CN105372418A - 一种信号放大免疫检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种信号放大免疫检测方法。该方法是利用过滤器进行信号放大免疫定量检测的方法，为采用过滤器(过滤层内的过滤芯为偶联了待检物的特异性结合物的固相材料)依次将含有待检物的待检样本溶液A、经亲和素标记的检测物(能够与所述待检物特异性结合)溶液B、经生物素标记的指示剂溶液C过滤，从而根据指示剂的颜色或光量变化计算溶液A中待检物的量。实验证明，本发明亲和素-生物素放大这一反应顺序，与常规的生物素-亲和素放大反应顺序相比，具有更强的生物信号放大效果。该方法可用于检测包括来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品定量免疫检测的产品开发中的应用。

Description

一种信号放大免疫检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种信号放大免疫检测方法。

背景技术

免疫学检测技术是应用免疫学原理设计的测定抗原、抗体、免疫细胞及化学成分等的实验手段，广泛用于来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。常用的有免疫浊度技术、固相酶免疫测定技术、化学发光检测技术、免疫荧光标记技术、流式细胞术、胶体金技术等。

免疫浊度技术，也称免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位，用于定量检测，但检测灵敏度低，不适合于微量检测。固相酶免疫测定技术基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学活性，抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，具有灵敏度高、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点。但检测反应时间长限制了其使用。免疫化学发光检测技术是一种高灵敏的微量及痕量分析技术，具有操作方便、灵敏度高、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点，广泛地应用于环境、临床、药物分析、食品和工业分析中，也是基于抗原或抗体的固相分离手段及抗原或抗体的发光试剂标记技术。但检测反应时间长及对检测设备的要求高也影响其使用。免疫荧光标记技术、流式细胞术、胶体金技术也是常用的检测技术被广泛使用，但均有其相应的不足。

高灵敏度、快速、小型化、全定量、自动化是目前临床免疫检测技术产品的发展趋势，但现有的都无法同时实现上述功能。因此，开发一种能够实现既具有高灵敏度、全定量、自动化特点，同时又具有检测快速、设备可做到小型便携特点的新的检测技术，不仅使用方便、减少浪费，同时也可显著提高工作效率，在检测和分析、分离的诸多领域具有重要的实用意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用过滤器进行信号放大免疫定量检测的方法。

在本发明所提供的利用过滤器进行信号放大免疫检测的方法中，所述过滤器由入口、过滤层和出口组成，所述过滤层内的过滤芯为偶联了待检物的特异性结合物的固相材料；

所述方法，具体可为如下(A)-(D)中任一种：

(A)包括如下步骤：

1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待检物被所述过滤芯特异性捕获，形成“过滤芯-待检物”复合物，记为复合物1；

2)将溶液B注入所述过滤器中，所述溶液B为经亲和素标记的检测物的溶液，所述经亲和素标记的检测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述经亲和素标记的检测物与被所述过滤芯特异性捕获的所述待检物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-经亲和素标记的检测物”复合物，记为复合物2；

3)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所述指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所述复合物2中的所述经亲和素标记的检测物相结合，形成“过滤芯-待检物-经亲和素标记的检测物-经生物素标记的指示剂”复合物，记为复合物3；

4)检测，按照如下(a)-(c)中任一进行：

(a)直接采用检测器对捕获了所述待检物、所述检测物和所述指示剂的过滤芯进行检测，通过所述指示剂产生的颜色或光量变化计算所述待检物的含量；

(b)用洗脱液对所述过滤器进行洗脱，收集含有所述指示剂的洗脱液，用检测器检测所述洗脱液中所述指示剂的颜色或光量变化，进而计算所述待检物的含量；

(c)直接用检测器检测从所述过滤器流出的溶液C中所述指示剂的颜色或光量变化，进而计算所述待检物的含量；

(B)包括如下步骤：

1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待检物被所述过滤芯特异性捕获，形成“过滤芯-待检物”复合物，记为复合物1；

2)将溶液D注入所述过滤器中，所述溶液D为非标记检测物的溶液，所述非标记检测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述非标记检测物与被所述过滤芯特异性捕获的所述待检物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物”复合物，记为复合物4；

3)将溶液E注入所述过滤器中，所述溶液E为经亲和素标记的检测物的溶液，所述经亲和素标记的检测物为能够与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合的物质，所述经亲和素标记的检测物与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物-经亲和素标记的检测物”复合物，记为复合物5；

4)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所述指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所述复合物5中的所述经亲和素标记的检测物相结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物-经亲和素标记的检测物-经生物素标记的指示剂”复合物，记为复合物6；

5)检测，同所述(A)中的4)。

(C)包括如下步骤：

1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待检物被所述过滤芯特异性捕获，形成“过滤芯-待检物”复合物，记为复合物1；

2)将溶液F注入所述过滤器中，所述溶液F为经生物素标记的检测物的溶液，所述经生物素标记的检测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述经生物素标记的检测物与被所述过滤芯特异性捕获的所述待检物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-经生物素标记的检测物”复合物，记为复合物7；

3)将溶液G注入所述过滤器中，所述溶液G为亲和素的溶液，所述亲和素与所述复合物7中的所述经生物素标记的检测物相结合，形成“过滤芯-待检物-经生物素标记的检测物-亲和素”复合物，记为复合物8；

4)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所述指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所述复合物8中的所述亲和素相结合，形成“过滤芯-待检物-经生物素标记的检测物-亲和素-经生物素标记的指示剂”复合物，记为复合物9；

5)检测，同所述(A)中的4)。

(D)包括如下步骤：

1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待检物被所述过滤芯特异性捕获，形成“过滤芯-待检物”复合物，记为复合物1；

2)将溶液D注入所述过滤器中，所述溶液D为非标记检测物的溶液，所述非标记检测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述非标记检测物与被所述过滤芯特异性捕获的所述待检物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物”复合物，记为复合物4；

3)将溶液H注入所述过滤器中，所述溶液H为经生物素标记的检测物的溶液，所述经生物素标记的检测物为能够与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合的物质，所述经生物素标记的检测物与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物-经生物素标记的检测物”复合物，记为复合物10；

4)将溶液G注入所述过滤器中，所述溶液G为亲和素的溶液，所述亲和素与所述复合物10中的所述经生物素标记的检测物相结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物-经生物素标记的检测物-亲和素”复合物，记为复合物11；

5)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所述指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所述复合物11中的所述亲和素相结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物-经生物素标记的检测物-亲和素-经生物素标记的指示剂”复合物，记为复合物12；

6)检测，，同所述(A)中的4)。

其中，所述待检样本具体可为如下中任一种：来源于人体或动物体可进行疾病诊断或健康检测的样品，以及用于环境、药物分析、食品、工业分析的样品。来源于人体的样本检测为临床检测的主要内容，用于各种疾病的诊断、辅助诊断、预测、病情监测等。来源于动物体的样本检测也为临床检测的主要内容，用于动物相关各种疾病的诊断、辅助诊断、预测、病情监测以及食品安全检测等。

所述指示剂常为酶类物质、可直接或间接发出光的物质、可产生荧光的物质、自身带有颜色的物质等。酶类物质常用的有碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化酶(HRP)、葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。可直接或间接发光的物质常用的有鲁米诺及其衍生物、光泽精、洛粉碱、过氧化草酸酯类、吖啶酯类等。可产生荧光的物质有异硫氰酸荧光素(FITC)或罗达明(RB200)等、自身带有颜色的物质如胶体金类等。

在所述方法中，所述待检物为具有免疫活性的蛋白质或能够与蛋白质偶联产生免疫活性的物质(具有抗原特性的物质)，包括但不限于肿瘤标志物、心血管疾病标志物、神经损伤标志物、肾损伤标志物、肝损伤标志物、优生优育检测标志物、感染性疾病检测标志物、毒品检测标志物、免疫系统疾病检测标志物中的一种或多种。相应的，所述检测物可为直接或间接与所述待检物形成特异性结合的物质，如可直接与所述待检物(抗原)形成特异性配对结合的单克隆或多克隆抗体，或者是与所述待检物(抗原)形成特异性配对结合的单克隆或多克隆抗体形成特异性结合的第二抗体(抗抗体)。

所述的肿瘤标志物包括但不限于甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原15-3(CA15-3)、糖类抗原19-9(CA19-9)、癌抗原50(CA50)、糖类抗原242(CA242)、胃癌相关抗原(CA72-4)、铁蛋白(SF)、前列腺特异抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、b2微球蛋白(b2-m)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白19(Cyfra21-1)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、核基质蛋白22(NMP-22)、a-L-岩藻糖苷酶(AFU)、人附睾分泌蛋白4(HE4)。

所述的心血管疾病标志物包括但不限于心血管标志物肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、心源性脂肪酸结合蛋白、脑钠肽、同型半胱氨酸、C反应蛋白、D-二聚体、糖化血红蛋白、载脂蛋白A1、载脂蛋白B。

所述的神经损伤标志物包括但不限于神经节苷脂(GM1)抗体、P2蛋白及抗体、乙酰胆碱受体抗体、髓鞘碱性蛋白、副肿瘤抗体、

所述的肾损伤标志物包括但不限于肾上腺抗体，肾小球基底膜，肾小球基底膜抗体。

所述的肝损伤标志物包括但不限于纤维连接蛋白，透明质酸，胶原，基质金属蛋白酶抑制因子，基质金属蛋白酶，层粘蛋白

所述的优生优育检测标志物包括但不限于新生儿TSH、抗子宫内膜抗体，抗心磷脂抗体，抗透明带抗体，抗卵细胞透明带抗体，抗卵巢抗体，抗精子抗体，巨细胞病毒，弓形体，风疹病毒，单纯疱疹病毒，促卵泡素，促黄体生成素，HCG。

所述的感染性疾病检测标志物包括但不限于梅毒、艾滋病、囊虫病、隐球菌、结核、弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、病毒性肝炎、鼠疫、霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒、淋病、脊髓灰质炎、白喉、百日咳、流行性脑脊髓膜炎、猩红热、肾综合征出血热、钩端螺旋体、布鲁杆菌病、炭疽、流行性和地方性斑疹伤寒、流行性乙型脑炎、黑热病、疟疾、登革热、肺结核、新生儿破伤风、血吸虫病、绦虫病、包虫病、麻风病、流行性感冒、流行性腮腺炎、风疹、急性出血性结膜炎、狂犬病、幽门螺杆菌，乙脑，衣原体，性病，腺病毒，微小病毒，水痘-带状疱疹病毒，生殖支原体，沙眼，腮腺炎，人型支原体，麻疹，轮状病毒，流行性出血热，淋球菌，莱姆病，柯萨奇，抗解尿支原体，军团菌，尖锐湿疣，脊髓灰质炎，呼吸道合胞病毒，肝吸虫，副流感，肺炎，带状疱疹，传染性单核细胞增多症，艾柯病毒，EB病毒，A族链球菌。

所述的毒品检测标志物包括但不限于吗啡、海咯因、麻黄、大麻、可卡因。

所述的免疫和内分泌系统疾病检测标志物包括但不限于抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体、抗可提取性核抗原抗体(抗ENA)、抗心磷脂抗体(ACA)、抗线粒体抗体(AMA)、抗甲状腺球蛋白抗体(TG-Ab)、抗甲状腺微粒体抗体(抗TM)、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)、M-蛋白、甲状腺，胰腺，生长激素，生长抑素，内皮素，骨钙素，催乳素，促卵泡素、类风湿因子，循环免疫复合物，抗胰岛细胞抗体，胰蛋白酶原，肌内膜抗体，角蛋白抗体，抗聚角蛋白微丝蛋白抗体，抗链O,抗卵巢抗体，抗平滑肌抗体，抗心肌抗体，抗组蛋白抗体，粒细胞弹性蛋白酶，皮肤抗体，肾上腺抗体，肾小球基底膜，肾小球基底膜抗体，髓过氧化物酶，条纹肌抗体，网硬蛋白抗体，胃壁细胞抗体，胃蛋白酶，细菌性渗透性增强因子、T淋巴细胞亚群，自然杀伤细胞，血清免疫抑制性蛋白、β-2微球蛋白、铁蛋白、转铁蛋白。

在所述方法中，所述检测器为能够定量检测并记录颜色或光量变化的仪器，具体可为如下中任一种：酶联免疫检测器、化学发光检测器、荧光检测器和分光光度计。

在所述方法中，作为所述过滤芯的固相材料为颗粒状或筛孔状的水不溶性物质。所述固相颗粒状物质或筛孔状物质为多种能够与抗原或抗体偶联结合并且对所述抗原或抗体的免疫学结合特性不产生明显改变的固态物质，如常用的凝胶颗粒、乳胶颗粒、磁微粒等；所述凝胶颗粒有葡聚糖凝胶系列的凝胶过滤填料和琼脂糖凝胶系列的凝胶过滤填料，常用的有溴化氰活化琼脂糖凝胶介质、NHS活化琼脂糖凝胶介质等。

在本发明中，所述过滤芯的体积可为2立方毫米至1立方厘米，如3立方毫米至0.3立方厘米，进一步如5立方毫米至0.1立方厘米。在本发明一个实施例中，所述过滤芯的体积具体为50立方毫米。在另一个实施例中过滤芯体积具体为1、2、3、5、10、50、100、300、500、700、1000立方毫米。

所述过滤芯可为长大于宽的形状，其长宽比值为2-100，如2-50，进一步如2-30，可以是圆柱状、圆锥状、方形、长方形及其组合形状等。当然，所述过滤芯也可为宽大于长的形状，其宽长比值为1.1-10，如1.1-5，进一步如1.1-3，可以是圆柱状、圆锥状、方形、长方形及其组合形状等。

在本发明的一个实施例中，所述过滤芯为长柱状，其长宽比值(圆柱的高和底面直径的比值)为20:1.8；在本发明的另一个实施例中，所述过滤芯为长柱状，其长宽比值(圆柱的高和底面直径的比值)为10:3.6；所述过滤芯为扁柱状，其宽长比值(圆柱的底面直径和高的比值)为6.0:3.5。

在所述方法中，完成检测步骤之前的每一个步骤后还包括清洗所述过滤器的步骤。

在所述方法中，将各溶液注入到所述过滤器中的方式可为单次上样、循环上样或多次重复上样。

在本发明中，所述亲和素为具有亲和素结合特性的物质，包括但不限于卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素或类亲合素。在实际应用中，卵白亲和素常简称为亲和素，其中卵白亲合素、链亲合素最为常用。实施例中所述的亲和素即为卵白亲和素。

在上述方法中，将各溶液注入所述过滤器，进行过滤时的流速为0.05-1.0mL/分钟(如0.1-0.5mL/分钟)；如0.1-0.3mL/分钟(如1.0mL/分钟)。

在本发明的实施例中，所述待检物具体为人纤维蛋白原、人肌红蛋白、人肌钙蛋白I、人CK-MB、人癌胚抗原、人甲胎蛋白或人N-端脑利钠肽前体。

所述方法为非疾病诊断治疗方法(不用于疾病的直接诊断与治疗)。

所述方法在制备用于疾病诊断和/或优生优育检测和/或毒品检测的产品中的应用也属于本发明的保护范围。所述疾病包括但不限于肿瘤、心血管疾病、神经损伤、肾损伤、肝损伤、感染性疾病或免疫系统疾病。

本发明所提供的利用过滤器进行信号放大免疫检测的方法，其反应顺序是亲和素-生物素放大，而不是常规的生物素-亲和素放大。实验证明，在本反应系统中，本发明亲和素-生物素放大这一反应顺序，与常规的生物素-亲和素放大反应顺序相比，具有更强的生物信号放大效果。本发明所提供的方法可用于检测包括来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品定量免疫检测的产品开发中的应用。

附图说明

图1为长柱状过滤器的过滤检测装置的基本结构示意图。

图2为扁柱状过滤器的过滤检测装置的基本结构示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如图1、图2所示，本发明所涉及的过滤检测装置主要包括待检样本储存器2、检测相储存器3、检测器4，以及长柱状过滤器1或扁柱状过滤器10。长柱状过滤器1或扁柱状过滤器10均具体由入口5、过滤层6和出口7组成，其中过滤层6内的过滤芯是经待检物的特异性结合物(如抗原或抗体)偶联标记过的固相材料。待检样本储存器2和所述检测相储存器3分别通过管道8和管道9与长柱状过滤器1或扁柱状过滤器10的入口5相连通。

长柱状过滤器1或扁柱状过滤器10为检测反应的反应载体，主要反应过程在长柱状过滤器1或扁柱状过滤器10上进行。作为所述过滤芯的固相材料可以是堆积的固相颗粒状物质，形成了颗粒与颗粒之间的腔隙性过滤孔径，也可以是筛孔状的固相物质。

待检样本储存器2，用于装载包括来源于人体或动物体可进行疾病诊断或健康检测的样品，以及用于环境、药物分析、食品、工业分析的样品溶液(含有待检物)。

检测相储存器3，用于装载检测相关物质溶液，如检测物(如经亲和素标记的抗体)溶液和经生物素标记的指示剂溶液。

检测器4为能够定量检测并记录颜色或光量变化的仪器，常用的有酶联免疫检测器、化学发光检测器、荧光检测器和分光光度计等。

实施例1、过滤器的制备

1、实验材料

长柱状微型过滤器外壳(高25mm，直径5mm)、NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人纤维蛋白原多克隆抗体(Genagates公司，其产品目录号为GP1032)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺。

2、实验方法

取5mg抗人纤维蛋白原多克隆抗体加浓度为0.2M的碳酸氢钠水溶液(pH8.3)2ml溶解。取1mlNHS活化琼脂糖凝胶颗粒，用1mM盐酸20ml，分三次抽滤清洗，去除全部盐酸溶液。将抗人纤维蛋白原多克隆抗体溶液与处理后的NHS活化琼脂糖凝胶颗粒按照体积比1：1的比例混合，4℃，震荡反应4小时。用纯水清洗反应后的NHS活化琼脂糖凝胶颗粒，然后加入含有10mM乙醇胺和0.2M碳酸钠的溶液，pH8.0，室温(25℃)震荡4小时封闭未偶联的基团，用50mM的磷酸缓冲液清洗干净，用制备后的NHS活化琼脂糖凝胶颗粒制作过滤芯，装入长柱状微型过滤器外壳内，封闭，备用。所得过滤芯为长柱状(其长宽比值为20:1.8，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)，其体积为50立方毫米。

实施例2、本发明与现行化学发光检测技术的检测性能的比较：

一、实验材料

实施例1制备的抗人纤维蛋白原多克隆抗体过滤器、辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体(Genagates公司，其产品目录号为GL1101)、磁微粒(MP-COOH-20020，郑州英诺生物科技有限公司)、鲁米诺、对碘苯酚、过氧化脲、化学发光检测仪(Promega,GlomaxMultiJRDetectionSystem)、人纤维蛋白原(Sigma-Aldrich产品，产品目录号为F3879-1G)。

二、实验方法

人纤维蛋白原溶液的配制：取已知浓度的人纤维蛋白原溶液，用PBS溶液稀释配置1μg/ml人纤维蛋白原溶液。

磁微粒的标记：采用常规标记方法，用1mg/ml抗人纤维蛋白原多克隆抗体对磁微粒进行标记，抗人纤维蛋白原多克隆抗体和磁微粒的用量比(w/w)为3:1。

发光底物工作液的配制：用鲁米诺、对碘苯酚、过氧化脲等配制发光底物工作液。发光底物工作液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.36mM鲁米诺、0.35mM对碘苯酚、4.5mM过氧化脲。以上各浓度均为相应组分在溶液中的终浓度。

实验采用现行化学发光检测技术观测不同结合反应时间对发光量的影响，观察结合反应时间点为1、2、4、10、20、30、45、60分钟。找到最大结合反应时间点，然后与本发明进行比较。

1、现行化学发光检测技术组

对应8个待测的反应时间点，取8个EP管，每管加入用抗人纤维蛋白原多克隆抗体标记的磁微粒100μl，再分别加入浓度为1μg/ml的人纤维蛋白原溶液各100μl，结合反应在37℃震摇温育1、2、4、10、20、30、45、60分钟，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入PBS200μl清洗三次，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体200μl，结合反应在37℃震摇以对应的反应时间进行温育，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入PBS200μl清洗三次，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，转移磁微粒至发光杯，置化学发光检测仪，加入100μl发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。

2、本发明组

取实施例1制作的抗人纤维蛋白原多克隆抗体过滤器，用碱性PBS缓冲液(配方：50mM磷酸氢二钠，50mM磷酸二氢钾，150mM氯化钠，pH8.0)稀释100μl浓度为1μg/ml的人纤维蛋白原溶液至1ml，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用碱性PBS缓冲液稀释100μl辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体至1ml，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用pH4.5Tris-盐酸缓冲液(配方：50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH4.5)1ml过滤洗脱，收集滤出液，取100μl至发光杯，置化学发光检测仪，加入100μl发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟，乘以10作为与上述现行化学发光检测技术组可比较的总计数结果。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.5ml/分钟，清洗和洗脱过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

实验重复三次，每次实验设置3个平行，结果取平均值。

三、实验结果

现行化学发光检测技术在1、2、4、10、20、30、45、60分钟时的发光量(mV)分别为3222、5672、7968、9810、14281、20339、19827、20513，结合反应30分钟基本达到平衡，结合反应为30分钟时的全过程操作时间为89分钟。本发明的检测结果为21320，全过程操作时间仅为13分钟。三次重复实验的具体结果如表1所示。

表1本发明与现行化学发光检测技术的检测性能的比较结果发光量(单位：mV)

实施例3、本发明与现行化学发光检测技术检测结果的比较

一、实验材料

实施例1制备的抗人纤维蛋白原多克隆抗体过滤器、辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体(Genagates公司，其产品目录号为GL1101)、抗人纤维蛋白原多克隆抗体(Genagates公司，其产品目录号为GP1032)、磁微粒(MP-COOH-20020，郑州英诺生物科技有限公司)、鲁米诺、对碘苯酚、过氧化脲、化学发光检测仪(Promega,GlomaxMultiJRDetectionSystem)、人纤维蛋白原(Sigma-Aldrich产品，产品目录号为F3879-1G)、健康人血浆(由健康自愿者捐赠)。

二、实验方法

人纤维蛋白原溶液的配制：取已知浓度的人纤维蛋白原溶液，用PBS溶液稀释配置10、30、70、100、300、700ng/ml的系列人纤维蛋白原溶液。用于制作标准曲线。

磁微粒的标记：采用常规标记方法，用1mg/ml抗人纤维蛋白原多克隆抗体对磁微粒进行标记，抗人纤维蛋白原多克隆抗体和磁微粒的用量比(w/w)为3:1。

发光底物工作液的配制：用鲁米诺、对碘苯酚、过氧化脲等配制发光底物工作液。发光底物工作液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.36mM鲁米诺、0.35mM对碘苯酚、4.5mM过氧化脲。以上各浓度均为相应组分在溶液中的终浓度。

实验采用本发明与现行化学发光检测技术检测人纤维蛋白原溶液并绘制标准曲线，然后取健康人血浆，用PBS(50mM磷酸氢二钠，50mM磷酸二氢钾，150mM氯化钠，pH7.4)进行10000倍稀释，测定健康人血浆中的纤维蛋白原，并用标准曲线计算健康人血浆中纤维蛋白原的浓度。取42个试管，分为本发明组和现行化学发光检测技术组。每个样品做3个平行管。

1、现行化学发光检测技术组

每管加入抗人纤维蛋白原多克隆抗体标记的磁微粒100μl，再分别加入人纤维蛋白原溶液或健康人血浆稀释液100μl，结合反应在37℃震摇温育30分钟，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入PBS200μl清洗三次，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体200μl，结合反应在37℃震摇温育30分钟，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入PBS200μl清洗三次，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，转移磁微粒至发光杯，置化学发光检测仪，加入100μl发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。绘制标准曲线，计算血浆中人纤维蛋白原含量。

2、本发明组

取实施例1制作的抗人纤维蛋白原多克隆抗体过滤器，用碱性PBS缓冲液(配方：50mM磷酸氢二钠，50mM磷酸二氢钾，150mM氯化钠，pH8.0)稀释100μl人纤维蛋白原溶液或健康人血浆稀释液至1ml，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用碱性PBS稀释100μl辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体至1ml，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用pH4.5Tris-盐酸缓冲液(配方：50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH4.5)1ml过滤洗脱，收集滤出液，取100μl至发光杯，置化学发光检测仪，加入100μl发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。绘制标准曲线，计算血浆中人纤维蛋白原含量。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.5ml/分钟，清洗和洗脱过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

实验重复三次，结果取平均值。

三、实验结果

现行化学发光检测技术测定结果显示健康人血浆中人纤维蛋白原的含量为2.51g/L，本发明测定结果显示健康人血浆中人纤维蛋白原的含量为2.58g/L，两种实验方法所得结果基本一致，无统计学差异(P>0.05)，但本发明的完成实验时间(12分钟)明显短于现行技术(83分钟)。三次重复实验的具体结果如表2所示。

表2本发明与现行化学发光检测技术检测结果的比较(单位：g/L)

	重复1	重复2	重复3	平均值
					现行化学发光检测技术	2.64	2.47	2.42	2.51
本发明	2.7	2.55	2.49	2.58

实施例4、本发明过滤芯体积对检测结果的影响

一、实验材料

长柱状微型过滤器外壳、NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人纤维蛋白原多克隆抗体(Genagates公司，其产品目录号为GP1032)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人纤维蛋白原(Sigma-Aldrich产品，产品目录号为F3879-1G)、辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体(Genagates公司，其产品目录号为GL1101)。

二、实验方法

发光底物工作液的配制：用鲁米诺、对碘苯酚、过氧化脲等配制发光底物工作液。发光底物工作液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.36mM鲁米诺、0.35mM对碘苯酚、4.5mM过氧化脲。以上各浓度均为相应组分在溶液中的终浓度。

系列抗人纤维蛋白原多克隆抗体过滤器的制备：采用实施例1的方法制备过滤芯体积为1、2、3、5、10、50、100、300、500、700、1000立方毫米的抗人纤维蛋白原多克隆抗体过滤器。这些过滤器中过滤芯均为长柱状形，1、2、3、5立方毫米的过滤器采用内径为1mm的硬质塑料管，10立方毫米的过滤器采用内径为2mm的硬质塑料管，50、100立方毫米的过滤器采用内径为5mm的硬质塑料管，300、500、700、1000立方毫米的过滤器采用内径为10mm的硬质塑料管。

用PBS溶液(配方：50mM磷酸氢二钠，50mM磷酸二氢钾，150mM氯化钠，pH7.4)稀释配置浓度为1μg/ml的人纤维蛋白原溶液。用碱性PBS缓冲液(配方：50mM磷酸氢二钠，50mM磷酸二氢钾，150mM氯化钠，pH8.0)稀释100μl人纤维蛋白原溶液至1ml，即终浓度为0.1μg/ml。

实验分为两组，人纤维蛋白原组(A组)和空白组(B组)。人纤维蛋白原组(A组)用终浓度为0.1μg/ml人纤维蛋白原溶液1ml过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用碱性PBS稀释100μl辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体至1ml，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用pH4.5Tris-盐酸缓冲液(配方：50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH4.5)1ml过滤，收集滤出液，取100μl发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。空白组(B组)除用PBS缓冲液代替终浓度为0.1μg/ml人纤维蛋白原溶液1ml过滤外，其它同人纤维蛋白原组。以上过程中所涉及的过滤控制流速为1、2、3、5立方毫米的过滤器采用0.05ml/分钟，10立方毫米的过滤器采用0.1ml/分钟，50、100立方毫米的过滤器采用0.3ml/分钟，300、500、700、1000立方毫米的过滤器采用1.0ml/分钟(以上除清洗以外的其他步骤的过滤均应控制流速为0.05-1.0ml/分钟)。

实验重复三次，结果取平均值。

三、实验结果

所记录的过滤芯体积为1、2、3、5、10、50、100、300、500、700、1000立方毫米过滤器的净发光量(mV)(人纤维蛋白原组(A组)发光量减去空白组(B组)发光量的差值)分别为843、1597、1871、1925、1967、1983、2042、1956、1995、2035、2068，过滤芯体积为3立方毫米时基本达到平衡。三次重复实验的具体结果如表3所示。

表3本发明过滤芯体积对检测结果的影响-发光量测定(单位：mV)

实施例5、本发明与现行酶联免疫检测技术检测结果的比较

一、实验材料

抗人纤维蛋白原多克隆抗体(Genagates公司，其产品目录号为GP1032)、实施例1制备的抗人纤维蛋白原多克隆抗体过滤器、辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体(Genagates公司，其产品目录号为GL1101)、邻苯二胺、酶联免疫检测仪(Bio-Rad,Model550)、人纤维蛋白原(Sigma-Aldrich产品，产品目录号为F3879-1G)、健康人血浆(健康自愿者捐赠)。

二、实验方法

人纤维蛋白原溶液的配制：取已知浓度的人纤维蛋白原溶液，用PBS溶液配置30、70、100、300、700、1000ng/ml的系列人纤维蛋白原溶液。用于制作标准曲线。

实验采用本发明与现行酶联免疫检测技术检测人纤维蛋白原溶液并绘制标准曲线，然后取健康人血浆，用PBS进行10000倍稀释，测定健康人血浆中的纤维蛋白原，用标准曲线计算健康人血浆中纤维蛋白原的浓度。取42个试管，分为本发明组和现行酶联免疫检测技术组。每个样品做3个平行管。

1、现行酶联免疫检测技术组

采用96孔酶联板，每管加入抗人纤维蛋白原多克隆抗体100μl，4℃过夜包被，清洗三次，再分别加入人纤维蛋白原溶液或健康人血浆稀释液100μl，结合反应在37℃温育120分钟，清洗三次，加入辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体100μl，结合反应在37℃温育60分钟，清洗三次，弃上清，加入100μl显色液(配方：0.1M柠檬酸2.43ml，0.2M磷酸氢二钠2.57ml，邻苯二胺5mg，过氧化氢5μl)，避光5分钟，加入2M硫酸终止反应。置酶联免疫检测仪上读取OD490吸光值，30、70、100、300、700、1000ng/ml浓度对应OD值分别为0.198、0.245、0.256、0.458、0.895、1.256，绘制标准曲线，计算血浆中人纤维蛋白原含量。

2、本发明组

取实施例1制作的抗人纤维蛋白原多克隆抗体过滤器，用碱性PBS缓冲液稀释100μl人纤维蛋白原溶液或健康人血浆稀释液各至1ml，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用碱性PBS缓冲液稀释100μl辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体至1ml，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用pH4.5Tris-盐酸缓冲液1ml过滤洗脱，收集滤出液，各取100μl至96孔酶联板，加入100μl显色液(配方：0.1M柠檬酸2.43ml，0.2M磷酸氢二钠2.57ml，邻苯二胺5mg，过氧化氢5μl)，避光5分钟，加入2M硫酸终止反应。置酶联免疫检测仪上读取OD490吸光值，30、70、100、300、700、1000ng/ml浓度对应OD值分别为0.205、0.255、0.261、0.455、0.679、0.92，绘制标准曲线，计算血浆中人纤维蛋白原含量。除清洗和洗脱以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.5ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

实验重复三次，结果取平均值。

三、实验结果

现行酶联免疫检测技术测定结果显示健康人血浆中人纤维蛋白原的含量为2.56g/L，本发明技术测定结果显示健康人血浆中人纤维蛋白原的含量为2.50g/L，两种实验方法所得结果基本一致，无统计学差异(P>0.05)。但本发明的完成实验时间(13分钟)明显短于现行技术(85分钟)。三次重复实验的具体结果如表4所示。

表4本发明与现行酶联免疫检测技术检测结果的比较(单位：g/L)

	重复1	重复2	重复3	平均值
					现行酶联免疫检测技术	2.47	2.7	2.51	2.56
本发明	2.44	2.61	2.45	2.50

实施例6、本发明以胶体金为指示剂的检测技术检测结果分析

一、实验材料

实施例1制备的抗人纤维蛋白原多克隆抗体过滤器、抗人纤维蛋白原单克隆抗体(北京亿利高科生物工程技术研究所产品，货号BR0616)、分光光度计(上海箐华科技仪器有限公司，752紫外可见分光光度计)、人纤维蛋白原(Sigma-Aldrich产品，产品目录号为F3879-1G)、健康人血浆(健康自愿者捐赠，与实施例5中所述健康人血浆为同一样本)。

二、实验方法

人纤维蛋白原溶液的配制：取已知浓度的人纤维蛋白原溶液，用PBS溶液稀释配置100、300、700、1000、3000ng/ml的系列人纤维蛋白原溶液。用于制作标准曲线。

胶体金标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体的制备：取500ml纯净水，加热搅拌，待水沸腾时加入500μl10％氯金酸溶液，加热煮沸5分钟，加入500μl12％柠檬酸三钠溶液，保持此溶液搅拌沸腾10分钟，自然降温至室温，即胶体金溶液。取胶体金溶液体积100ml，用10％碳酸钾调pH至8.3，迅速加入抗人纤维蛋白原单克隆抗体1000μg，至10μg/ml终浓度，晃动烧杯混匀，室温放置30分钟，迅速加入10％牛血清白蛋白溶液1ml，使终浓度为1％，同时摇动烧杯，室温放置30分钟，12000rpm离心20分钟，小心吸出上清液，加入50ml磷酸盐缓冲液将沉淀悬浮，12000rpm离心20分钟，吸出上清液，将沉淀溶于10.0ml含有1％的牛血清白蛋白和3％蔗糖的磷酸缓冲液内，4℃避光保存。

实验采用本发明以胶体金为指示剂的检测技术检测人纤维蛋白原溶液并绘制标准曲线，然后取健康人血浆，用PBS进行5000倍稀释，进行测定，进而用标准曲线计算健康人血浆中纤维蛋白原的浓度。取18个试管，每个样品做3个平行管。

取实施例1制作的抗人纤维蛋白原多克隆抗体过滤器，用碱性PBS缓冲液稀释100μl人纤维蛋白原溶液或健康人血浆稀释液各至1ml，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用碱性PBS稀释100μl胶体金标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体至1ml，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用pH4.5Tris-盐酸缓冲液1ml过滤洗脱，收集滤出液，混匀，取800μl置分光光度计读取520nm波长的吸光值，绘制标准曲线，计算血浆中人纤维蛋白原含量。除清洗和洗脱以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.1ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

实验重复三次，结果取平均值。

三、实验结果

本发明以胶体金为指示剂的检测技术测定结果显示健康人血浆中人纤维蛋白原含量为2.81g/L，与其它方法(实施例5)检测结果基本一致，无统计学差异(P>0.05)。三次重复实验结果如表5所示。

表5本发明以胶体金为指示剂的检测技术检测结果分析(单位：g/L)

	重复1	重复2	重复3	平均值
					本发明(以胶体金为指示剂)	2.73	2.91	2.79	2.81

实施例7、本发明过滤器形状对检测结果的影响

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBiosystems)、辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体(Genagates公司，其产品目录号为GL1101)、抗人纤维蛋白原多克隆抗体(Genagates公司，其产品目录号为GP1032)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人纤维蛋白原(Sigma-Aldrich产品，产品目录号为F3879-1G)、酶联免疫检测仪(Bio-Rad,Model550)。

二、实验方法

采用实施例1方法制备过滤芯体积为100立方毫米的抗人纤维蛋白原多克隆抗体微型长柱状过滤器和微型扁柱状过滤器。其中，微型长柱状过滤器中过滤芯的长宽比值(圆柱的高和底面直径的比值)为10:3.6，微型扁柱状过滤器中过滤芯的宽长比值(圆柱的底面直径和高的比值)为6.0:3.5。

用PBS溶液稀释配置1μg/ml人纤维蛋白原溶液。用碱性PBS缓冲液稀释100μl人纤维蛋白原溶液至1ml，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用碱性PBS缓冲液稀释100μl辣根过氧化物酶标记抗人纤维蛋白原单克隆抗体至1ml，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤洗三次，再用pH4.5Tris-盐酸缓冲液1ml过滤洗脱，收集滤出液，各取100μl至96孔酶联板，加入100μl酶联反应显色液(配方：0.1M柠檬酸2.43ml，0.2M磷酸氢二钠2.57ml，邻苯二胺5mg，过氧化氢5μl)，避光3分钟，加入2M硫酸终止反应。置酶联免疫检测仪上读取OD490吸光值。以上过程中所涉及的过滤均控制流速为1.0ml/分钟(以上除清洗以外的其他步骤的过滤均应控制流速为0.05-1.0ml/分钟)。

实验重复三次，结果取平均值。

三、实验结果

长柱状过滤器测定吸光值为1.781，扁柱状过滤器测定吸光值为1.624，两种过滤器所得结果基本一致，无统计学差异(P>0.05)。三次重复实验具体结果如表6所示。

表6本发明过滤器形状对检测结果的影响(OD490值)

	重复1	重复2	重复3	平均值
					长柱状过滤器	1.918	1.753	1.672	1.781
扁柱状过滤器	1.494	1.765	1.613	1.624

实施例8、本发明采用HRP化学发光技术测定肌红蛋白水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBiosystems)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌红蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌红蛋白(GenagatesInc.)、HRP-羊抗小鼠IgG(平睿生物)、pico发光试剂(Thermoscientific)。

二、实验方法

采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌红蛋白多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置500ng/ml人肌红蛋白溶液。实验组用碱性PBS稀释100μl人肌红蛋白溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌红蛋白单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl辣根过氧化物酶标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入pico发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、3、5、10、15、20、25和30min后检测发光值，并记录。空白组除首次过滤用不含有人肌红蛋白的碱性PBS溶液300μl外，其余步骤与实验组相同。计算实验组和空白组的比值(倍数)。由于本实验采用待检样本中肌红蛋白浓度为临床待检样品的上限值范围，因此，实验组和空白组的比值(倍数)直接反应本技术线性检测范围的大小，一般检测该比值大于10即可获得良好的检测效果。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌红蛋白浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在40倍左右，说明本发明检测样品肌红蛋白水平的检测范围可以完全满足临床检测需要，且具有良好的重复性。具体结果如表7。

表7本发明采用HRP化学发光技术测定肌红蛋白水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	78530	1884720	24	84205	2105125	25	79502	1987550	25
3	92335	2770050	30	84757	2457953	29	88844	2665320	30
										5	100273	3910647	39	89878	3325486	37	77237	3012243	39
10	97652	4003732	41	89188	3567520	40	101429	3854302	38
										15	101327	4357061	43	94085	3857485	41	96662	3769818	39
20	88753	3638873	41	74308	3120936	42	92480	3884160	42
										25	92329	4062476	44	64572	2776596	43	86901	3649842	42
30	85326	3669018	43	79169	3325098	42	77327	3325061	43

实施例9、本发明采用HRP化学发光技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、HRP-羊抗小鼠IgG(平睿生物)、pico发光试剂(Thermoscientific)。

二、实验方法

采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置100ng/ml人肌钙蛋白I溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌钙蛋白I溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100ul抗人肌钙蛋白I单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl辣根过氧化物酶标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入pico发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、3、5、10、15、20、25和30min后检测发光值，并记录。空白组除首次过滤用不含有人肌钙蛋白I的碱性PBS溶液300μl外，其余步骤与实验组相同。计算实验组和空白组的比值(倍数)。由于本实验采用待检样本中人肌钙蛋白I浓度为临床待检样品的上限值范围，因此，实验组和空白组的比值(倍数)直接反应本技术线性检测范围的大小，一般检测该比值大于10即可获得良好的检测效果。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.4ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌钙蛋白I抗原浓度100ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在35倍左右，说明本发明检测样品人肌钙蛋白I水平的检测范围可完全满足临床检测需要，且具有良好的重复性。具体结果如表8。

表8本发明采用HRP化学发光技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	68520	1438920	21	58932	1178640	20	71235	1638405	23
3	72365	2026220	28	62718	1567950	25	82119	2135094	26
										5	83215	2579665	31	75776	2273280	30	98132	3140224	32
10	91002	3185070	35	81235	2599520	32	98657	3551652	36
										15	91287	3103758	34	85900	2920600	34	96200	3559400	37
20	88753	3195108	36	83215	2746095	33	93580	3181720	34
										25	92329	3231515	35	79288	2537216	32	94556	3309460	35
30	85326	2815758	33	79198	2692732	34	89728	2961024	33

实施例10、本发明采用HRP化学发光技术测定CK-MB水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人CK-MB单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人CK-MB多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人CK-MB(GenagatesInc.)、HRP-羊抗小鼠IgG(平睿生物)、pico发光试剂(Thermoscientific)。

二、实验方法

采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人CK-MB多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置200ng/ml人CK-MB溶液。用碱性PBS稀释100μl人CK-MB溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人CK-MB单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl辣根过氧化物酶标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入pico发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、3、5、10、15、20、25和30min后检测发光值，并记录。空白组除首次过滤用不含有人CK-MB的碱性PBS溶液300μl外，其余步骤与实验组相同。计算实验组和空白组的比值(倍数)。由于本实验采用待检样本中CK-MB浓度为临床待检样品的上限值范围，因此，实验组和空白组的比值(倍数)直接反应本技术线性检测范围的大小，一般检测该比值大于10即可获得良好的检测效果。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人CK-MB浓度200ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在25倍左右，说明本发明检测样品人CK-MB水平的检测范围可完全满足临床检测需要，且具有良好的重复性。具体结果如表9。

表9本发明采用HRP化学发光技术测定CK-MB水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	81492	1222380	15	83937	1510866	18	88973	1245622	14
3	92865	1671570	18	82475	1649500	20	87424	1398784	16
										5	92536	1850720	20	100050	2301150	23	95448	1908960	20
10	85733	1971859	23	111038	2886988	26	100638	2113398	21
										15	99510	2388240	24	101733	2543325	25	107837	2588088	24
20	95946	2206758	23	94898	2657144	28	91539	2105397	23
										25	87462	2011626	23	114515	2862875	25	121386	3034650	25
30	90573	1902033	21	100132	2503300	25	106140	2441220	23

实施例11、本发明采用HRP化学发光技术测定甲胎蛋白水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人甲胎蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人甲胎蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人甲胎蛋白(GenagatesInc.)、HRP-羊抗小鼠IgG(平睿生物)、pico发光试剂(Thermoscientific)。

二、实验方法

采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人甲胎蛋白多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置500ng/ml人甲胎蛋白溶液。用碱性PBS稀释100μl人甲胎蛋白溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人甲胎蛋白单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl辣根过氧化物酶标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入pico发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、3、5、10、15、20、25和30min后检测发光值，并记录。空白组除首次过滤用不含有人甲胎蛋白的碱性PBS溶液300μl外，其余步骤与实验组相同。计算实验组和空白组的比值(倍数)。由于本实验采用待检样本中甲胎蛋白浓度为临床待检样品的上限值范围，因此，实验组和空白组的比值(倍数)直接反应本技术线性检测范围的大小，一般检测该比值大于10即可获得良好的检测效果。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人甲胎蛋白抗原浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在40倍左右，说明本发明检测人甲胎蛋白水平的检测范围可完全满足临床检测需要，且具有良好的重复性。具体结果如表10。

表10本发明采用HRP化学发光技术测定甲胎蛋白水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	58970	1356310	23	64350	1415700	22	59750	1314500	22
3	82973	2323244	28	74575	2311825	31	68253	1911084	28
										5	90273	2979009	33	89880	2786280	31	77237	2162636	28
10	97652	4003732	41	98230	2750440	28	89210	2676300	30
										15	102035	4591575	45	98990	4454550	45	96632	3092224	32

20	103525	4244525	41	96253	3657614	38	93450	3738000	40
										25	99802	4690694	47	97554	3219282	33	89532	3133620	35
30	98563	4139646	42	93528	3179952	34	90253	3700373	41

实施例12、本发明采用HRP化学发光技术测定癌胚抗原水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人癌胚抗原单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人癌胚抗原多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人癌胚抗原(GenagatesInc.)、HRP-羊抗小鼠IgG(平睿生物)、pico发光试剂(Thermoscientific)。

二、实验方法

采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人癌胚抗原多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置200ng/ml人癌胚抗原溶液。用碱性PBS稀释100μl人癌胚抗原溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人癌胚抗原单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl辣根过氧化物酶标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入pico发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、3、5、10、15、20、25和30min后检测发光值，并记录。空白组除首次过滤用不含有人癌胚抗原的碱性PBS溶液300μl外，其余步骤与实验组相同。计算实验组和空白组的比值(倍数)。由于本实验采用待检样本中人癌胚抗原浓度为临床待检样品的上限值范围，因此，实验组和空白组的比值(倍数)直接反应本技术线性检测范围的大小，一般检测该比值大于10即可获得良好的检测效果。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人癌胚抗原浓度200ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在20倍左右，说明本发明检测人癌胚抗原水平的检测范围可完全满足临床检测需要，并且具有良好的重复性。具体结果如表11。

表11本发明采用HRP化学发光技术测定癌胚抗原水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	88523	973753	11	78563	1021319	13	69864	768504	11
3	97856	1272128	13	89702	1345530	15	78253	1095542	14
										5	102351	1637616	16	99801	1796418	18	89723	1525291	17
10	112390	2135410	19	102340	2046800	20	99305	1986100	20
										15	109861	2197220	20	98990	1781820	18	96632	2029272	21
20	103525	2174025	21	100560	1910640	19	93405	1868100	20
										25	99802	2195644	22	112458	2249160	20	99238	1885522	19
30	98653	2071713	21	99805	2095905	21	98764	1777752	18

实施例13、本发明采用AP化学发光技术测定肌红蛋白水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌红蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌红蛋白(GenagatesInc.)、AP-羊抗小鼠IgG(平睿生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌红蛋白多克隆抗体微长型柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置500ng/ml人肌红蛋白溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌红蛋白溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌红蛋白单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl的AP标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。空白组除首次过滤用不含有人肌红蛋白的碱性PBS溶液300μl外，其余步骤与实验组相同。计算实验组和空白组的比值(倍数)。由于本实验采用待检样本中肌红蛋白浓度为临床待检样品的上限值范围，因此，实验组和空白组的比值(倍数)直接反应本技术线性检测范围的大小，一般检测该比值大于10即可获得良好的检测效果。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌红蛋白抗原浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在5倍左右，说明本发明检测样品人肌红蛋白水平具体良好的重复性，但最大检测倍数偏低，影响检测准确性。具体结果如表12。

表12本发明采用AP化学发光技术测定肌红蛋白水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	126807	608674	4.8	135298	676490	5	99175	485958	4.9
2	130473	678460	5.2	141753	722940	5.1	103854	529655	5.1
										3	129453	686101	5.3	139460	725192	5.2	112465	562325	5
5	118746	605605	5.1	141233	692042	4.9	109874	560357	5.1
										10	129528	660593	5.1	134261	684731	5.1	99658	528187	5.3

实施例14、本发明采用AP化学发光技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、AP-羊抗小鼠IgG(平睿生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置100ng/ml人肌钙蛋白I溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌钙蛋白I溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌钙蛋白I单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl的AP标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。空白组除首次过滤用不含有人肌钙蛋白I的碱性PBS溶液300μl外，其余步骤与实验组相同。计算实验组和空白组的比值(倍数)。由于本实验采用待检样本中人肌钙蛋白I浓度为临床待检样品的上限值范围，因此，实验组和空白组的比值(倍数)直接反应本技术线性检测范围的大小，一般检测该比值大于10即可获得良好的检测效果。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌钙蛋白I抗原浓度100ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在4倍左右，说明本发明检测人肌钙蛋白I水平具体良好的重复性，但最大检测倍数偏低，影响检测准确性。具体结果如表13。

表13本发明采用AP化学发光技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	98701	384934	3.9	102031	428530	4.2	105608	432993	4.1
2	99808	409213	4.1	123087	541583	4.4	109876	461479	4.2
										3	100273	391065	3.9	112359	483144	4.3	110235	451964	4.1

5	97654	390616	4	109876	494442	4.5	101429	436145	4.3
										10	101342	415502	4.1	102301	450124	4.4	108921	446576	4.1

实施例15、本发明采用生物素-亲和素放大技术测定肌红蛋白水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌红蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌红蛋白(GenagatesInc.)、亲和素-AP(华蓝生物)、生物素标记羊抗鼠多克隆抗体(北京博奥森)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌红蛋白多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置500ng/ml人肌红蛋白溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌红蛋白溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌红蛋白单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl的AP标记亲和素至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。空白组除首次过滤用不含有人肌红蛋白的碱性PBS溶液300μl外，其余步骤与实验组相同。计算实验组和空白组的比值(倍数)。由于本实验采用待检样本中肌红蛋白浓度为临床待检样品的上限值范围，因此，实验组和空白组的比值(倍数)直接反应本技术线性检测范围的大小，一般检测该比值大于10即可获得良好的检测效果。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌红蛋白抗原浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在5倍左右，说明本发明检测样品人肌红蛋白水平具有良好的重复性，但最大检测倍数偏低，影响检测准确性。具体结果如表14。

表14本发明采用生物素-亲和素放大技术测定肌红蛋白水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	102358	532262	5.2	125181	701014	5.6	123576	716741	5.8
2	105896	561249	5.3	129088	748710	5.8	128790	785619	6.1
										3	98798	523629	5.3	121137	690481	5.7	130255	807581	6.2
5	99835	489192	4.9	128765	721084	5.6	128876	760368	5.9
										10	102380	511900	5	120086	708507	5.9	120133	672745	5.6

实施例16、本发明采用生物素-亲和素放大技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、亲和素-AP(华蓝生物)、生物素标记羊抗鼠多克隆抗体(北京博奥森)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置100ng/ml人肌钙蛋白I溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌钙蛋白I溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl，抗人肌钙蛋白I单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl的AP标记亲和素至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。空白组除首次过滤用不含有人肌钙蛋白I的碱性PBS溶液300μl外，其余步骤与实验组相同。计算实验组和空白组的比值(倍数)。由于本实验采用待检样本中肌钙蛋白I浓度为临床待检样品的上限值范围，因此，实验组和空白组的比值(倍数)直接反应本技术线性检测范围的大小，一般检测该比值大于10即可获得良好的检测效果。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌钙蛋白I抗原浓度100ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在6倍左右，说明本发明检测人肌钙蛋白I水平具有良好的重复性，但最大检测倍数偏低，影响检测准确性。具体结果如表15。

表15本发明采用生物素-亲和素放大技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	105532	643745	6.1	110203	727340	6.6	123168	849859	6.9
2	112101	728657	6.5	118977	809044	6.8	126786	912859	7.2
										3	109876	703206	6.4	109986	736906	6.7	126533	898384	7.1
5	113605	692991	6.1	112134	695231	6.2	119890	875197	7.3
										10	107865	668763	6.2	110255	738709	6.7	120010	828069	6.9

实施例17、本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌红蛋白水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌红蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌红蛋白(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体：取浓度为10mg/ml的亲和素100μl，加入羊抗鼠多克隆抗体500μg，补加MES溶液至300μl，冰浴10min。取0.1mg/ml的EDC溶液12μl，加入MES至600μl，混匀后缓慢加入至上述离心管。取0.1mg/ml的NHS溶液18μl，加入MES至900μl，混匀后缓慢加入至上述离心管。冰浴10min后，在震荡器上震荡3小时。取下离心管，加入600μl1MTris使之终浓度为20mM。在震荡器上震荡1小时。PBS缓冲液4℃过夜透析，所得亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体溶液的浓度为210μg/ml，-20℃冻存，备用。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌红蛋白多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置500ng/ml人肌红蛋白溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌红蛋白溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌红蛋白单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌红蛋白抗原浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在50倍左右，说明本发明检测人肌钙蛋白I水平的检测范围可完全满足临床检测需要，且具有良好的重复性。具体结果见表16。

表16本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌红蛋白水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	102102	5309304	52	112314	6289584	56	111329	6123095	55
2	103819	5710045	55	123109	7140322	58	112768	6089472	54
										3	100278	5314734	53	118756	6769092	57	110987	5882311	53
5	99876	5393304	54	110891	5877223	53	120001	6840057	57
										10	103425	5481525	53	102231	5724936	56	108971	5666492	52

实施例18、本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体：同实施例17步骤二1。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置100ng/ml人肌钙蛋白I溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌钙蛋白I溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌钙蛋白I单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌钙蛋白I浓度100ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在40倍左右，说明本发明检测人肌钙蛋白I水平的检测范围可完全满足临床检测需要，且具有良好的重复性。具体结果见表17。

表17本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	110289	4521849	41	103872	4051008	39	98902	4252786	43
2	109890	4725270	43	112319	4492760	40	99856	4193952	42
										3	112108	4820644	43	110989	4217582	38	100086	4503870	45
5	99876	4194792	42	99876	4094916	41	107685	4953510	46
										10	108961	4358440	40	98769	3654453	37	108762	4785528	44

实施例19、本发明采用亲和素-生物素放大技术测定甲胎蛋白水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人甲胎蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人甲胎蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人甲胎蛋白(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体：同实施例17步骤二1。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人甲胎蛋白多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置500ng/ml人甲胎蛋白溶液。用碱性PBS稀释100μl人甲胎蛋白溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人甲胎蛋白单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟(以上除清洗以外的其他步骤的过滤均应控制流速为0.05-1.0ml/分钟)。

三、实验结果

实验中人甲胎蛋白抗原浓度100ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在25倍左右，说明本发明检测人甲胎蛋白水平的检测范围可完全满足临床检测需要，且具有良好的重复性。具体结果见表18。

表18本发明采用亲和素-生物素放大技术测定甲胎蛋白水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	89887	2426949	27	79876	2316404	29	71235	1780875	25
2	90837	2543436	28	81235	2355815	29	75246	1956396	26
										3	91235	2372110	26	87655	2629650	30	74568	1789632	24
5	93234	2610552	28	81256	2193912	27	75321	2033667	27
										10	90861	2362386	26	80213	2245964	28	72357	1881282	26

实施例20、本发明采用亲和素-生物素放大技术测定N-端脑利钠肽前体水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人N-端脑利钠肽前体单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人N-端脑利钠肽前体多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人N-端脑利钠肽前体(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体：同实施例17步骤二1。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人N-端脑利钠肽前体多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置10ng/ml人N-端脑利钠肽前体溶液。用碱性PBS稀释100μl人N-端脑利钠肽前体溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人N-端脑利钠肽前体单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人N-端脑利钠肽前体浓度10ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在25倍左右，说明本发明检测样品人N-端脑利钠肽前体水平的检测范围可以完全满足临床检测需要，并且具有良好的重复性。具体结果见表19。

表19本发明采用亲和素-生物素放大技术测定N-端脑利钠肽前体水平的实验研究

实施例21、本发明采用亲和素标记检测物1测定人肌红蛋白水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌红蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌红蛋白(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、亲和素标记抗人肌红蛋白单克隆抗体：取浓度为10mg/ml的亲和素100μl，加入抗人肌红蛋白单克隆抗体500μg，补加MES溶液至300μl，冰浴10min。取0.1mg/ml的EDC溶液12μl，加入MES至600μl，混匀后缓慢加入至上述离心管。取0.1mg/ml的NHS溶液18μl，加入MES至900μl，混匀后缓慢加入至上述离心管。冰浴10min后，在震荡器上震荡3小时。取下离心管，加入600μl1MTris使之终浓度为20mM。在震荡器上震荡1小时。PBS缓冲液4℃过夜透析，所得亲和素标记抗人肌红蛋白单克隆抗体溶液的浓度为226μg/ml，-20℃冻存，备用。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌红蛋白多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置500ng/ml人肌红蛋白溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌红蛋白溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl亲和素标记抗人肌红蛋白单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌红蛋白浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在25倍左右，说明本发明检测人肌红蛋白水平的检测范围可完全满足临床检测需要，并具有良好的重复性。具体结果见表20。

表20本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌红蛋白水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	102102	2348346	23	112314	2583222	23	111329	2671896	24
2	103819	2491656	24	123109	2954616	24	112768	2931968	26
										3	100278	2506950	25	118756	2850144	24	110987	2663688	24
5	109876	2637024	24	110891	2883166	26	120001	3000025	25
										10	103425	2585625	25	102231	2555775	25	108971	2833246	26

实施例22、本发明采用亲和素标记检测物1测定人肌钙蛋白I水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、亲和素标记抗人肌钙蛋白I单克隆抗体：同“实施例21实验方法1”、取浓度为10mg/ml的亲和素100μl，加入抗人肌钙蛋白I单克隆抗体500μg，其它同上，所得亲和素标记抗人肌钙蛋白I单克隆抗体溶液的浓度为192μg/ml，-20℃冻存，备用：。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置100ng/ml人肌钙蛋白I溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌钙蛋白I溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl亲和素标记抗人肌钙蛋白I单克隆抗体溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌钙蛋白I浓度100ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在23倍左右，说明本发明检测人肌钙蛋白I水平的检测范围可完全满足临床检测需要，并具有良好的重复性。具体结果见表21。

表21本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	110289	2316069	21	103872	2285184	22	98902	2175844	22
2	109890	2527470	23	112319	2695656	24	99856	2296688	23
										3	112108	2466376	22	110989	2663736	24	100086	2201892	22
5	104876	2517024	24	99876	2297148	23	107685	2584440	24
										10	108961	2397142	22	98769	2370456	24	108762	2610288	24

实施例23、本发明采用生物素标记检测物1测定样品人肌红蛋白水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌红蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌红蛋白(GenagatesInc.)、NHS活化生物素、亲和素(sigma)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、生物素标记抗人肌红蛋白单克隆抗体：取NHS活化生物素溶液(10mg/ml)10μl，加至1ml抗人肌红蛋白单克隆抗体溶液(1mg/ml)中，混匀，室温反应1小时，加入400μl1MTris使之终浓度为20mM，PBS缓冲液4℃过夜透析，所得生物素标记抗人肌红蛋白单克隆抗体的浓度为680μg/ml，-20℃冻存，备用。。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌红蛋白多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置500ng/ml人肌红蛋白溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌红蛋白溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl生物素标记抗人肌红蛋白单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释亲和素至300μl(5μg/ml)，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌红蛋白抗原浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在22倍左右，说明本发明检测人肌红蛋白水平的检测范围可完全满足临床检测需要，并具有良好的重复性。具体结果见表22。

表22本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌红蛋白水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	108083	2053581	19	101795	2035891	20	96924	2132327	22
2	107692	2261536	21	110073	2311525	21	97859	2250754	23
										3	109865	2417048	22	108769	2392923	22	98084	2255938	23

5	110870	2328270	21	97878	2153327	22	105531	2321689	22
										10	106782	2455981	23	96794	2032666	21	106587	2451495	23

实施例24、本发明采用生物素标记检测物1测定样品人肌钙蛋白I水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、NHS活化生物素、亲和素(sigma)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、生物素标记抗人肌钙蛋白I单克隆抗体：取NHS活化生物素溶液(10mg/ml)10μl，加至1ml抗人肌钙蛋白I单克隆抗体溶液(1mg/ml)中，混匀，室温反应1小时，加入400μl1MTris使之终浓度为20mM，PBS缓冲液4℃过夜透析，所得生物素标记抗人肌钙蛋白I单克隆抗体的浓度为712μg/ml，-20℃冻存，备用。。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置100ng/ml人肌钙蛋白I溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌钙蛋白I溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl生物素标记抗人肌钙蛋白I单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释亲和素至300μl(5μg/ml)，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌钙蛋白I浓度100ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在19倍左右，说明本发明检测人肌钙蛋白I水平的检测范围可完全满足临床检测需要，并具有良好的重复性。具体结果见表23。

表23本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	117595	2116701	18	110752	1882792	17	105453	1898158	18
2	117169	2226213	19	118790	2257010	19	106470	2129409	20
										3	119430	2388600	20	118341	2130136	18	109763	2085497	19
5	106492	2129835	20	106492	2129836	20	114818	2296361	20
										10	116179	2323571	20	105311	1790295	17	115966	2087395	18

实施例25、本发明采用生物素标记检测物2测定样品肌红蛋白水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌红蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌红蛋白(GenagatesInc.)、NHS活化生物素、亲和素(sigma)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、生物素标记羊抗鼠多克隆抗体：取NHS活化生物素溶液(10mg/ml)10μl，加至1ml羊抗鼠多克隆抗体(1mg/ml)中，混匀，室温反应1小时，加入400μl1MTris使之终浓度为20mM，PBS缓冲液4℃过夜透析，所得生物素标记羊抗鼠多克隆抗体的浓度为728μg/ml，-20℃冻存，备用。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌红蛋白多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置500ng/ml人肌红蛋白溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌红蛋白溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌红蛋白单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl生物素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释亲和素至300μl(3μg/ml)，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌红蛋白浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在27倍左右，说明本发明检测样品人肌红蛋白水平的检测范围可以完全满足临床检测需要，并具有良好的重复性。具体结果见表24。

表24本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌红蛋白水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	110814	2770350	25	108537	2713436	25	102290	2659531	26
2	111310	3005387	27	116414	2910355	25	103276	2581908	25
										3	113458	2836463	25	115974	3247274	28	106470	2981163	28
5	101167	2630347	26	104362	2817772	27	111373	3007084	27
										10	110369	3090350	28	103205	2889746	28	112487	3037159	27

实施例26、本发明采用生物素标记检测物2测定样品肌钙蛋白I水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、NHS活化生物素、亲和素(sigma)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、生物素标记羊抗鼠多克隆抗体：取NHS活化生物素溶液(10mg/ml)10μl，加至1ml羊抗鼠多克隆抗体溶液(1mg/ml)中，混匀，室温反应1小时，加入400μl1MTris使之终浓度为20mM，PBS缓冲液4℃过夜透析，所得生物素标记羊抗鼠多克隆抗体的浓度为681μg/ml，-20℃冻存，备用。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置100ng/ml人肌钙蛋白I溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌钙蛋白I溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌钙蛋白I单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释10μl生物素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释亲和素至300μl(3μg/ml)，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌钙蛋白I浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在21倍左右，说明本发明检测样品人肌钙蛋白I水平的检测范围可完全满足临床检测需要，并具有良好的重复性。具体结果见表25。

表25本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	122886	2580612	21	119391	2507214	21	112518	2250372	20

2	122441	2816159	23	128055	2689168	21	113603	2385683	21
										3	124804	2496087	20	127571	2551430	20	117117	2576576	22
5	111283	2559530	23	114798	2525559	22	122510	2450217	20
										10	121406	2670945	22	113525	2497566	22	123736	2845931	23

实施例27、本发明技术测定样品肌红蛋白水平的检测线性相关性的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌红蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌红蛋白(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体：取浓度为10mg/ml的亲和素100μl，加入羊抗鼠多克隆抗体500μg，补加MES溶液至300μl，冰浴10min。取0.1mg/ml的EDC溶液12μl，加入MES至600μl，混匀后缓慢加入至上述离心管。取0.1mg/ml的NHS溶液18μl，加入MES至900μl，混匀后缓慢加入至上述离心管。冰浴10min后，在震荡器上震荡3小时。取下离心管，加入600μl1MTris使之终浓度为20mM。在震荡器上震荡1小时。PBS缓冲液4℃过夜透析，所得亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体溶液的浓度为210μg/ml，-20℃冻存，备用。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌红蛋白多克隆抗体微型长柱状过滤器。取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用碱性PBS溶液稀释配置10、70、100、700、1000ng/ml的系列人肌红蛋白溶液，每个浓度进行3次重复测定。分别取人肌红蛋白稀释溶液各300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌红蛋白单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪检测发光试剂加入2min时的发光值，并记录。然后以发光值为X，溶液浓度为Y，计算线性检测的相关系数。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌红蛋白不同浓度下，3次平行实验的检测倍数呈浓度依赖性变化，相关系数0.9915，说明本发明检测样品人肌红蛋白水平的线性检测范围可完全满足临床检测需要，并具有良好的重复性。具体结果见表26。

表26本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌红蛋白水平的实验研究

实施例28、本发明技术测定样品肌钙蛋白I水平的检测线性相关性的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体：同实施例17步骤二1。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I多克隆抗体微型长柱状过滤器。取已知浓度的人肌钙蛋白I溶液，用碱性PBS溶液稀释配置0.3、1、3、10、30、100ng/ml的系列人肌钙蛋白I溶液，每个浓度进行3次重复测定。分别取人肌钙蛋白I稀释溶液各300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌钙蛋白I单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪检测发光试剂加入2min时的发光值，并记录。然后以发光值为X，溶液浓度为Y，计算线性检测的相关系数。

三、实验结果

实验中人肌钙蛋白I不同浓度下，3次平行实验的检测倍数呈浓度依赖性变化，相关系数0.9905，说明本发明检测样品人肌钙蛋白I水平的线性检测范围可完全满足临床检测需要，并具有良好的重复性。具体结果见表27。

表27本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

实施例29、本发明采用单克隆抗体过滤器测定样品肌红蛋白水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、羊抗人肌红蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌红蛋白(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、兔抗羊多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、亲和素标记兔抗羊多克隆抗体：取浓度为10mg/ml的亲和素100μl，加入兔抗羊多克隆抗体500μg，补加MES溶液至300μl，冰浴10min。取0.1mg/ml的EDC溶液12μl，加入MES至600μl，混匀后缓慢加入至上述离心管。取0.1mg/ml的NHS溶液18μl，加入MES至900μl，混匀后缓慢加入至上述离心管。冰浴10min后，在震荡器上震荡3小时。取下离心管，加入600μl1MTris使之终浓度为20mM。在震荡器上震荡1小时。PBS缓冲液4℃过夜透析，所得亲和素标记兔抗羊多克隆抗体溶液的浓度为210μg/ml，-20℃冻存，备用。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌红蛋白单克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置500ng/ml人肌红蛋白溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌红蛋白溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl羊抗人肌红蛋白多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl亲和素标记兔抗羊多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌红蛋白抗原浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在39倍左右，说明本发明检测人肌红蛋白水平的检测范围可完全满足临床检测需要，并具有良好的重复性。具体结果见表28。

表28本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌红蛋白水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	102102	3879876	38	112314	4380246	39	111329	4007844	36
2	103819	4048941	39	123109	4924360	40	112768	4285184	38
										3	100278	4011120	40	118756	4750240	40	110987	4439480	40
5	99876	3895164	39	110891	4324749	39	120001	4800040	40
										10	103425	4137000	40	102231	4089240	40	108971	4249869	39

实施例30、本发明采用单克隆抗体过滤器测定样品肌钙蛋白I水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、羊抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、兔抗羊多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、亲和素标记兔抗羊多克隆抗体：同实施例29。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I单克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置100ng/ml人肌钙蛋白I溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌钙蛋白I溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl羊抗人肌钙蛋白I多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl亲和素标记兔抗羊多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌钙蛋白I抗原浓度100ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在37倍左右，说明本发明检测人肌钙蛋白I水平的检测范围可完全满足临床检测需要，并具有良好的重复性。具体结果见表29。

表29本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	111189	3891617	35	122309	4403158	36	121237	4364542	36
2	113058	4070120	36	134065	4960430	37	122804	4543761	37
										3	109202	4149704	38	129325	4785035	37	120864	4471999	37
5	108764	4133068	38	120760	4588891	38	130681	4965881	38
										10	112629	4167303	37	111329	4119193	37	118669	4509437	38

实施例31、本发明采用循环上样和重复上样对检测结果影响的比较实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体：同实施例17步骤二1。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。上样选择控制流速为0.3ml/分钟的单次上样(1分钟)、循环上样3分钟、重复上样3次三个条件。清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。实验开始时先用PBS溶液稀释配置100ng/ml人肌钙蛋白I溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌钙蛋白I溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌钙蛋白I单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别检测加入发光试剂2min时的发光值，并记录。

三、实验结果

实验中人肌钙蛋白I抗原浓度100ng/ml，采用单次、循环、重复三个上样条件，平均检测倍数分别为39.3、46.7、46，明本发明检测人肌钙蛋白I水平采用循环、重复上样方式优于单次上样的检测效果，并具有良好的重复性。具体结果见表30。

表30本发明采用亲和素-生物素放大技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

上样方式	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										单次	122307	4647666	38	134540	5516140	41	145484	5673876	39
循环	124364	5596380	45	147472	7078656	48	147365	6926155	47
										三次	120123	5525658	46	142257	6686079	47	130213	5859585	45

实施例32、本发明采用链亲和素测定样品肌钙蛋白I水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、链亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、生物素标记AP(上海宝曼生物)、APLS发光试剂(郑州英诺生物)。

二、实验方法

1、链亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体：取浓度为15mg/ml的链亲和素100μl，加入羊抗鼠多克隆抗体500μg，补加MES溶液至300μl，冰浴10min。取0.1mg/ml的EDC溶液12μl，加入MES至600μl，混匀后缓慢加入至上述离心管。取0.1mg/ml的NHS溶液18μl，加入MES至900μl，混匀后缓慢加入至上述离心管。冰浴10min后，在震荡器上震荡3小时。取下离心管，加入600μl1MTris使之终浓度为20mM。在震荡器上震荡1小时。PBS缓冲液4℃过夜透析，所得链亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体溶液的浓度为253μg/ml，-20℃冻存，备用。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置100ng/ml人肌钙蛋白I溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌钙蛋白I溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌钙蛋白I单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl链亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记AP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入APLS发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、2、3、5和10min时检测发光值，并记录。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌钙蛋白I抗原浓度100ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在38倍左右，说明本发明检测人肌钙蛋白I水平的检测范围可完全满足临床检测需要，并具有良好的重复性。具体结果见表31。

表31本发明采用链亲和素-生物素放大技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	118963	4282668	36	118930	4519340	38	112398	4158726	37
2	123980	4711240	38	120975	4718025	39	116403	4539717	39
										3	112987	4293506	38	120664	4826560	40	119330	4773200	40
5	120097	4443589	37	116840	4556760	39	112921	4516840	40
										10	115670	4511130	39	123008	4920320	40	111890	4363710	39

实施例33、本发明采用亲和素-生物素放大技术以HRP为指示剂测定肌红蛋白水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBiosystems)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌红蛋白多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌红蛋白(GenagatesInc.)、、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、HRP-生物素(寰宇科创生物)、pico发光试剂(Thermoscientific)。

二、实验方法

1、亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体：同实施例17步骤二1。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌红蛋白多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置500ng/ml人肌红蛋白溶液。实验组用碱性PBS稀释100μl人肌红蛋白溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌红蛋白单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记HRP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，加入pico发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、3、5、10、15、20、25和30min后检测发光值，并记录。空白组除首次过滤用不含有人肌红蛋白的碱性PBS溶液300μl外，其余步骤与实验组相同。计算实验组和空白组的比值(倍数)。为了检测本发明技术在HRP发光系统中的信号放大效应，本实验采用与实施例8相同的实验方法，加入亲和素-生物素反应系统，与实施例8的实验结果进行比较。观察本发明的信号放大作用。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.3ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌红蛋白浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在81倍左右，较实施例8的实验结果的放大倍数提高了近40倍，说明本发明检测技术可产生明显的信号放大效果。具体结果如表32。

表32本发明采用HRP化学发光技术测定肌红蛋白水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	87652	3769036	43	91234	3558126	39	86943	3564663	41
3	88347	4859085	55	95342	5339152	56	88796	5150168	58
										5	92135	6357315	69	102876	6686940	65	97233	6806310	70
10	100233	7918407	79	112102	8631854	77	103269	8364789	81
										15	103168	8356608	81	113212	9056960	80	108962	8607998	79
20	98990	8216170	83	110678	8964918	81	106431	8833773	83
										25	102015	8161200	80	118765	9501200	80	102209	8687765	85
30	108827	8923814	82	119087	9407873	79	103294	8470108	82

实施例34、本发明采用亲和素-生物素放大技术以HRP为指示剂测定肌钙蛋白I水平的实验研究

一、实验材料

NHS活化琼脂糖凝胶颗粒(ACROBIOSYSTEMS)、抗人肌钙蛋白I单克隆抗体(GenagatesInc.)、抗人肌钙蛋白I多克隆抗体(GenagatesInc.)、碳酸氢钠、盐酸、乙醇胺、人肌钙蛋白I(GenagatesInc.)、亲和素(sigma)、EDC(Thermoscientific)、NHS(Thermoscientific)、MES(上海生工)、羊抗鼠多克隆抗体(GenagatesInc.)、HRP-生物素(寰宇科创生物)、pico发光试剂(Thermoscientific)。

二、实验方法

1、亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体：同实施例17步骤二1。

2、检测实验：采用实施例1方法制备体积为50立方毫米(长宽比值，即圆柱的高和底面直径的比值为20:1.8)的抗人肌钙蛋白I多克隆抗体微型长柱状过滤器，分为空白组和实验组，每组进行3次重复测定。用PBS溶液稀释配置100ng/ml人肌钙蛋白I溶液。用碱性PBS稀释100μl人肌钙蛋白I溶液至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，再用碱性PBS稀释100μl抗人肌钙蛋白I单克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl亲和素标记羊抗鼠多克隆抗体至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，用碱性PBS稀释10μl生物素标记HRP至300μl，过滤，用碱性PBS缓冲液1ml过滤清洗，收集滤芯，，加入pico发光试剂200μl，用化学发光仪分别于1、3、5、10、15、20、25和30min后检测发光值，并记录。空白组除首次过滤用不含有人肌钙蛋白I的碱性PBS溶液300μl外，其余步骤与实验组相同。计算实验组和空白组的比值(倍数)。为了检测本发明技术在HRP发光系统中的信号放大效应，本实验采用与实施例9相同的实验方法，加入亲和素-生物素反应系统，与实施例9的实验结果进行比较。观察本发明的信号放大作用。除清洗以外，以上过程中所涉及的过滤均控制流速为0.4ml/分钟，清洗过滤均控制流速为1.0ml/分钟。

三、实验结果

实验中人肌红蛋白浓度500ng/ml，3次平行实验最大检测倍数均在58倍左右，较实施例9的实验结果的放大倍数提高了20多倍，说明本发明检测技术可产生明显的信号放大效果。具体结果如表33。

表33本发明采用HRP化学发光技术测定肌钙蛋白I水平的实验研究

时间/min	空白组1	实验组1	倍数	空白组2	实验组2	倍数	空白组3	实验组3	倍数
										1	102311	3580885	35	99872	3795136	38	89631	2868192	32
3	130891	5497422	42	112301	5502749	49	112087	4819741	43
										5	141239	7485667	53	123895	6814225	55	126756	6464556	51
10	152037	8818146	58	132103	8190386	62	136502	7780614	57
										15	150195	8410920	56	130532	7962452	61	132108	7926480	60
20	149867	8842153	59	129965	7667935	59	134568	7939512	59
										25	148231	8449167	57	128901	7991862	62	134203	8186383	61
30	150012	8550684	57	126790	7734190	61	132100	7793900	59

Claims (10)

1.一种利用过滤器进行信号放大免疫定量检测的方法，其特征在于：

所述过滤器由入口、过滤层和出口组成，所述过滤层内的过滤芯为偶联了待检物的特异性结合物的固相材料；

所述方法为如下(A)-(D)中任一种：

(A)包括如下步骤：

1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待检物被所述过滤芯特异性捕获，形成“过滤芯-待检物”复合物，记为复合物1；

2)将溶液B注入所述过滤器中，所述溶液B为经亲和素标记的检测物的溶液，所述经亲和素标记的检测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述经亲和素标记的检测物与被所述过滤芯特异性捕获的所述待检物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-经亲和素标记的检测物”复合物，记为复合物2；

3)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所述指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所述复合物2中的所述经亲和素标记的检测物相结合，形成“过滤芯-待检物-经亲和素标记的检测物-经生物素标记的指示剂”复合物，记为复合物3；

4)检测，按照如下(a)-(c)中任一进行：

(a)直接采用检测器对捕获了所述待检物、所述检测物和所述指示剂的过滤芯进行检测，通过所述指示剂产生的颜色或光量变化计算所述待检物的含量；

(b)用洗脱液对所述过滤器进行洗脱，收集含有所述指示剂的洗脱液，用检测器检测所述洗脱液中所述指示剂的颜色或光量变化，进而计算所述待检物的含量；

(c)直接用检测器检测从所述过滤器流出的溶液C中所述指示剂的颜色或光量变化，进而计算所述待检物的含量；

(B)包括如下步骤：

1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待检物被所述过滤芯特异性捕获，形成“过滤芯-待检物”复合物，记为复合物1；

2)将溶液D注入所述过滤器中，所述溶液D为非标记检测物的溶液，所述非标记检测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述非标记检测物与被所述过滤芯特异性捕获的所述待检物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物”复合物，记为复合物4；

3)将溶液E注入所述过滤器中，所述溶液E为经亲和素标记的检测物的溶液，所述经亲和素标记的检测物为能够与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合的物质，所述经亲和素标记的检测物与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物-经亲和素标记的检测物”复合物，记为复合物5；

4)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所述指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所述复合物5中的所述经亲和素标记的检测物相结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物-经亲和素标记的检测物-经生物素标记的指示剂”复合物，记为复合物6；

5)检测，按照如下(a)-(c)中任一进行：

(a)直接采用检测器对捕获了所述待检物、所述检测物和所述指示剂的过滤芯进行检测，通过所述指示剂产生的颜色或光量变化计算所述待检物的含量；

(b)用洗脱液对所述过滤器进行洗脱，收集含有所述指示剂的洗脱液，用检测器检测所述洗脱液中所述指示剂的颜色或光量变化，进而计算所述待检物的含量；

(c)直接用检测器检测从所述过滤器流出的溶液C中所述指示剂的颜色或光量变化，进而计算所述待检物的含量；

(C)包括如下步骤：

1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待检物被所述过滤芯特异性捕获，形成“过滤芯-待检物”复合物，记为复合物1；

2)将溶液F注入所述过滤器中，所述溶液F为经生物素标记的检测物的溶液，所述经生物素标记的检测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述经生物素标记的检测物与被所述过滤芯特异性捕获的所述待检物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-经生物素标记的检测物”复合物，记为复合物7；

3)将溶液G注入所述过滤器中，所述溶液G为亲和素的溶液，所述亲和素与所述复合物7中的所述经生物素标记的检测物相结合，形成“过滤芯-待检物-经生物素标记的检测物-亲和素”复合物，记为复合物8；

4)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所述指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所述复合物8中的所述亲和素相结合，形成“过滤芯-待检物-经生物素标记的检测物-亲和素-经生物素标记的指示剂”复合物，记为复合物9；

5)检测，按照如下(a)-(c)中任一进行：

(a)直接采用检测器对捕获了所述待检物、所述检测物和所述指示剂的过滤芯进行检测，通过所述指示剂产生的颜色或光量变化计算所述待检物的含量；

(b)用洗脱液对所述过滤器进行洗脱，收集含有所述指示剂的洗脱液，用检测器检测所述洗脱液中所述指示剂的颜色或光量变化，进而计算所述待检物的含量；

(c)直接用检测器检测从所述过滤器流出的溶液C中所述指示剂的颜色或光量变化，进而计算所述待检物的含量；

(D)包括如下步骤：

1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待检物被所述过滤芯特异性捕获，形成“过滤芯-待检物”复合物，记为复合物1；

2)将溶液D注入所述过滤器中，所述溶液D为非标记检测物的溶液，所述非标记检测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述非标记检测物与被所述过滤芯特异性捕获的所述待检物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物”复合物，记为复合物4；

3)将溶液H注入所述过滤器中，所述溶液H为经生物素标记的检测物的溶液，所述经生物素标记的检测物为能够与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合的物质，所述经生物素标记的检测物与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物-经生物素标记的检测物”复合物，记为复合物10；

4)将溶液G注入所述过滤器中，所述溶液G为亲和素的溶液，所述亲和素与所述复合物10中的所述经生物素标记的检测物相结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物-经生物素标记的检测物-亲和素”复合物，记为复合物11；

5)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所述指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所述复合物11中的所述亲和素相结合，形成“过滤芯-待检物-非标记检测物-经生物素标记的检测物-亲和素-经生物素标记的指示剂”复合物，记为复合物12；

6)检测，按照如下(a)-(c)中任一进行：

(a)直接采用检测器对捕获了所述待检物、所述检测物和所述指示剂的过滤芯进行检测，通过所述指示剂产生的颜色或光量变化计算所述待检物的含量；

(b)用洗脱液对所述过滤器进行洗脱，收集含有所述指示剂的洗脱液，用检测器检测所述洗脱液中所述指示剂的颜色或光量变化，进而计算所述待检物的含量；

(c)直接用检测器检测从所述过滤器流出的溶液C中所述指示剂的颜色或光量变化，进而计算所述待检物的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待检物为具有免疫活性的蛋白质或能够与蛋白质偶联产生免疫活性的物质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述检测器为能够定量检测并记录颜色或光量变化的仪器。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：作为所述过滤芯的固相材料为颗粒状或筛孔状的水不溶性物质。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述过滤芯的体积为2立方毫米至1立方厘米。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述过滤芯为长大于宽的形状，其长宽比值为2-100；或

所述过滤芯为宽大于长的形状，其宽长比值为1.1-10。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：在所述方法中，完成检测步骤之前的每一个步骤后还包括清洗所述过滤器的步骤。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：在所述方法中，将各溶液注入到所述过滤器中的方式为单次上样、循环上样或多次重复上样。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述亲和素为具有亲和素结合特性的物质；

所述具有亲和素结合特性的物质，具体为卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素或类亲合素。

10.权利要求1-9中任一所述方法在制备用于疾病诊断和/或优生优育检测和/或毒品检测的产品中的应用。