；弃封闭液，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
5)加样：向孔中加入鸡血清样本，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
6)加检测抗体：将鼠源抗鸡心肌肌钙蛋白I单克隆抗体用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐稀释液稀释后，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
7)加酶标抗体：将山羊抗鼠IgG酶标抗体用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐稀释液稀释后，每孔100μL，37℃恒温孵育1h，弃孔中液体，PBST洗涤液每孔200μL洗3次，每次5min，在滤纸上扣干板内水分；
8)加底物液：每孔加入TMB底物显色液100μL，避光显色30min；
9)加终止液：每孔中加入ELISA终止液50μL；
10)测定，用酶标仪测定波长450nm处的OD值。
2.如权利要求1所述的一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，其特征在于：所述步骤2)抗体包被中兔源抗鸡cTnI多克隆抗体包被浓度与检测抗体鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体工作浓度的确定采用棋盘滴定法，其中横排加入包被浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4μg/mL，竖排加入检测抗体鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体工作浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4μg/mL，确定兔源抗鸡cTnI多克隆抗体的最佳包被浓度为1.6μg/mL，确定鼠源抗鸡cTnI单克隆抗体的最佳工作浓度为3.2μg/mL：通过使用3种包被液Tris-Hcl(0.02mol/L)、PBS(0.01mol/L)和CBS(0.05mol/L)进行检测，确定PBS(0.01mol/L)为最佳包被液；通过3种包被抗体条件37℃包被2h条件、4℃包被16h条件与37℃2h加4℃16h条件进行检测，确定包被抗体条件为4℃包被16h条件。
3.如权利要求1所述的一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，其特征在于：通过已经确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液与抗体包被条件进行步骤4)封闭条件的确定，分别通过1％BSA、3％BSA、5％BSA、1％脱脂奶粉、3％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉以及37℃1h、37℃2h、4℃过夜、37℃1h+4℃过夜作为封闭条件进行检测，确定最佳封闭条件为1％脱脂奶粉，37℃2h。
4.如权利要求1所述的一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，其特征在于：通过已经确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件与封闭条件进行步骤5)血清孵育时间的确定，分别通过0.5h、1h、1.5h、2h的血清孵育时间进行检测，确定最佳血清孵育时间为1h。
5.如权利要求1所述的一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，其特征在于：通过已确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件、封闭条件与血清孵育时间进行步骤6)中检测抗体孵育时间的确定，分别通过0.5h、1h、1.5h、2h的检测抗体孵育时间进行检测，确定最佳检测抗体孵育时间为1h。
6.如权利要求1所述的一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，其特征在于：通过已确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件、封闭条件、血清孵育时间与检测抗体孵育时间进行步骤7)中酶标抗体的稀释倍数与作用时间的确定，分别通过稀释倍数为1：100、1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1：6000、1：8000、1：10000的HRP-羊抗鼠抗体以及15min、30min、45min、60min的酶标抗体孵育时间进行检测，确定最佳酶标抗体的稀释倍数为1：4000与最佳作用时间为60min。
7.如权利要求1所述的一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，其特征在于：通过已确定的抗体包被浓度、检测抗体工作浓度、抗体包被液、抗体包被条件、封闭条件、血清孵育时间、检测抗体孵育时间、酶标抗体的稀释倍数与酶标抗体孵育时间进行步骤8)的加底物液后底物显色作用时间的确定，分别通过15min、30min、45min、60min的底物显色时间进行检测，确定最佳底物显色作用时间为45min。
8.如权利要求1所述的一种鸡心肌肌钙蛋白I双抗体夹心ELISA检测方法的建立，其特征在于：所述步骤10)测定结束后，在酶标仪测量OD450nm值。
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