CN111855572A - 一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒及检测方法，包括：封板膜；密封袋；酶标包被板；标准品：2700ng/L；标准品稀释液；酶标试剂；样品稀释液；显色剂A液；显色剂B液；终止液；浓缩洗涤液。本发明设计糖尿病肾病检测技术领域。该检测方法方法操作简单，受代谢紊乱和血液动力学影响较小，在糖尿病肾病Ⅰ期即可检测，灵敏度极高，对于糖尿病的临床早期诊断与发现具有重大意义。

Description

一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及糖尿病肾病检测技术领域，具体为一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
糖尿病是一种由遗传因素、环境因素所导致的一种慢性代谢性疾病。主要原因是人体胰腺不能正常产生胰岛素或身体不能正常利用胰岛素，导致血糖高于正常的一种综合征。糖尿病肾病是糖尿病病人最重要的合并症之一，会导致不可逆性的肾脏实质性损伤：疾病的病变涉及肾脏内的小血管和肾小球，会造成白蛋白尿的出现。当患者的糖尿病肾病发生后，因血糖浓度升高等因素，肾小球滤过压增加逐渐漏出蛋白质，若这个时候病情不控制，则会出现持续大量的蛋白尿。到了这个阶段肾脏病变不可逆性肾脏出现实质性的损伤。此外据医学资料调查分析，糖尿病患者患有肾功能衰竭的可能性，比非糖尿病患者足足高17倍。
早期诊断和积极治疗将显著降低糖尿病以肾脏疾病为主的其他并发症发病率。但是糖尿病肾脏疾病早期无明显症状，当出现症状时已不可逆转。当前诊断方法主要为尿白蛋白/肌酐比(ACR)和估算肾小球滤过率(eGFR)。其中ACR为检测尿液中蛋白的方法，可以指示肾脏疾病的情况，eGFR是指单位时间内两肾生成滤液的量，是衡量肾功能的指标。这两个指标易受代谢紊乱和血液动力学的影响，如运动、过量摄入蛋白、血糖量上升等，此外这两个指标都无法对糖尿病做到早期诊断，而检测过晚则会导致器官不可逆的损伤。
而灵敏度高、特异性高的标记物是目前临床急需的。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒及检测方法，具备灵敏度高、特异性高、及早检测等优点，解决了现有糖尿病检测灵敏度低、特异性差、不能及早检测的问题。
(二)技术方案
为实现上述的目的，本发明提供如下技术方案：一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒，包括：
封板膜；
密封袋；
酶标包被板；
标准品：2700ng/L；
标准品稀释液；
酶标试剂；
样品稀释液；
显色剂A液；
显色剂B液；
终止液；
浓缩洗涤液。
优选的，所述酶标稀释液含有0.1M的Tris、0.05M的柠檬酸、2％-3％的BSA、1.5％-3％的聚乙二醇、0.8％-1.5％的甜菜碱以及0.05％的Proclin300,余量为水。
优选的，所述浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
优选的，所述封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
优选的，所述各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差，一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒的检测方法：
1.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40ul，然后再加待测样品10ul(样品最终稀释度为5倍，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
2.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100ul，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50ul，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100ul分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50ul,混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50ul弃掉，再各取50ul分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50ul分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀后从第七、第八孔中分别取50u加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50ul，混匀后从第九第十孔中各取50ul弃掉，(稀释后各孔加样量都为50ul,浓度分别为1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L)；
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
4.配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用；
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
6.温育：操作同3；
7.洗涤：操作同5；
8.显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
9.加酶：每孔加入酶标试剂50ul，空白孔除外；
10.终止：每孔加终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行；
12.计算：OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
优选的，所述每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔，如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值)，请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数(XnX5)。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒的检测方法，具备以下有益效果：
1、该方法操作简单，受代谢紊乱和血液动力学影响较小，在糖尿病肾病Ⅰ期即可检测，灵敏度极高，对于糖尿病的临床早期诊断与发现具有重大意义。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒，包括：
封板膜；
密封袋；
酶标包被板；
标准品：2700ng/L；
标准品稀释液；
酶标试剂；
样品稀释液；
显色剂A液；
显色剂B液；
终止液；
浓缩洗涤液。
优选的，所述酶标稀释液含有0.1M的Tris、0.05M的柠檬酸、2％-3％的BSA、1.5％-3％的聚乙二醇、0.8％-1.5％的甜菜碱以及0.05％的Proclin300,余量为水。
优选的，所述浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
优选的，所述封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
优选的，所述各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差，一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒的检测方法：
1.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40ul，然后再加待测样品10ul(样品最终稀释度为5倍，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
2.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100ul，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50ul，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100ul分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50ul,混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50ul弃掉，再各取50ul分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50ul分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀后从第七、第八孔中分别取50u加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50ul，混匀后从第九第十孔中各取50ul弃掉，(稀释后各孔加样量都为50ul,浓度分别为1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L)；
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
4.配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用；
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
6.温育：操作同3；
7.洗涤：操作同5；
8.显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
9.加酶：每孔加入酶标试剂50ul，空白孔除外；
10.终止：每孔加终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行；
12.计算：OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
优选的，所述每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔，如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值)，请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数(XnX5)。
本项目采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定人血清样品中与糖尿病肾病相关的5种蛋白质标记物的含量。试剂中与固定相结合的相应蛋白质标记物的单克隆抗体根据抗原抗体特异性结合的原理与样本中的血清中的5种蛋白质标记物进行结合，再与酶标二抗形成抗体－抗原－酶标二抗复合物，利用酶的高效催化作用对显色物质进行催化显色，将OD值与标准品进行对比，从而测出血清中5种蛋白质标记物的含量，达到诊断糖尿病肾病的目的。
关于样本处理及要求：
1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转1分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8C的温度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20"C保存，但应避免反复冻融。
7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
本发明的有益效果是：该方法操作简单，受代谢紊乱和血液动力学影响较小，在糖尿病肾病Ⅰ期即可检测，灵敏度极高，对于糖尿病的临床早期诊断与发现具有重大意义。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒，其特征在于：包括：
封板膜；
密封袋；
酶标包被板；
标准品：2700ng/L；
标准品稀释液；
酶标试剂；
样品稀释液；
显色剂A液；
显色剂B液；
终止液；
浓缩洗涤液。
2.一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒，其特征在于：所述酶标稀释液含有0.1M的Tris、0.05M的柠檬酸、2％-3％的BSA、1.5％-3％的聚乙二醇、0.8％-1.5％的甜菜碱以及0.05％的Proclin300,余量为水。
3.一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒，其特征在于：所述浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
4.一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒，其特征在于：所述封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5.一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒，其特征在于：各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差，一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
6.一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
7.一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：
1.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40ul，然后再加待测样品10ul(样品最终稀释度为5倍，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
2.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100ul，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50ul，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100ul分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50ul,混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50ul弃掉，再各取50ul分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50ul分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀后从第七、第八孔中分别取50u加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50ul，混匀后从第九第十孔中各取50ul弃掉，(稀释后各孔加样量都为50ul,浓度分别为1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L)；
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
4.配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用；
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
6.温育：操作同3；
7.洗涤：操作同5；
8.显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
9.加酶：每孔加入酶标试剂50ul，空白孔除外；
10.终止：每孔加终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行；
12.计算：OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
8.根据权利要求7所述的一种用于糖尿病肾脏疾病的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔，如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值)，请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数(XnX5)。
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