CN102998469A - 叶酸磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种叶酸磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：叶酸校准品；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的叶酸抗体；叶酸酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；叶酸质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。另外本发明还公开了本发明试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、成本低、稳定性好等优点。

Description

叶酸磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种叶酸（FA）磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

叶酸（Folic acid,FA）是广泛分布的一种B族维生素。其辅酶形式是四氢叶酸的一些衍生物，在一碳单位的代谢中起作用，是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性B族维生素，是米切尔（H．K．Mitchell，1941）从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸，有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，对孕妇尤其重要。

叶酸是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质，在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸在体内参与嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和转化。叶酸在制造核酸（核糖核酸、脱氧核糖核酸）上扮演重要的角色。叶酸帮助蛋白质的代谢，并与叶酸共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质。叶酸也作为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）及其它微生物的促进增殖因子而起作用，国外研究人员发现，叶酸可引起发癌细胞凋亡，对癌细胞的基因表达有一定影响，故属于一种天然抗癌维生素。

血清叶酸升高常见于肠盲袢综合征、恶性贫血或者是长期素食者叶酸可引起升高。血清叶酸降低多见于巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、酒精中毒或正常妊娠时血清叶酸也会降低，骨髓增生性疾病叶酸也会降低。

目前，测定叶酸的方法有放射性免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫分析等，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄。磁微粒化学发光分析法将化学发光免疫分析技术和免疫磁微粒技术相结合，大大提高了检测灵敏度和准确性，但是还没有利用到叶酸（FA）的快速检测中。

发明内容

本发明要解决的问题是提供FA的磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：叶酸磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：浓度为FA校准品浓度0，1，2，5，10，20ng/mL，校准品稀释液为1%BSA（牛血清蛋白）；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的FA抗体；FA酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；叶酸质控品，所述FA质控品包括低值质控品和高值质控品，Q低值质控品浓度1.7~2.3ng/mL；高值质控品浓度12.75~17.25ng/mL；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。

进一步，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制。

进一步，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1～2um。

进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）叶酸校准品的配制：

将FA纯品用1%牛血清溶液稀释成系列梯度，浓度分别为0，1，2，5，10，20ng/mL；

（2）叶酸质控品的配制：

将叶酸纯品用1%牛血清溶液配制高值质控品和低值质控品，低值质控品浓度1.7~2.3ng/mL，高值质控品浓度12.75~17.25ng/mL；

（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入10mg磁微粒和3mg链酶亲和素，搅拌30min，然后加入10mg/mL的EDC溶液3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的叶酸抗体的制备

取0.5mg叶酸抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30～60min；用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3～5次；

（5）叶酸酶结合物的制备

采用高碘酸钠氧化法将叶酸与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:10000，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2~8℃。酶稳定剂是一种可以保持蛋白质在冻干或溶液下保持天然折叠构想的试剂，有利于抗原或抗体的保存，避免外界因素如温度、pH、盐、金属离子及其他污染物影响其稳定性。

（6）20倍浓缩洗液的配制

20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

本发明的原理是，本试剂盒采用竞争法原理测定血清或血浆中的叶酸，在亲和素-磁微粒悬浮液中加入生物素-FA抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形成磁微粒-亲和素-生物素-FA抗体复合物，加入样本和酶结合物后，酶结合物与样本中的FA竞争结合磁微粒表面的FA抗体，形成磁微粒-亲和素-生物素-FA抗体-FA-HRP复合物，用磁场将复合物吸附在试管底部，清洗掉游离的成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5分钟测定各加样孔的发光值（RLU）。样本的发光值与样本中FA浓度呈负相关。样本中的FA浓度依据由校准品ALD浓度和对应的RLU建立的Log（X）-Logit（Y）数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的FA含量。

本专利发明的叶酸（FA）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒，具有以下优点（1）反应快速，可在40分钟内判断检测结果；操作简便，无污染。（2）灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于0.5ng/mL。（3）特异性强，本产品对蝶啶胺、亚叶酸、甲氨蝶呤的交叉特异性均小于0.1%。（4）精密度良好，批内和批间精密度不高于10%。（5）稳定性良好，本产品在37℃可存放7天以上，在2～8℃可存放1年。（6）成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。

附图说明

图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定叶酸与放免试剂盒测定叶酸的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的叶酸值，横坐标为放免试剂盒测定叶酸值，两种方法相关系数（r）=0.9785，直线方程y＝1.041x-0.345。

具体实施方式

实施例1：制备叶酸（FA）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅰ

（1）叶酸校准品的配制：

将FA纯品用1%牛血清溶液稀释成系列梯度，浓度分别为0，1，2，5，10，20ng/mL；

（2）叶酸质控品的配制：

将叶酸纯品用1%牛血清溶液配制高值质控品和低值质控品，低值质控品浓度1.7ng/mL范围内，高值质控品浓度17.25ng/mL；

（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入10mg磁微粒和3mg链酶亲和素，搅拌30min，然后加入10mg/mL的EDC溶液3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的叶酸抗体的制备

取0.5mg叶酸抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应60min；用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3次；

（5）叶酸酶结合物的制备

采用高碘酸钠氧化法将叶酸与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:10000，并加入20%酶稳定剂，储存于2~8℃。酶稳定剂使用SurModics In VitroTechnologies的蛋白稳定剂产品。

（6）20倍浓缩洗液的配制

20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

说明：

1.物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。

2.准确性：试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行（t检验，|t|<2.447）；以ALD企业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0.90~1.10范围内。

3.剂量-反应曲线的线性：用双读数数学模型拟合，剂量-反应曲线在0.5-20ng/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于0.9900。

4.分析灵敏度：试剂盒分析灵敏度不高于0.5ng/mL。

5.精密度：批内和批间不精密度（CV%）应不高于10%。

6.质控品的测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Log(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为1.7~2.3ng/mL、12.75~17.25ng/mL。

7.特异性：

表1交叉反应符合下表要求：

8.稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上述各项要求。

实施例2：制备叶酸（FA）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅱ

（1）叶酸校准品的配制：

同实施例1叶酸校准品的配制

（2）叶酸质控品的配制：

将叶酸纯品用1%牛血清溶液配制高值质控品和低值质控品，低值质控品浓度2.3ng/mL，高值质控品浓度12.75ng/mL；

（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

同实施例1磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备

（4）生物素标记的叶酸抗体的制备

取0.5mg叶酸抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30min；用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液4次；

（5）叶酸酶结合物的制备

采用高碘酸钠氧化法将叶酸与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:10000，并加入5%酶稳定剂，储存于2~8℃。酶稳定剂使用SurModics In VitroTechnologies的蛋白稳定剂产品。

（6）20倍浓缩洗液的配制

同实施例120倍浓缩洗液的配制；

（7）化学发光液A液和B液的配制

同实施例1化学发光液A液和B液的配制

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

实施例3：制备叶酸（FA）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅲ

（1）叶酸校准品的配制：

同实施例1叶酸校准品的配制

（2）叶酸质控品的配制：

将叶酸纯品用1%牛血清溶液配制高值质控品和低值质控品，低值质控品浓度2.0ng/mL，高值质控品浓度15.75ng/mL；

（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

同实施例1磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备

（4）生物素标记的叶酸抗体的制备

取0.5mg叶酸抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析2h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应50min；用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液5次；

（5）叶酸酶结合物的制备

采用高碘酸钠氧化法将叶酸与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:10000，并加入15%酶稳定剂，储存于2~8℃。酶稳定剂使用SurModics In VitroTechnologies的蛋白稳定剂产品。

（6）20倍浓缩洗液的配制

同实施例120倍浓缩洗液的配制；

（7）化学发光液A液和B液的配制

同实施例1化学发光液A液和B液的配制

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

实施例4：本发明试剂盒的使用方法

1将待检试剂盒在室温（18~25℃）下平衡30分钟。

2配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。

3配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合。

4将反应管编号，向试管中依次加入10-50uL校准品或血清标本、100uL磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液、100uL生物素-FA抗体结合物、100uLFA酶结合物，37℃下振荡反应10-30min，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上清液，加入500uL洗液，充分混匀后，于磁分离器上分离，倒出洗液，重复3次，在各管中加入化学发光底物液200-400uL，充分混匀，暗置5min，在管式化学发光仪上测定各管的发光值（RLU），以校准品浓度的Log值为横坐标，以发光值的Logit为纵坐标，绘制标准曲线，根据血清标本的发光值即可计算出FA的浓度。

实施例5：本试剂盒的方法学评价结果

实施例6：本试剂盒的临床对比实验

本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数110例，先以FA放射性免疫试剂盒测试后，再用本专利发明的试剂盒（化学发光）进行测定，结果表明，直线方程为y=1.041x-0.345，相关系数为R2=0.9575。可见本方法制备的试剂盒与医院测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对两种方法的FA测值进行t检验（检验水准α=0.05），P=0.236＞0.05，两种方法测定的FA值没有显著差异，可见两种方法测定的FA值密切相关。灵敏度（真阳性率）为92.50%、特异性（真阴性率）为100.00%，都较高；而假阳性率（误诊率）为0.00%、假阴性率（漏诊率）为7.50%，都较低，可见本试剂盒的测量值与实际值（原测值）的符合程度良好。粗一致性反映试剂盒诊断病人与非病人的能力，本试剂盒的粗一致性为97.27%，接近于1，说明试剂盒的诊断能力较强。

为了确定本试剂盒的临床参考值，对522份正常人血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测，其中男性261例，年龄19~73岁，平均年龄40.2岁；女性261例，年龄18~72岁，平均年龄41.2岁，结果表明本试剂盒的参考值（参考范围）为3~17ng/mL。

Claims (5)

1.叶酸磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1）FA校准品，FA校准品浓度0，1，2，5，10，20ng/mL，校准品稀释液为1%牛血清溶液；

2）偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；

3）生物素标记的FA抗体；

4）FA酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；

5）FA质控品；

所述FA质控品包括低值质控品和高值质控品，低值质控品浓度1.7~2.3ng/mL；高值质控品浓度12.75~17.25ng/mL；

6）化学发光液A液和B液；

7）20倍浓缩洗液；

8）反应管。

2.根据权利要求1所述的叶酸磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。

3.根据权利要求1所述的叶酸磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1～2um。

4.根据权利要求1所述的叶酸磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

5.一种制备所述权利要求1的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）叶酸校准品的配制：

 将叶酸纯品用1%牛血清溶液稀释成系列梯度，浓度分别为0，1，2，5，10，20ng/mL；

（2）叶酸质控品的配制：

将叶酸纯品用1%牛血清溶液配制高值质控品和低值质控品，低值质控品浓度1.7~2.3ng/mL，高值质控品浓度12.75~17.25ng/mL；

（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素，搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的叶酸抗体的制备

取0.5mg叶酸抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30～60min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3～5次；

（5）叶酸酶结合物的制备

采用高碘酸钠氧化法将叶酸与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:10000，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2~8℃；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

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