CN102749455A - 血管紧张素ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒,所述试剂盒包括:AngII抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的AngII、AngII校准品、AngⅡ质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。另外本发明还公开了一种血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便,安全无环境污染。此外,本发明还具有检测样品的浓度范围宽、试剂有效期长、稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域,具体的涉及血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)是血管紧张素中最重要的组成部分,是由血管紧张素Ⅰ在血管紧张素转换酶的作用下形成的,是一种8肽物质。血管紧张素Ⅱ与人体的血管平滑机、肾上腺皮质球状带细胞、心脏、肾脏器官的细胞上的血管紧张素受体结合,引起相应的生理效应。血管紧张素作用于血管平滑肌,可使全身微动脉收缩,动脉血压升高。血管紧张素Ⅱ是已知最强的缩血管活性物质之一。
血管紧张素Ⅱ是一种可通过内分泌、自分泌/旁分泌以及胞内分泌发挥作用的激素。它具有强烈收缩血管的作用,全身微动脉收缩,外周阻力增加,血压升高;静脉收缩,回心血量增多。AngⅡ介导交感神经系统而促进去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)释放,减少NE的再摄取,提高血管对NE的反应性,促进肾上腺释放儿茶酚胺,从而加强心功能同时通过血管的外周作用而提升血压。AngⅡ可强烈刺激肾上腺皮质球状带细胞合成和分泌醛固酮,后者促进远曲小管和集合管重吸收氯化钠及水并排钾;此外,AngⅡ尚可直接刺激近球小管重吸收氯化钠、刺激垂体后叶释放抗利尿激素而增加水的重吸收;引起入球及出球小动脉收缩,导致肾小球血流量减少,滤过系数降低。故AngⅡ有调节水盐平衡、保证循环血量、维持血压和减少尿生成的作用。所以血浆中血管紧张素II含量的测定,可为多种高血压和肾脏疾病的分型与诊断提供依据。
目前,国内外对血管紧张素II的检测较少,其中有放射免疫分析法,酶免法,化学发光法等。放射免疫分析法有放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤等缺点。随着标记免疫技术的迅速发展,各种新的检测方法层出不穷,例如ELISA方法、时间分辨免疫分析法、免疫荧光法、化学发光发等。其中化学发光免疫分析法具有敏感性高、特异性强、检测范围广、速度快等优点,越来越受到人们的关注。
发明内容
本发明要解决的问题是提供血管紧张素II的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法,解决了灵敏度低,检测范围窄的缺陷。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种血管紧张素Ⅰ化学发光免疫定量检测试剂盒包括:AngⅡ抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的AngⅡ、AngⅡ校准品、AngⅡ质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。。
所述的血管紧张素Ⅱ抗体包被板的固相载体为96孔或48孔的白色微孔板。所述的血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述的辣根过氧化物酶纯度要求RZ≥3.0,活性≥250U/mL。所述的发光液A包含0.7gL鲁米诺和0.165gL对碘酚;发光液B包含0.675gL过氧化脲。所述的20倍浓缩洗液包括75.5gL Tris,120gL NaCl,5mL/L Tween-20,1gLProclin300。
一种制备上述试剂盒的方法,包括以下步骤:
1)AngⅡ抗体包被板制备
将AngⅡ抗体加到pH9.6碳酸盐缓冲液中混匀,在每个微孔板的孔中加100uL,于4℃冰箱中放置过夜,用洗涤液洗涤五次之后,用牛血清蛋白溶液对微孔板进行封闭,弃去孔内液体后,将酶标板干燥,密封,即得经AngⅡ抗体包被的微孔板;
2)辣根过氧化物酶标记AngⅡ,得AngⅡ酶结合物;
利用高碘酸钠氧化法,将AngⅡ与辣根过氧化物酶连接在一起,形成经辣根过氧化物酶标记的AngⅡ;
3)AngⅡ校准品;
将AngⅡ抗原用校准品稀释液配制成不同浓度的校准品(浓度分别为0,20,50,150,400,1000pg/mL),分装,贴标签,储存于2~8℃。
4)AngⅡ质控品的配制:在正常人血清中加入适量的AngⅡ纯品,配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH),其浓度的平均值分别为78.50pg/mL和492.94pg/mL。
5)配制发光液A液和B液;
A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液为;B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲,用工艺用水配制。
6)配制20倍浓缩洗液;
20倍浓缩洗液的配方如下:75.5gL Tris,120g/L NaCl,5mL/L Tween-20,1g/LProclin300。
7)组装:将上述试剂组装成盒,储存于2~8℃;其中包含发光液A、发光液B、20倍浓缩洗液、AngⅡ酶结合物各1瓶,AngⅡ抗体包被板1块,AngⅡ校准品6瓶、AngⅡ质控品2瓶。
8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查,准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定;
进一步所述的包被板为包被含有AngⅡ抗体的96孔或48孔白色微孔板。
本发明方法制备的试剂盒采用如下具体形式,其包括AngⅡ抗体包被的96孔或48孔的白色微孔板、辣根过氧化物酶标记的AngⅡ、不同浓度的AngⅡ校准品、发光底液A为鲁米诺和对碘酚、发光底液B为过氧化脲、20倍浓缩洗液为配方为75.5g/L Tris,120g/L NaCl,5mL/L Tween-20,1g/LProclin300。
ProClin300以其广谱活性、优越的兼容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性,ProClin300成为用于诊断试剂的理想高效防腐剂。Proclin300防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母,从而延长产品的储存时间。其水溶性确保其可轻易溶入所需试剂中。特别是,ProClin300防腐对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响,所以不会干扰检验指示剂。
本专利发明的血管紧张素Ⅱ定量检测试剂盒,采用目前最为敏感的免疫测定方法——化学发光免疫分析技术,具有以下有点:(1)本产品分析灵敏度不高于0.05pg/mL;(2)本产品的特异性良好,与血管紧张素Ⅰ及血管紧张素1-7的交叉特异性均小于1%。(3)精密度良好,批内精密度不高于15%,批间精密度不高于20%。(4)稳定性良好,本产品在37℃可存放7天以上,在2~8℃可存放1年。(5)特异性强,反应快速,可在65分钟内判断检测结果,操作简便,安全无环境污染。此外,本发明还具有检测样品的浓度范围宽、试剂有效期长、稳定性好、等优点。性能优于国内同类产品,达到了国际先进水平,成本较国外的产品低。
附图说明
图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定AngⅡ与放免试剂盒测定AngⅡ的测定结果比较图,其中纵坐标为博奥赛斯测得的AngⅡ值,横坐标为放免试剂盒测定AngⅡ值,两种方法相关系数(r)=0.9754,直线方程y=0.9861x-0.2961。
具体实施方式
实施例1:制备血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒
血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:AngⅡ抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的AngⅡ、AngⅡ校准品、AngⅡ质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。
通过下述方法制备血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒
1)包被:将AngⅡ抗体加到pH=9.6碳酸盐缓冲液中混匀,在每个微孔板的孔中加100uL,于4℃冰箱中放置过夜,用洗涤液洗涤五次之后,用牛血清蛋白溶液对微孔板进行封闭,弃去孔内液体后,将酶标板干燥,密封,即得经AngⅡ抗体包被的微孔板。
2)利用高碘酸钠氧化法,将AngⅡ与辣根过氧化物酶连接在一起,形成经辣根过氧化物酶标记的AngⅡ。
3)AngⅡ校准品的配制
将AngⅡ抗原用校准品稀释液配制成不同浓度的校准品(浓度分别为0,20,50,150,400,1000pg/mL),分装,贴标签,储存于2~8℃。
4)AngⅡ质控品的配制:在正常人血清中加入适量的AngⅡ纯品,配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH),其浓度的平均值分别为78.50pg/mL和492.94pg/mL。
5)配制发光液A液和B液;
A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液为;B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲,用工艺用水配制。
6)配制20倍浓缩洗液;
20倍浓缩洗液的配制方法如下:75.5g/L Tris,120gL NaCl,5mL/LTween-20,1gLProclin300。
7)组装:将上述试剂组装成盒,储存于2~8℃;其中包含发光液A、发光液B、20倍浓缩洗液、AngⅡ酶结合物各1瓶,AngⅡ抗体包被板1块,AngⅡ校准品6瓶、AngⅡ质控品2瓶。8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查,准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定。说明:指标检测准确性:试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定,用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合,要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行(t检验,|t|<2.447);以企业标准品为对照品,用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合,试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0.90~1.10范围内。
企业校准品的配制:将高纯度的AngⅡ用稀释液(含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)稀释为系列梯度,经WHO标准品(NIBSC编号:86/538)标定,其浓度分别为20、50、150、400、1000pg/mL,并以不含AngⅡ的稀释液作为零值对照。
剂量-反应曲线的线性:用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合,剂量-反应曲线在0~12ng/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于0.9900。
分析灵敏度:分析灵敏度不高于0.05ng/mL。
精密度:批内不精密度(CV%)应不高于15.0%;批间不精密度(CV%)应不高于20.0%。
质控品测定值:平行测定10孔高值和低值的质控品,用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合,质控品测值应在允许范围内,QcL和QcH的允许范围分别为62.80~94.21pg/mL和394.36~591.53pg/mL。
特异性:交叉反应应符合下表要求。
稳定性:37℃放置7天,测定值应符合上各项的要求。
实施例2:制备制备血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒
除固相载体为48孔的微孔板外,以与实施例1一样的方法制备本发明试剂盒。
实施例3:本发明试剂盒的使用方法
1.将本试剂盒从4℃冰箱中取出,在室温(18~25℃)下平衡30分钟。
2.配制洗液:用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释(1mL洗液加19mL蒸馏水)。若浓缩洗液有结晶,可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。
3.根据实验需要取出适量的包被板条。设置空白对照1孔,校准品各2孔、质控品各10孔。每孔加入AngⅡ校准品、质控品和样品各50μL,空白对照不加校准品、质控品和样本。
4.每孔加入AngⅡ酶结合物50μL,空白对照孔除外。
5.手工或机器轻轻振荡10秒混匀,用盖板膜将板孔盖好,在37℃下反应60分钟。
6.揭去盖板膜,吸出或倒出反应液后,加入洗液洗五次,洗液量每次每孔不少于300μL,浸泡时间10秒,吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
7.每孔加入发光液100μL(发光液A和B在使用前5min按等体积混合),包括空白对照孔。
8.室温(18~25℃)暗置5分钟,在化学发光免疫分析仪上测定发光值。
实施例4本试剂盒的临床试验
本专利发明的试剂盒已进行了临床考核,本次临床试验选取110例临床样本,先以血管紧张素Ⅱ放射性免疫试剂盒测测试后,再用本专利发明的试剂盒(化学发光法)进行测定,对其进行了配对t检验、线性相关分析及卡方检验并评价。结果证明,两者间测定值无显著性差异,并且线性相关性极佳,临床灵敏度为100%、特异性为97.18%、粗一致性为98.18%,在临床符合率方面有很好的一致性。因此,本专利发明的试剂盒对AngⅡ的测值有效,可推广临床应用。
为了确定本试剂盒的参考值,对天津市613份正常人血浆样本采用本发明的试剂盒进行了测定,结果表明本试剂盒的正常参考值(参考范围)(2.5%~97.5%)为:
普食:卧位15~97pg/mL
立位20~115pg/mL
低钠:卧位35~105pg/mL
立位45~240pg/mL
Claims (8)
1.血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:AngⅡ抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的AngⅡ、AngⅡ校准品、AngⅡ质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。
2.根据权利要求1所述的血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述的血管紧张素Ⅱ抗体包被板为包被含有AngⅡ抗体的96孔或48孔白色微孔板。
3.根据权利要求1所述的血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述的辣根过氧化物酶纯度要求RZ≥3.0,活性≥250U/mL。
4.根据权利要求1所述的所述的血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述的AngⅡ质控品包括低值质控品和高质质控品两种,其中低值质控品的浓度范围是62.80~94.21pg/mL,高质质控品的浓度范围是394.36~591.53pg/mL。
5.根据权利要求1所述的血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述的发光液A包含0.7g/L鲁米诺和0.165gL对碘酚;发光液B包含0.675g/L过氧化脲。
6.根据权利要求1所述的血管紧张素Ⅱ化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述的20倍浓缩洗液包括75.5g/L Tris,120g/L NaCl,5mL/LTween-20,1g/LProclin300。
7.一种制备所述权利要求1的试剂盒的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)AngⅡ抗体包被板制备
将AngⅡ抗体加到pH9.6碳酸盐缓冲液中混匀,在每个微孔板的孔中加100uL,于4℃冰箱中放置过夜,用洗涤液洗涤五次之后,用牛血清蛋白溶液对微孔板进行封闭,弃去孔内液体后,将酶标板干燥,密封,即得经AngⅡ抗体包被的微孔板;
2)辣根过氧化物酶标记AngⅡ,得AngⅡ酶结合物
利用高碘酸钠氧化法,将AngⅡ与辣根过氧化物酶连接在一起,形成经辣根过氧化物酶标记的AngⅡ;
3)AngⅡ校准品
将AngⅡ抗原用校准品稀释液配制成不同浓度的校准品,浓度分别为0,20,50,150,400,1000pg/mL,分装,贴标签,储存于2~8℃;
4)AngⅡ质控品的配制:在正常人血清中加入适量的AngⅡ纯品,配制低值质控品和高值质控品,其浓度的平均值分别为78.50pg/mL和492.94pg/mL;
5)配制发光液A液和B液
A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液为;B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲,用工艺用水配制;
6)配制20倍浓缩洗液
20倍浓缩洗液的配方如下:75.5g/L Tris,120g/L NaCl,5mL/L Tween-20,1g/LProclin300;
7)组装
将上述试剂组装成盒,储存于2~8℃;
8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查,准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定。
8.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法,其特征在于,所述的包被板为包被含有有AngⅡ抗体的96孔或48孔白色微孔板。
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