CN102854321B - N末端b型脑钠肽前体化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种N末端B型脑钠肽前体化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：NT-proBNP抗体包被板、NT-proBNP抗体酶结合物、NT-proBNP校准品、NT-proBNP质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液。另外本发明还公开了一种N末端B型脑钠肽前体化学发光免疫定量检测试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、试剂有效期长、稳定性好等优点。

Description

N末端B型脑钠肽前体化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的涉及N末端B型脑钠肽（NT-proBNP）化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

脑钠肽（Brain Natriuretic Peptide，BNP）又称B型利钠肽（B-typeNatriuretic Peptide），是继心钠肽（ANP）后利钠肽系统的又一成员，由于它首先是由日本学者Sudoh等于1988年从猪脑分离出来因而得名，实际上它主要来源于心室。心肌细胞首先合成108氨基酸的BNP原，又称BNP前体（proBNP），在蛋白酶的作用下proBNP分解为N末端B型脑钠肽前体（NT-proBNP）和生物活性激素BNP，两种多肽都释放进入血循环。两者来源相同并且等摩尔分泌。今年来一些研究表明，N末端(NT-proBNP)不仅半衰期长、稳定性好，且与BNP相性良好，心力衰竭时其变化幅度达BNP的6～20倍，较BNP更敏感，所以其早期诊断的价值更高，是诊断心力衰竭和评价心脏功能的最佳心肌标志物。

心力衰竭是老年人住院或死亡的最常见原因之一。随着人口老龄化及心肌梗死生存率的上升，心力衰竭作为心血管疾病中唯一一个发病率和流行性仍在持续上升的疾病，其防治已成为近年来临床心脏病学研究的热点。

当心功能不全时，由于心脏容量负荷或压力负荷增加，心肌受到牵张或室壁压力增大，会使血中BNP和NT-proBNP的指标浓度增高，而这恰恰是诊断心衰较为敏感的指标，可以独立预测左心室舒张末期压力升高状况。因此，NT-proBNP可以作为一个更好的预示心衰状况的指标。此外，NT-proBNP有助于急性呼吸困难的鉴别诊断，可对心力衰竭病人的危险分层，可监测心力衰竭的治疗，NT-proBNP水平还可用于心力衰竭病人的预后评价等。

总之，随研究深入，血浆NT-proBNP浓度的测定很有可能作为评估心功能的一项重要补充，成为一项简便易行的常规检查。

目前临床上甲状腺球蛋白抗体定量检测常用方法有：放射性免疫分析（RIA）和酶联免疫分析（ELISA），但是RIA存在放射性污染、操作繁琐、试剂有效期短等缺点，而ELISA虽然可以避免上述缺点，但是其灵敏度较低。

化学发光免疫分析（CLIA）起步于80年代初，快速发展应用于90年代，为当今最为敏感的微量免疫测定法。其主要特点是高敏感性、可测定浓度范围宽、样本无需稀释即可检测、试剂有效期长、操作简单、检测自动化成度高、数据自动生成处理能力强、测定仪器兼容性好、无环境污染等，因而得到了迅速发展与应用，目前已广泛应用到基础和临床医学的各个领域，成为取代RIA的首选技术。但目前使用化学发光方法检测NT-proBNP还没有广泛应用在临床上。

发明内容

本发明要解决的问题是提供N末端B型脑钠肽（NT-proBNP）的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：N末端B型脑钠肽前体化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：NT-proBNP抗体包被板、NT-proBNP抗体酶结合物、NT-proBNP校准品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液。

所述的N末端B型脑钠肽前体抗体包被板的固相载体为96孔或48孔的白色微孔板，白色微孔板的孔间平均变异不高于10%。

所述的抗体酶结合物所用的酶为辣根过氧化物酶，纯度要求RZ≥3.0，活性≥250U/mL，购自Sigma公司。

所述的NT-proBNP抗体来源于Fitzgerald公司，在外观上应澄清透明，无沉淀，纯度应≥90%，采用倍比稀释测定效价应不低于10⁵倍稀释，应确保NT-proBNP测定的灵敏度、特异性和稳定性。

所述的NT-proBNP质控品包括低值质控品（QcL）和高值质控品（QcH），其中低值质控品的浓度范围是83.90～125.84pg/mL，高值质控品的浓度范围是6678.58～10017.90pg/mL。

所述的NT-proBNP化学发光免疫定量检测试剂盒，所述的发光液A液包含0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚；B液包含0.675g/L过氧化脲。

所述的20倍浓缩洗液包括75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/L Proclin300。

上述试剂盒的方法，包括以下步骤：

1）NT-proBNP抗体包被板的制备

将NT-proBNP抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，加入到96孔白色微孔板中，37℃包被2小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含0.5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37℃封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃；

2）采用高碘酸钠氧化法制备NT-proBNP抗体-HRP酶结合物，并在酶结合物中加入HRP稳定剂，储存于2～8℃；

3）NT-proBNP校准品

将NT-proBNP重组抗原用校准品稀释液配制成浓度分别为0，40，200，1000，5000，20000pg/mL的校准品，贴标签，储存于2~8℃；

4）NT-proBNP质控品的配制：在正常人血清中加入适量的NT-proBNP纯品，配制低值质控品（QcL）和高值质控品（QcH），其浓度的平均值分别为104.87pg/mL和8348.22pg/mL；

5）配制发光液A液和B液

A液是有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液为；B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲水溶液，用工艺用水配制；

6）配制20倍浓缩洗液

20倍浓缩洗液的配方如下：75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/L Proclin300；

7）组装

将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

8）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定；

ProClin 300以其广谱活性、优越的兼容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性，ProClin 300成为用于诊断试剂的理想高效防腐剂。Proclin 300防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长产品的储存时间。其水溶性确保其可轻易溶入所需试剂中。特别是，ProClin 300防腐对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，所以不会干扰检验指示剂。

本发明的NT-proBNP化学发光免疫定量测定试剂盒，采用当今最为灵敏的检测方法——化学发光免疫分析，具有一下优点：（1）反应快速，可在65分钟内判断检测结果；操作简便，无污染。（2）灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于15pg/mL。（3）特异性强，与脑钠肽（BNP）、心钠肽（ANP）的交叉特异性均小于1%。（4）精密度良好，批内精密度不高于15%，批间精密度不高于20%。（5）稳定性良好，本产品在37℃可存放7天以上，在2~8℃可存放1年。（6）成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。

附图说明

图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定NT-proBNP与放免试剂盒测定NT-proBNP的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的NT-proBNP值，横坐标为放免试剂盒测定NT-proBNP值，两种方法相关系数（r）=0.9905，直线方程y=1.0282x-14.944。

具体实施方式

实施例1：制备N末端B型脑钠肽前体（NT-proBNP）化学发光免疫定量检测试剂盒

N末端B型脑钠肽前体（NT-proBNP）化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：NT-proBNP抗体包被板、NT-proBNP抗体酶结合物、NT-proBNP校准品、NT-proBNP质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液。

通过下述方法制备N末端B型脑钠肽前体化学发光免疫定量检测试剂盒：

1）NT-proBNP抗体包被板的制备

将NT-proBNP抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，加入到96孔白色微孔板中，37℃包被2小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含0.5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37℃封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃；

2）采用高碘酸钠氧化法制备NT-proBNP抗体-HRP酶结合物，并在酶结合物中加入HRP稳定剂，储存于2～8℃；

3）NT-proBNP校准品

将NT-proBNP重组抗原用校准品稀释液配制成浓度分别为0，40，200，1000，5000，20000pg/mL的校准品，贴标签，储存于2~8℃；

4)NT-proBNP质控品的配制：在正常人血清中加入适量的NT-proBNP纯品，配制低值质控品（QcL）和高值质控品（QcH），其浓度的平均值分别为104.87pg/mL和8348.22pg/mL；

5）配制发光液A液和B液

A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液；B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲水溶液，用工艺用水配制；

6）配制20倍浓缩洗液

20倍浓缩洗液的配方如下：75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/L Proclin300；

7）组装

将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

8）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定；

说明：试剂盒性能评价指标

物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。

准确性：试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行（t检验，|t|<2.447）；以企业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0.90~1.10范围内。

企业校准品是将NT-proBNP纯品用校准品稀释液配成系列浓度，浓度分别为0，40，200，1000，5000，20000pg/mL，并由罗氏的脑利钠肽前体诊断试剂盒为其定值，储存于-20℃。

剂量-反应曲线的线性：用双对数数学模型拟合，剂量-反应曲线在0~20000pg/mL浓度范围内相关系数r不低于0.9900。

分析灵敏度：试剂盒分析灵敏度不高于15pg/mL。

精密度：批内不精密度（CV%）应不高于15%；批间不精密度（CV%）应不高于20%。

质控品测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用双对数数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为83.90～125.84pg/mL和6678.58～10017.90pg/mL。

特异性：交叉反应符合下表要求；

稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上述各项要求。

实施例2：制备N末端B型脑钠肽化学发光免疫定量检测试剂盒

除固相载体为48孔的微孔板外，以与实施例1一样的方法制备本发明试剂盒。

实施例3：本发明试剂盒的使用方法

1)将待检试剂盒在室温（18~25℃）下平衡30分钟。

2)配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。

3）配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A液与B液等体积混合。

4）根据实验需要取出适量的包被板条。设置空白对照1孔，校准品各2孔。每孔加入NT-proBNP校准品或质控品50μL，样本孔加入50μL样本，空白对照不加校准品、样本。

5）每孔加入NT-proBNP酶结合物50μL，空白对照孔除外。

6）振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应60分钟。

7）揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。

8）每孔加入发光液100μL，包括空白对照孔。

9）室温（18~25℃）下暗置5min，在化学发光免疫分析仪上测定发光值，然后采用双对数数学模型拟合，得到校准品剂量-反应曲线，样本中的CK-MB浓度与RLU之间的关系成正比，可从上述剂量-反应曲线上反推算出样本中NT-proBNP的浓度值。

实施例4本试剂盒的临床试验

本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数110例，先以NT-proBNP放射性免疫试剂盒测试后，再用本专利发明的试剂盒（化学发光）进行测定，并对测定结果进行了配对t检验、线性相关性分析及卡方检验。结果表明，直线方程为Y=1.0282X-14.944，线性回归系数为1.0282，相关系数为0.9905。线性回归系数为1.0282接近于1，说明我们的试剂盒与医院测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对相关系数进行t检验（检验水准α=0.05），P<0.001，两种方法测定的NT-proBNP值密切相关，两种方法测定的NT-proBNP值密切相关。灵敏度（真阳性率）为98.75%、特异性（真阴性率）为98.57%，都较高；而假阳性率（误诊率）为1.43%、假阴性率（漏诊率）为1.25%，都较低，可见本试剂盒的测量值与实际值（原测值）的符合程度良好。粗一致性反映试剂盒诊断病人与非病人的能力，本试剂盒的粗一致性为98.64%，接近于1，说明试剂盒的诊断能力较强。

为了确定本试剂盒的临床参考值，对642份正常人血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测，结果表明本试剂盒的参考值（参考范围）(2.5%~97.5%)为：

75岁以下：0~125pg/mL

75岁以上：0~450pg/mL

上述参考值仅供参考，建议各实验室应建立自己的临床正常及病理值范围。在临界值附近的样本应进行第二次试验确认，并进行双孔测定；超出本试剂盒线性范围的样本，是通过校准曲线外延得出的计算结果，要得到准确的结果，需将样本稀释后进行测定。

实施例5与其他检测方法产品比较

本发明的试剂盒的灵敏度较罗氏的电化学发光方法的高，且检测成本低，具有良好的临床应用价值。

Claims (2)

1.N末端B型脑钠肽前体化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：NT-proBNP抗体包被板、NT-proBNP抗体酶结合物、NT-proBNP校准品、NT-proBNP质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液，其特征在于，所述的NT-proBNP抗体包被板为包被有NT-proBNP抗体的96孔白色微孔板，白色微孔板的孔间平均变异不高于10％，包被板是将NT-proBNP抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～10μg/mL，加入到96孔白色微孔板中，37℃包被2小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37℃封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4小时制得的；所述的抗体酶结合物所用的酶为辣根过氧化物酶，纯度要求RZ≥3.0，活性≥250U/mL，采用高碘酸钠氧化法制备NT-proBNP抗体-HRP酶结合物，并在酶结合物中加入HRP稳定剂；所述的NT-proBNP抗体纯度≥90％，效价不低于10⁵倍稀释；NT-proBNP质控品包括低值质控品和高值质控品，在正常人血清中加入适量的NT-proBNP纯品，配制低值质控品QcL和高值质控品QcH，其浓度的平均值分别为104.87pg/mL和8348.22pg/mL；所述的发光液A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液；B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲水溶液，用工艺用水配制；所述的20倍浓缩洗液包括75.5g/LTris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/L Proclin300；校准品是将NT-proBNP抗原用校准品稀释液配制成浓度分别为0，40，200，1000，5000，20000pg/mL制得。

2.一种制备所述权利要求1的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)NT-proBNP抗体包被板的制备

将NT-proBNP抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～10μg/mL，加入到96孔白色微孔板中，37℃包被2小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37℃封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃；

2)采用高碘酸钠氧化法制备NT-proBNP抗体-HRP酶结合物，并在酶结合物中加入HRP稳定剂，于2～8℃下储存；

3)NT-proBNP校准品

将NT-proBNP抗原用校准品稀释液配制成浓度分别为0，40，200，1000，5000，20000pg/mL的校准品，贴标签，储存于2～8℃；

4)NT-proBNP质控品的配制：在正常人血清中加入适量的NT-proBNP纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为104.87pg/mL和8348.22pg/mL；

5)配制发光液A液和B液

A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液；B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲水溶液，用工艺用水配制；

6)配制20倍浓缩洗液

20倍浓缩洗液的配方如下：75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/L Proclin300；

7)组装

将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。