CN103076458A - 游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位磁微粒化学发光法定量测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地提供了一种简便、快速、灵敏度高、线性范围宽、稳定性好的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位磁微粒化学发光法定量测定试剂盒及其制备方法。该方法结合磁微粒免疫分离技术在酶联免疫分析的基础上应用酶促化学发光底物，通过检测发光第五产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物，因而其灵敏度大大提高，并且操作简便实用性广，既可应用于开放式的半自动化学发光检测仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量、快检测，使用成本低，更易推广应用。

Description

游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位磁微粒化学发光法定量测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地提供了一种简便、快速、灵敏度高、线性范围宽、稳定性好的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位磁微粒化学发光法定量测定试剂盒及其制备方法 

背景技术

hCG是由胎盘绒毛膜的合体滋养层产生的一种糖蛋白，由α和β二个单位通过离子键和疏水键结合在一起。α亚单位是垂体前叶激素所共有，它与FSH、LH、TSH的α亚单位结构相似。β亚单位的结构与LH等的β亚单位不同，在免疫活性上可予区别。血中β亚单位大部分以全分子形式存在，游离态的β亚单位（F-hCGβ）占hCG的1～5%左右。血中游离态的β亚单位是在受孕后6～8天产生，50～80天达到高峰，以后平稳下降，直至孕18周左右稳定于一定浓度。 

唐氏综合征又称先天愚型，21-三体综合征，是最常见的染色体疾病和弱智的病因，新生儿中发病率约为1/700左右。根据染色体核型的不同，唐氏综合征分为单纯21三体型、嵌合型和易位型三种类型。唐氏综合征的发生起源于卵子或精子发生的减数分裂过程中染色体的不分离现象，通常是随机发生的，约95%的不分离现象来源于母亲，仅5%左右发生在精子发生期。其结果是21号染色体多了一条，多出的一条染色体因剂量效应破坏了正常基因组遗传物质间的平衡，导致患儿智力低下，颅面部畸形及特殊面容，肌张力低下，多并发先天性心脏病，患者白血病的发病率为普通人群的10-20倍。生活难以自理，患者预后一般较差，50%左右于5岁前死亡。 

目前对唐氏综合征缺乏有效的治疗方法。通过孕早、中期检测孕妇血中 PAPP-A,游离β-hCG,AFP等，结合B超检查，可将约90%的唐氏综合征检测出来。对高风险胎儿，通过绒毛活检或羊水穿刺或脐血穿刺等技术作染色体核型分析可以确诊，然后流产处理。 

怀有唐氏综合征（DS）胎儿的孕妇，一部分人其血清F-hCGβ水平呈强直性升高，平均MOM值为2.3～2.4MOM。F-hCGβ在孕早期和孕中期都处于高水平。妊娠中期DS孕妇血清F-hCGβ浓度比正常至少高2倍。F-hCGβ用于DS风险的评估，敏感期可从孕早 期到孕中期（7～20周）。 

目前用于检测游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多有点得到了广泛的应用。 

然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，是的某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。 

磁分离化学发光免疫分析法综合采用了目前国际上的两大主流免疫分析尖端技术—悬浮磁微粒载体技术、化学发光检测技术，使系统能够充分满足临床对检测结果的要求： 

1、检测范围宽：表面巨大的磁微粒免疫反应载体、灵敏稳定的碱性磷酸酶底物APCL-Ⅰ化学发光体系保证了宽的线性范围。 

2、灵敏度高：APCL-Ⅰ发光系统，使检测信号大为增强。检测限可达10-19mol的水平；悬浮磁微粒比表面巨大，可有效捕获样品中的痕量待测物，提高检测的灵敏度。 

3、特异性强：选用单克隆抗体，与潜在交叉物无明显交叉反应 

4、快速准确：悬浮磁微粒作为反应载体，可发挥液相免疫反应的优点，保证免疫反应和发光反应迅速达到平衡，无需耗时等待；APCL-Ⅰ发光峰值到达时间短、峰值平台稳定，使检测快速、准确。 

本发明的试剂盒利用化学发光免疫分析结合免疫磁微粒固相分离技术检测F-hCGβ,有助于促进化学发光免疫分析技术在临床检验中的应用与发展。现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒多为进口的封闭式全自动化学发光检测系统，需要昂贵的全自动化学发光检测仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明是结合磁微粒免疫分离技术在酶联免疫分析的基础上应用酶促化学发光底物，通过检测发光第五产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物，因而其灵敏度大大提高，并且操作简 便实用性广，既可应用于开放式的半自动化学发光检测仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量、快检测，使用成本低，更易推广应用。 

发明内容

本发明目的在于提供一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位磁微粒化学发光法定量测定试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括： 

1）游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位系列校准品；2）抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒溶液；3）异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液；4）碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液；5）碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液；6）清洗液浓缩液；以及7）反应管。 

所述试剂盒使用的反应管材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯或者聚丙烯。 

所述化学发光底物液是摩尔浓度为0.1～0.3M，pH值为8～10的Tris-HCl缓冲液，其包含0.2～0.4mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)。 

所述化学发光底物液优选摩尔浓度为0.2M，pH值为9.3的Tris-HCl缓冲液，其包含0.3mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)。 

所述清洗液浓缩液为摩尔浓度为0.1～0.2M、pH值为8～9的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量百分浓度为0.01～0.04%的吐温20和质量百分浓度为15～20%的氯化钠。 

所述清洗浓缩液优选摩尔浓度为0.1M、pH值为8的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量百分浓度为0.02%的吐温20和质量百分浓度为15%的氯化钠。 

上述试剂盒的制备方法，包括以下操作步骤： 

1）游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位系列校准品的制备：用新生牛血清将人绒毛膜促性腺激素β亚单位纯品稀释为系列校准品，其校准品浓度范围为0～200ng/mL； 

2）抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备：将粒径为0.7～3μm的磁微粒加磁场，静置10～20min，倒出上清液，用pH=4.7的25mM的MES缓冲液清洗3次，并用该缓冲液进行悬浮，浓度为50mg/mL；每mL悬浮液中加入抗FITC多克隆抗体1～3 mg，在室温条件下混合均匀；用去离子水配制浓度为10mg/ mL的EDC溶液，每mL磁微粒悬浮液中加入1mL浓度为10mg/ mL的EDC溶液，在室温条件下搅拌反应4小时后，加磁场，静置10～20min,倒出上清液，用pH值为8.0、含有质量百分浓度为0.5%的牛血清白蛋白和质量百分浓度为0.2%的叠氮化钠防腐剂的摩尔浓度为0.05~0.2M的Tris-HCl缓冲液清洗3～5次，得到包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒，并用该缓冲液将包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒配制成浓度为0.5～2μg/mL的抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶 液； 

3）异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液的制备：将游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体置于透析袋，在pH=9.0，摩尔浓度为0.2M的碳酸盐缓冲液中过夜透析；用摩尔浓度为0.2M的pH＝9.0的NaHCO₃溶液配制浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，每mg抗体加入0.15mL浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，混合均匀，室温下反应20-24小时后，在pH=9.0的摩尔浓度为0.2M的碳酸盐缓冲液中过夜透析，即得到异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体，用含有质量百分浓度为0.5%的牛血清白蛋白和质量百分浓度为0.2%的叠氮化钠防腐剂的摩尔浓度为0.1M的Tris-HCl缓冲液稀释得到的异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体，得到浓度为0.25～0.5μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液； 

4）碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液的制备：用去离子水配制13.76mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，取游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体预先装在尖底试管里，加入试管体积1/100的13.76 mg/mL 的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，混匀，在室温下放置30分钟；计算所需要的碱性磷酸酶的量，即抗体的量乘以1。用无水N,N-二甲基甲酰胺配制6.69mg/mL 的Sulfo-SMCC溶液，在含有碱性磷酸酶的反应管中加入试管体积1/20的Sulfo-SMCC溶液溶液，混匀，在室温下放置15分钟；将上述活化后的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体中加入试管体积1/500的1M的MgCl2溶液，再加入活化后的碱性磷酸酶溶液，将试管放在4℃条件下14-16小时；安装蛋白质纯化系统(AKTA purifier100),使用Superdex 200制备级 16/70(或相近)柱子，使用pH=7.0去离子水配制的质量质量浓度为2%的三乙醇胺溶液进行平衡,流速1ml/min. 收集各洗脱峰流分，测定各洗脱峰流分的280nm处吸光值,收集280nm处吸光值大于0.02的流份，计算蛋白浓度(ABS1.0=0.6mg/ml)。用含有质量百分浓度为0.5%的牛血清白蛋白和质量百分浓度为0.2%的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液稀释上述得到的流份，得到浓度为0.25～0.5μg/mL的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液； 

5）碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液的制备：向摩尔浓度为0.1～0.3M，pH值为8～10的Tris-HCl缓冲液添加二氧杂环乙烷化合物(APCL)得到二氧杂环乙烷化合物的浓度为0.2～0.4mg/mL的化学发光底物液； 

6）清洗液浓缩液的制备：向摩尔浓度为0.1～0.2M、pH值为8～9的Tris-HCl缓 冲液中加入吐温20和氯化钠，其中清洗液浓缩液中吐温20的质量百分浓度为0.01～0.04%，氯化钠的质量百分浓度为15～20%； 

7）分装上述游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位系列校准品、抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液、异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液、碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液、碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液、清洗液浓缩液和反应管； 

8）组装为成品。 

所述清洗液浓缩液使用时用去离子水稀释15倍。 

所述的磁微粒的粒径为0.7～3μm、内核为四氧化三铁、表面包裹着含有羧基的聚合物。 

所述碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液的制备优选使用摩尔浓度为0.2M，pH值为9.3的Tris-HCl缓冲液，化学发光底物液中的二氧杂环乙烷化合物(APCL)的浓度优选为0.3mg/mL。 

所述清洗浓缩液优选使用摩尔浓度为0.1M、pH值为8的Tris-HCl缓冲液中加入吐温20和氯化钠进行制备，且制备得到的清洗液浓缩液中吐温20的质量百分浓度为0.02%，氯化钠的质量百分浓度为15%。 

所述游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位校准品的原料为标准级，纯度不低于99%。 

本发明的检测原理：将待测样本，试剂1号混合温育，R1中的荧光素（FITC）标记的抗F-hCGβ单克隆抗体与样本中F-hCGβ抗原分子结合，形成免疫复合物，然后加入包被着抗FITC抗体的磁微粒，免疫复合物被吸附到磁微粒表面。洗涤去除未结合的抗体和杂质后加入试剂2号混合温育，R2中的碱性磷酸酶（ALP）标记的抗F-hCGβ单克隆抗体与上述免疫复合物中的F-hCGβ抗原分子结合。洗涤去除未结合的抗体和杂质后加入发光底物，ALP催化底物发光，测定相对发光强度（RLU）。在一定范围内RLU与F-hCGβ抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的F-hCGβ含量。 

本发明采用两步法双抗体夹心法的反应模式，有效地利用了化学发光检测技术结合磁微粒免疫分离技术原理，定量测定人体血清样品中的F-hCGβ的含量，确保了检测的灵敏度，且各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。使用的磁微粒具有超顺磁、高分散、表面积大的特点。对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单可靠，可快速、高通量检测大批样品，便于操作和生产。本发明的试剂盒结构简便，使用方便，灵敏度 高，特异性强，检测范围宽，操作简单，试剂盒成本低，无放射性污染，临床适用性强，更适用于我国临床检测及筛查实验室，适合在国内的各级医院推广使用。 

附图说明

图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品曲线图(横坐标为浓度，单位为ng/mL，纵坐标为发光值) 

图2为本发明的试剂盒同国外试剂盒（PerkinElmer公司的微孔板式时间分辨荧光试剂盒），图中横坐标x为实施例1制备得的试剂盒样本测值，浓度单位为ng/mL，纵坐标y为PerkinElmer公司试剂盒样本测值，浓度单位为ng/mL 

图3为实施例1所制备的试剂盒的最低检测限一次方程曲线

具体实施方式

实施例1 制备本发明的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位磁微粒化学发光法定量测定试剂盒

一、F-hCGβ校准品的制备 

用新生牛血清将F-hCGβ纯品稀释成校准品，分装0ng/mL、5 ng/mL、15 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL共6瓶。 

二、抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备 

将粒径为1μm的磁微粒加磁场，静置15min，倒出上清液，用pH=4.7的25mM的MES缓冲液清洗3次，并用该缓冲液进行悬浮，浓度为50mg/mL;每mL悬浮液中加入抗FITC多克隆抗体2 mg，在室温条件下混合均匀；用去离子水配制浓度为10mg/ mL的EDC溶液，每mL磁微粒悬浮液中加入1mL浓度为10mg/ mL的EDC溶液，在室温条件下搅拌反应4小时后，加磁场，静置15min,倒出上清液，用pH值为8.0、含有质量百分浓度为0.5%的牛血清白蛋白和0.2%的叠氮化钠防腐剂的0.1M的Tris-HCl缓冲液清洗4次，并用该缓冲液将包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒配制成1μg/mL的磁微粒溶液。磁微粒试剂在4℃保存，不应冻存，用时混匀。 

三、异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液的制备 

将游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体置于透析袋，在pH=9.0,摩尔浓度为0.2M碳酸盐缓冲液中过夜透析；用摩尔浓度为0.2M的pH=9.0的NaHCO₃溶液配制浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，每mg抗体加入0.15mL浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，混合均匀，室温下反应20小时后，在pH=9.0,摩尔浓度为0.2M碳酸盐缓冲液中过夜透析，即得到异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体，用含有 质量百分含量为0.5%的牛血清白蛋白和质量百分含量为0.2%的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液稀释异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体，得到浓度为0.5μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液。 

四、碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液的制备 

用去离子水配制13.76mg/mL 的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，取游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体预先装在尖底试管里，加入试管体积1/100的13.76 mg/mL 的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，混匀，在室温下放置30分钟；计算所需要的碱性磷酸酶的量，即抗体的量乘以1。用无水N,N-二甲基甲酰胺配制6.69mg/mL 的Sulfo-SMCC溶液，在含有碱性磷酸酶的反应管中加入试管体积1/20的Sulfo-SMCC溶液溶液，混匀，在室温下放置15分钟；将上述活化后的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体中加入试管体积1/500的1M MgCl2溶液，再加入活化后的碱性磷酸酶溶液，将试管放在4℃条件下14-16小时；安装蛋白质纯化系统(AKTA purifier100),使用Superdex 200制备级 16/70(或相近)柱子，使用pH=7.0去离子水配制的质量百分浓度为2%的三乙醇胺溶液进行平衡,流速1ml/min. 收集各洗脱峰流分，测定各洗脱峰流分的280nm处吸光值,收集280nm处吸光值大于0.02的流份，计算蛋白浓度(ABS1.0=0.6mg/ml)。用含有质量百分浓度为0.5%的牛血清白蛋白和质量百分浓度为0.2%的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液稀释上述得到的流份，得到浓度为0.5μg/mL的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液。 

五、碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液的制备 

用0.2M pH值为9.3的Tris-HCl缓冲液配制二氧杂环乙烷化合物(APCL)终浓度为0.3mg/mL的溶液。 

六、清洗液浓缩液的配制 

向摩尔浓度为0.1M、pH值为8的Tris-HCl缓冲液中加入吐温20和氯化钠，其中清洗液浓缩液中吐温20的质量百分浓度为0.02%，氯化钠的质量百分浓度为15%； 

七、将用上述方法制备的各组分检验合格后组装成试剂盒，组装成试剂盒后需要抽检合格后才能出厂。 

实施例2 本发明的试剂盒的使用方法 

一、样本要求 

取5.0ml静脉血至玻璃试管中，不加抗凝剂，在室温中静置，然后通过离心 （3000rpm×5min）分离血清部分。 

二、检测方法 

试剂从储存条件下取出后应平衡到室温再用于检测；磁分离试剂：使用前彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀，不能使用磁力搅拌器搅拌；清洗浓缩液：用去离子水稀释15倍，混匀；设定好37℃水浴；请使化学发光检测仪处于待测状态；根据需要准备试管并做好标记。 

使用本试剂盒按照实施2的方法进行实验的具体操作步骤如下： 

加10μl 校准品、质控品和待测标本至对应试管中，将液体加至试管底部是操作的关键。每个样品应更换移液器头避免交叉污染。加50μl R1试剂（FITC标记试剂）至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀30秒（2000转/分），置37±0.5℃水浴10分钟。试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接触，沉淀2分钟。用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，拍击，以除去沾在管壁上的液滴。加300μl清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀30秒（2000转/分）。重复上述清洗操作，共清洗3次。加100μl R2试剂（ALP标记试剂）至每一试管中。用多管混匀器振荡混匀30秒（2000转/分），置37±0.5℃水浴10分钟。用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，拍击，以除去沾在管壁上的液滴。加300μl清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀30秒（2000转/分）。重复上述清洗操作，共清洗3次。加100μl 发光底物溶液至试管中，混匀3秒，在5分钟内用发光检测仪进行检测。利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方程，再根据待测样本的相对发光强度可以从回归曲线上返算出样本中待测物的浓度。见附图1，F-hCGβ的浓度－发光值曲线。 

实施例3 本发明的试剂盒的方法学检定 

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果如下： 

1、试剂盒精密度测定 

（1）分析内精密度 

将实施例1中制备的试剂盒一批，分别测定低、中、高三种不同浓度的血清，10孔平行测定，得出批内变异系数为4.35%～6.25%。 

表1分析内精密度测试 

测定血清浓度（ng/mL）	测定次数	分析内CV(%)
			10.58	10	6.25
78.65	10	3.69
			126.36	10	4.35

[0067] （2）分析间精密度

将实施例1中制备的试剂盒取三批，每批试剂盒均测定低、中、高三种不同浓度的血清，10孔平行测定。每份血清得到30个浓度测值，统计分析间变异系数为5.65%～7.98%。 

表2分析间精密度测试 

测定血清浓度（ng/mL）	测定次数	分析内CV(%)
			10.58	30	7.98
78.65	30	5.65
			126.36	30	5.89

2、试剂盒准确度测定 

准确性是指测量值接近真值的程度，通常用回收率表示。取两个F-hCGβ临床定值血清，浓度分别为7.69ng/mL和12.36ng/mL，分别向其中添加一定浓度的标准品，按照实施例1的方法对每个浓度做3个平行，计算回收率。结果如表2所示，F-hCGβ的添加回收率在97.1%～102.9%之间。 

表3、准确度测定 

3、最低检测限 

最低检测线是在一给定的显著性水平上可与零剂量向区别的剂量。用零浓度校准品 作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的相对发光强度（RLU）值，计算其平均值（M）和标准差（SD），得出M+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。  

（1）A点发光值 

A点发光均值X=692 

SD=44.8 

X+2SD=781.7 

（2）B点发光值 

F-hCGβ-STD-B(RLU)
	25095
27036

B点发光均值X=692 

（3）A,B点连点拟合曲线 

（4）灵敏度=0.018ng/mL 

4、试剂盒特异性实验 

对实施例1的试剂盒特异性检验是选取与F-hCGβ有类似结构的促黄体生成激素（LH）、促甲状腺激素（TSH）、促卵泡生成激素（FSH），配制成大于生理浓度的样本，以本方法进行测定，并计算交叉反应率。结果见表4，本法与LH、 TSH、 FSH的交叉反应率均小于0.04% 

表4 特异性实验 

注：F-hCGβ单位换算ng/mL＝mIU/ml 

5、试剂盒稳定性实验 

对实施例1的试剂盒分别进行4℃ 12个月和37℃ 7天的稳定性实验，结果表明试剂盒标准品发光强度的变化、批内和批间精密度、准确性等指标均在正常范围之内，试剂盒有效期可达12个月。 

经过大量的实验证明，本发明的试剂盒方法学指标如下： 

检测范围：0～200 ng/mL 

灵敏度：最小检测限不高于0.2ng/mL 

精密度：小于10% 

准确性：平均回收率在95%～105% 

特异性：与促黄体生成激素（LH）、促甲状腺激素（TSH）、促卵泡生成激素（FSH）的交叉小于0.04%。 

稳定性：试剂各组分置4℃ 12个月和37℃ 7天后测定结果均符合要求，试剂盒效期可达12个月。 

实施例4 本发明的试剂盒同国外试剂盒临床样本测值比对 

用实施例1制备得的试剂盒（使用方法见实施例2）和PerkinElmer公司的时间分辨荧光法试剂盒对100份人血清样品同时进行检测。其检测见过见附图2，以本发明方 法的测的血清F-hCGβ浓度为横坐标，以PerkinElmer试剂盒测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：y  = -1.1875  + 1.0528  x  ，相关系数为：0.9874。经统计学处理结果表明，本方法同国外试剂盒临床样本测值相关性良好。 

Claims (8)

1.一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位磁微粒化学发光定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1）游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位系列校准品；2）抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒溶液；3）异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液；4）碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液；5）碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液；6）清洗液浓缩液；以及7）反应管。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒的反应管所使用的材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯或者聚丙烯。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液是摩尔浓度为0.1～0.3M ，pH值为8～10的Tris-HCl缓冲液，其包含0.2～0.4mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗液浓缩液为摩尔浓度为0.1～0.2M，pH值为8～9的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量百分浓度为0.01～0.04%的吐温20和质量百分浓度为15～20%的氯化钠。

5.一种制备权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于以下步骤：

1）游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位系列校准品的制备：用新生牛血清将人绒毛膜促性腺激素β亚单位纯品稀释为系列校准品，其校准品浓度范围为0～200ng/mL；

2）抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备：将粒径为0.7～3μm的磁微粒加磁场，静置10～20min,倒出上清液，用pH=4.7的25mM的MES缓冲液清洗3次，并用该缓冲液进行悬浮，浓度为50mg/mL;每mL悬浮液中加入抗FITC多克隆抗体1～3 mg，在室温条件下混合均匀；用去离子水配制浓度为10mg/ mL的EDC溶液，每mL磁微粒悬浮液中加入1mL浓度为10mg/ mL的EDC溶液，在室温条件下搅拌反应4小时后，加磁场，静置10～20min,倒出上清液，用pH值为8.0、含有质量百分浓度为0.5%的牛血清白蛋白和质量百分浓度为0.2%的叠氮化钠防腐剂的摩尔浓度为0.05~0.2M 的Tris-HCl缓冲液清洗3～5次，得到包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒，并用该缓冲液将包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒配制成浓度为0.5～2μg/mL的抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液；

3）异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液的制备：将游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体置于透析袋，在pH=9.0，摩尔浓度为0.2M的碳酸盐缓冲液中过夜透析；用摩尔浓度为0.2M的pH=9.0的NaHCO₃溶液配制浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，每mg抗体加入0.15mL浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，混合均匀，室温下反应20-24小时后，在pH=9.0，摩尔浓度为0.2M的碳酸盐缓冲液中过夜透析，即得Tris-HCl缓冲液稀释得到的异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体，得到浓度为0.25～0.5μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液；

4）碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体的制备：用去离子水配制13.76mg/mL 的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，取游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体预先装在尖底试管里，加入试管体积1/100的13.76 mg/mL 的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，混匀，在在室温下放置30分钟；计算所需要的碱性磷酸酶的量，即抗体的量乘以1；用无水N,N-二甲基甲酰胺配制6.69mg/mL 的Sulfo-SMCC溶液，在含有碱性磷酸酶的反应管中加入试管体积1/20的Sulfo-SMCC溶液溶液，混匀，在在室温下放置15分钟；将上述活化后的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体中加入试管体积1/500的1MMgCl2溶液，再加入活化后的碱性磷酸酶溶液，将试管放在4℃条件下14-16小时；安装蛋白质纯化系统,使用Superdex 20或类似制备柱，使用pH=7.0去离子水配制的质量百分浓度为2%的三乙醇胺溶液进行平衡，流速1ml/min，收集各洗脱峰流分，测定各洗脱峰流分的280nm处吸光值,收集280nm处吸光值大于0.02的流份，计算蛋白浓度(ABS1.0=0.6mg/ml)；用含质量百分浓度为0.5%的牛血清白蛋白和质量百分浓度为0.2%的叠氮化钠防腐剂的摩尔浓度为0.1M 的Tris-HCl缓冲液稀释上述得到的流份，得到浓度为0.25～0.5μg/mL的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液；

5）制备碱性磷酸酶所作用的法学发光底物液：向摩尔浓度为0.1～0.3M，pH值为8～10的Tris-HCl缓冲液添加二氧杂环乙烷化合物(APCL)得到二氧杂环乙烷化合物的浓度为0.2～0.4mg/mL的化学发光底物液；

6）清洗液浓缩液的配制：向摩尔浓度为0.1～0.2M、pH值为8～9的Tris-HCl缓冲液中加入吐温20和氯化钠，其中清洗液浓缩液中吐温20的质量百分浓度为0.01～0.04%，氯化钠的质量百分浓度为15～20%；

7）分装上述游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位系列校准品、抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液、异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液、碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液、碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液、清洗液浓缩液和反应管；

8）组装为成品。

6.根据权利5所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中:所述的磁微粒为0.7～3μm粒径、内核为四氧化三铁、表面包裹着含有羧基的聚合物，所述的抗体包被磁微粒是通过EDC一步法以抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤4）中，采用2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液活化游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体；采用Sulfo-SMCC溶液活化碱性磷酸酶；使用蛋白质纯化系统,Superdex 200或类似制备柱纯化碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体；使用pH=7.0去离子水配制的质量百分浓度为2%的三乙醇胺溶液作为流动相。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤5）中，Tris-HCl缓冲液的摩尔浓度为0.2M， pH值为9.3，二氧杂环乙烷化合物(APCL)的终浓度为0.3mg/mL。

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