CN105823880B - 一种利用钩状效应拓展检测范围的生物芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用钩状效应拓展检测范围的生物芯片及其检测方法。该生物芯片包括至少一个靶标区,所述靶标区内固定有捕获抗体,所述捕获抗体与分析物复合,通过与分析物复合的标记抗体产生可检测的信号,用于样品中分析物的定量分析;至少一个指示区,所述指示区内固定有抗原;所述固定抗原不与分析物复合,而与未复合分析物的标记抗体复合,产生可检测的信号,用于判定是否发生了钩状效应。本发明的生物芯片操作灵活简便、节省时间、灵敏度高,极大的扩宽了生物分子的检测范围,避免假阴性结果的发生。
Description
技术领域
本发明涉及体外免疫分析技术领域,具体地涉及了一种生物芯片及其检测方法,可以显著的扩展生物分子的检测范围。
背景技术
抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内,也可以发生在体外。在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效应,体外的抗原抗体的结合主要用于抗原或抗体的检测,用于免疫学诊断。免疫分析法是利用抗原抗体特异性结合反应检测复杂样品中药物、激素、蛋白质、微生物等物质存在或者浓度的分析方法。这种分析基于抗体的特性,即它只和一种或非常有限的几种分子发生特异性结合。将生物芯片用于免疫分析,可大大改善免疫分析性能。例如,缩短反应时间,提高分析效率,节约试剂和样本,以及易于集成化,便携化,操作简便,更易实现自动化。
按反应机制的不同,免疫分析可以分为竞争法和非竞争法。非竞争法是将待测抗原与足够的标记抗体充分反应形成抗原-标记抗体复合物,产生的信号强度与抗原的量成正比。竞争法是将待测抗原与定量标记抗原(直接竞争)或者固定抗原(间接竞争)竞争结合形成定量的特异性抗体-抗原复合物,待测抗原的量越大,与抗体结合的标记抗原或者固定抗原的量越少,产生的信号强度越小,由此定量待测抗原的量。非竞争法中经典的双抗体夹心免疫反应的原理是以抗原为检测靶标,在固相载体的表面通过物理吸附或者化学键合的方式固定上捕获抗体,溶液中抗原分别与标记抗体和捕获抗体相结合,进而形成捕获抗体-抗原-标记抗体三元复合物,通过对标记抗体上标记物的检测,实现对抗原的定量检测。这种技术已经广泛应用于临床、环境、食品、海关等的检测中。当捕获抗体及标记抗体的用量和活性足以结合标本中的被测抗原时,双抗体夹心免疫检测的信号强度随待测抗原浓度增加呈现单调递增的关系;而当标本含有高浓度待测抗原,即捕获抗体及标记抗体的用量及活性相对不足,或者高浓度待测抗原引发的检测信号超出仪器的线性检测范围时,校准曲线的信号强度与待测物浓度常常会发生偏离线性,信号强度随待测抗原浓度增加呈现下降的趋势(此种现象即为钩状效应),从而使免疫检测失去准确定量高浓度待测抗原的能力。钩状效应在免疫检测中经常发生,其发生率占阳性样本30%左右,由于钩状效应会使待检样本的浓度超出检测范围却输出一个相对低值,造成假阴性结果导致误诊。一般需要对超过检测范围的样本进行稀释进行复测,然后反推计算结果,这样浪费了试剂,又比较繁琐。
为减小夹心免疫分析中钩状效应的影响,很多人做了研究工作。通过增大标记抗体用量可以适当缓解这种效应,但是当提高标记抗体用量时,响应信号强度增大往往会超出仪器的检测范围,仍然制约高值样本的检测。Neumann等人的美国专利US6,184,042-B1中提出在固相存在下培养样品,使用能与被分析物结合的抗体低聚物或者抗体片段的低聚物作为标记抗体,因为抗体低聚物能结合更多的抗原,可以减轻钩状效应影响,这本质上和提高标记抗体浓度的方式相似,当样本抗原浓度很高时并不能完全解决钩状效应的问题,且制作抗体低聚物的操作比较繁琐。中国专利CN101201353B中提到一种扩展免疫检测可测量范围的方法及试剂盒,在同一反应体系中的两种可相互区别的固相载体上(例如微球)分别通过双抗体夹心法(检测微球)和竞争法(指示微球)测定样品浓度,双抗体夹心法检测处于双抗体夹心法线性范围内(上升段)的样品浓度,免疫竞争法测定处于双抗体夹心法线性范围外(钩状效应区)的样品浓度。该法使用微球作为固相载体,并用指示微球的信号值作为判断夹心免疫反应是否会出现钩状效应的判据,该法能从一定程度上拓宽了夹心免疫的检测范围(一个数量级),但对于生物体发生疾病体内含量升至很高的生物分子比如甲胎蛋白、D-二聚体、C-反应蛋白、噬中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白等仍需进一步拓宽检测范围。使用该法测定生物分子时,因为用于指示的微球要结合双抗体夹心法反应后剩余的标记抗体,双抗夹心法和竞争法的过程是先后进行的,浪费了时间,操作不便。中国专利CN10132644B介绍了一种在钩状效应区域内具有检测能力的侧流测定装置,该装置使用两种受体材料作为结合分析物的探针,分为检测区和指示区,检测区内固定有第一受体材料,该受体材料优先与分析物结合,然后检测探针与被受体材料捕捉的分析物结合,结合后的检测探针被固定在检测区域内;指示区内固定有第二受体材料,该第二受体材料优先与未与分析物反应的检测探针结合。指示区的第二受体材料要结合检测区域与第一受体发生反应后剩余的检测探针从而起到指示作用。指示区必须位于检测区下游。这种先进行检测区反应然后进行指示区反应的方式在原理上跟专利CN101201353B是一致的。该方法节省时间,但受控于检测区和指示区物理位置,不够灵活。
因此,本领域需要提供一种操作简便、省时、能有效识别钩状效应,提高夹心免疫检测准确性并具有较宽检测范围的方法。
发明内容
本发明的目的是提供了一种检测范围宽,检测时间短,操作方便,能有效识别夹心免疫中钩状效应,并对复杂待测样品中的分析物进行定量分析的生物芯片及其检测方法。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种利用钩状效应拓展检测范围的生物芯片,包括:
至少一个靶标区,所述靶标区内固定有捕获抗体,所述捕获抗体与分析物复合,无论分析物是否与标记抗体复合,所述靶标区通过与分析物复合的标记抗体产生可检测的信号,用于样品中分析物的定量分析;
至少一个指示区,所述指示区内固定有抗原;所述固定抗原不与分析物复合,而与未复合分析物的标记抗体复合,产生可检测的信号,用于判定是否发生了钩状效应,进而帮助选择使用靶标区的标准曲线的上升段或者下降段进行分析物的定量分析。
进一步地,所述靶标区和指示区的形状可以设计为任何形状,优选地,可以为圆形、正方形或者条线。
所述靶标区可位于指示区的任意侧。例如,靶标区可以位于指示区的上游、下游或者两者并行排列,优选地,靶标区和指示区并行排列。各区域之间的距离小于5厘米,优选地,靶标区和指示区之间的距离小于5毫米,更优选地,靶标区和指示区之间的距离为5微米。
所述靶标区和指示区面积可以相同或不同,优选地,所述面积相同。
进一步地,指示区所固定的抗原可以是化学、生物工程技术合成也可以是生物源材料提纯的天然抗原,优选地,“指示区”固定抗原使用同天然抗原具有同等免疫活性的稳定抗原。
在本发明中,靶标区用于固定捕获抗体的载体材料或指示区用于固定抗原的载体材料分别为单晶硅、玻璃、聚苯乙烯、金膜、硝化纤维、氟化聚乙烯、聚阳离子树脂、亲水性聚合物薄膜、多孔材料、树脂或硝化纤维树脂等等。所述抗原和捕获抗体与固相载体之间的结合方式可以是共价键合或者物理吸附。
进一步地,用于固定捕获抗体或者固定抗原的固相载体材料表面需要化学处理,处理方法为硅化、氨基化、醛基化、巯基化、环氧化以及活性酯化,优选环氧化或氨基化。
抗原固定有时需要将抗原分子优先负载于其他蛋白分子上,如牛血清白蛋白,人血清白蛋白,动物免疫球蛋白,亲和素等,优选地,负载蛋白为牛血清白蛋白或亲和素。
在本发明的优选实施方案中,捕获抗体固定后,用含1%BSA的PBST溶液、5%的脱脂奶粉或1%的鱼皮胶封闭,更优选地用含1%的BSA的PBST溶液封闭。
进一步地,捕获抗体与标记抗体结合于分析物抗原的不同表位或相同表位;
进一步地,标记抗体与固定捕获抗体的摩尔比为10:1-1:10。
此外,本发明所使用的标记抗体可以使用各种领域已知的可检测信号进行标记。优选地,标记抗体的标记物为带荧光、放射性、化学发光或显色基团的标记物包括酶或其他催化剂等,磁珠,胶体金,胶体银;更优选地,标记抗体的标记物为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素、胶体金、磁珠;
在本发明的优选实施方案中,抗体的标记通过生物素-亲和素体系进行连接,抗体的生物素标记方法如下:取针对某待测抗原的抗体纯化后加入生物素溶液,超滤除去未反应的生物素,保存备用。将生物素化的抗体按照一定比例加入亲和素标记的酶、荧光素或者其他信号输出分子,生物素和亲和素结合后生成带有标记分子的抗体。
本发明所述的待测样品中的分析物包括抗原性物质、半抗原、抗体或这些物质的组合。包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物、药物中间体或副产物、细菌、病毒颗粒以及任何上述物质的代谢物或抗体。一些分析物的具体实例包括铁蛋白;肌酸激酶MB;地高辛;苯妥英;苯巴比妥;卡马西平;万古霉素;庆大霉素;茶碱;丙戊酸;奎尼定;促黄体生成激素;促卵泡激素;雌二醇、黄体酮;C-反应蛋白;脂笼蛋白;IgE抗体;细胞因子;维生素B2;微球蛋白;糖化血红蛋白;氢化可的松;毛地黄毒苷;N-乙酰普鲁卡因酰胺;普鲁卡因酰胺;风疹抗体,例如风疹-IgG和风疹IgM;弓形体病抗体,例如弓形体病IgG和弓形体病IgM;睾酮;水杨酸盐;对乙酰氨基酚;乙肝病毒表面抗原;乙肝核心抗原的抗体,例如抗-乙肝核心抗原IgG和IgM;人免疫缺陷病毒1和2;人T-细胞白血病病毒1和2;乙肝e抗原;乙肝e抗原的抗体;流感病毒;促甲状腺素;甲状腺素;全三碘甲状腺原氨酸;游离三碘甲状腺原氨酸;癌胚抗原;脂蛋白,胆固醇和甘油三酯;以及α-胎儿球蛋白。滥用药物和受控物质包括但不限于安非他明;甲基安非他明;巴比妥酸盐,例如异戊巴比妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥;苯二氮杂类,例如利眠宁和安定;大麻素类,例如印度大麻和大麻;可卡因;芬太尼;LSD;安眠酮;鸦片制剂,例如海洛因、吗啡、可待因、二氢吗啡酮、氢可酮、美沙酮、氧可酮、氧吗啡酮和鸦片;苯环利定;以及丙氧吩。其它可能的分析物在Everhart等人的U.S.6,436,651和Tom等人的U.S.4,366,241中有所记载。
本发明所述的“待测样品”通常是指被怀疑含有分析物的生物材料。测试样品可以来自任何生物源,例如生理流体,包括血液、组织液、唾液、眼晶状体液、脑脊髓液、汗液、尿液、乳液、腹水、粘液、鼻液、痰、滑液、腹膜液等等。除了生理流体,也可以使用其它的液体样品,例如用于实施环境或食品测定的水、食品等。优选地样品是血清样品。
本发明还提供了一种非诊断目的利用钩状效应拓展检测范围的检测方法,该方法包括:
(1)标准曲线的绘制:将一系列浓度的待测分析物标准品分别与标记抗体混合,形成混合溶液;该混合溶液流经上述生物芯片,形成一反应体系(如图1所示);反应结束后,所述靶标区和指示区分别输出信号,根据分析物标准品的浓度和信号值分别拟合出靶标区的标准曲线A和指示区的标准曲线B,确定靶标区的标准曲线A中发生钩状效应时的临界分析物浓度及对应的指示区标准曲线B中的临界信号(如图2所示);
(2)将待测样品与标记抗体混合,形成二者的混合溶液;
(3)将该混合溶液流经上述生物芯片,形成一反应体系;
(4)反应结束后,将指示区输出的信号与临界信号比对,判断是否发生钩状效应,从而使用靶标区的检测结果进行分析物定量。
其中,“靶标区”为夹心免疫反应过程,具体为:当样品中待测分析物(抗原)浓度低时,混合溶液中标记抗体和靶标区固定的捕获抗体同时跟分析物(抗原)反应,生成“捕获抗体-分析物(抗原)-标记抗体”三元复合物;当样品中待测分析物(抗原)浓度很高时,由于分析物(抗原)过剩,混合溶液中标记抗体和靶标区固定的捕获抗体跟分析物(抗原)反应,生成“捕获抗体-分析物(抗原)-标记抗体”三元复合物的同时,会有部分分析物(抗原)未跟标记抗体反应,生成“捕获抗体-分析物(抗原)”二元复合物,而这部分分析物(抗原)因未跟标记抗体结合而不能输出信号。
“指示区”发生竞争反应过程,具体为:不管待测样品中分析物(抗原)浓度如何,样品中待测分析物(抗原)与指示区的固定抗原同时跟标记抗体反应,形成“固定抗原-标记抗体”或者“待测分析物(抗原)-标记抗体”二元复合物,样品中待测分析物(抗原)浓度越高时,“待测分析物(抗原)-标记抗体”二元复合物的含量占比越高,“固定抗原-标记抗体”二元复合物的含量占比越少,输出信号就越小,同理样品中待测分析物(抗原)浓度越低时,输出信号就越大。
进一步地,步骤(4)中,当指示区信号高于所述临界信号时,钩状效应没有发生,使用靶标区的标准曲线A的上升段进行分析物定量;当指示区信号低于所述临界信号时,钩状效应发生,使用靶标区的标准曲线A的下降段进行分析物定量。
进一步地,上述方法中所述信号值随分析物浓度变化关系的标准曲线可以使用线性方程、二次函数、三次函数、单对数方程、双对数方程、四参数方程拟合,优选使用四参数方程拟合,其中分析物浓度为横坐标,信号值为纵坐标。更优选地,所述四参数方程为:y=A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p),其中参数A1为曲线的上渐近线估值,即为仪器的饱和信号;A2为曲线下渐近线估值,即为仪器的背景信号;x0为曲线拐点处对应分析物浓度,即为仪器信号达到饱和信号一半时的分析物浓度;p为曲线拐点处的斜率。
进一步地,上述方法中,步骤(1)和步骤(3)中,反应时间为10分钟,反应温度为37摄氏度。如果同时检测样品中的多种抗原,则可以通过增加相应的可以区分的“靶标区”及“指示区”即可。
如本领域技术人员所理解的,本发明所述生物芯片的设计原理及上述检测方法也适用于分析物为抗体时的定量检测。任何基于本发明设计原理得到的实施方案也属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果如下:
本发明所示的生物芯片具有检测范围宽、检测灵敏度高、检测时间短、操作简便的优点,可以有效识别钩状效应,避免假阴性结果的发生。
为了更清楚地说明本发明,下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解,下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的,不应以此限制本发明的保护范围。
附图说明
图1示出生物芯片通过添加抗原指示区利用钩状效应拓展检测范围的反应原理图;当样本抗原量较少时,标记抗体量足够反应,夹心免疫反应不会发生钩状效应,靶标区输出较小信号,而指示区信号很大;随着样本抗原含量增加,达到某一浓度时,夹心免疫反应刚好发生钩状效应,靶标区信号达到最大值,而指示区信号减小。当样本抗原含量很多时,标记抗体量相对不足,夹心免疫反应发生钩状效应,靶标区信号减小,指示区信号较刚发生钩状效应时更小,此时部分标记抗体和过剩的样本抗原结合形成标记抗体-抗原复合物游离在溶液中不会引起响应。
图2示出利用钩状效应定量分析的算法示意图;
图3示出包含实施例1所述生物芯片的测试卡构造示意图;
300生物芯片基体;310生物芯片;320固定抗体的靶标区;330固定抗原的指示区;340上样孔;350微流体通道;360废液区;370排气孔;
图4示实施例3用于检测C反应蛋白的曲线:夹心免疫反应标准曲线(A)(Alow:上升段;Ahigh:下降段),竞争反应曲线(B);标准曲线采用经典的四参数拟合(LogisticEquation),方程为:y=A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p),其中:
Alow:A1=0.143;A2=3.120;x0=0.07459;p=0.70937;r=0.99901;
Ahigh:A1=3.120;A2=0.060;x0=14.06781;p=0.6038;r=0.99910;
B:A1=1.880;A2=0.020;x0=3.44411;p=1.56939;r=0.99908。
图5示实施例5用于检测噬中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的曲线:夹心免疫反应标准曲线(A),竞争反应曲线(B);标准曲线采用经典的四参数拟合(Logistic Equation),方程为:y=A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p),其中:
Alow:A1=0.020;A2=3.600;x0=0.07459;p=0.75146;r=0.99919;
Ahigh:A1=3.600;A2=0.020;x0=3482.303;p=0.61528;r=0.99568;
B:A1=2.332;A2=0.020;x0=612.344;p=1.92628;r=0.99842。
具体实施方式
实施例1:生物芯片及包含生物芯片的测试卡的结构
参阅图3,本发明所述生物芯片310包括固定有捕获抗体的靶标区320,固定有抗原的指示区330。生物芯片的基体300具有上样孔340、微通道350、废液区360和排气孔370,所述靶标区320和指示区330并列位于微通道350内(见图3)。
所述微孔通道的宽度为10-200微米,高度为10-200微米,长度为3-5厘米。
所述微孔道的制作材料可以为硅片、金属、玻璃、陶瓷、有机聚合物如塑料、橡胶等,优选地,制作微通道的材料使用塑料。
所述微孔道的制作工艺可以为平板印刷术、化学刻蚀技术、光刻电铸注塑技术、钻石切削技术、线切割及离子束加工技术或者其他通过高温、高压、高电压加工的技术手段。
如果同时检测样品中的多种抗原,则可以通过增加相应的可以区分的“靶标区”及“指示区”即可。
上述生物芯片的基体仅是众多设计中的一种,基于本发明的原理,生物芯片基体可以做成不同的形状和构造。
实施例2:磁敏C-反应蛋白(CRP)生物芯片的制备
实验材料
CRP捕获抗体,CRP抗原分子,磁颗粒标记CRP抗体;
常规试剂为市售品
(1)生物芯片表面功能化
利用氧等离子体处理单晶硅芯片表面10分钟,之后将其浸入到含2-10%乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中并置于37摄氏度的震荡器中反应0.5-2小时,然后用无水乙醇洗涤5次,最后用氮气吹干,此时芯片的表面已经被氨基化,即制得氨基生物芯片。
(2)固定载体的连接
将氨基硅片浸泡在含有5%戊二醛的磷酸盐缓冲液中,室温反应1小时,然后用磷酸盐缓冲液清洗干净后,然后将CRP捕获抗体(50μg/mL)和CRP抗原(2μg/mL)采用微量点样仪,分别点滴到氨基芯片表面的传感器“靶标区”和“指示区”区域,置于4摄氏度过夜,然后利用5%的牛血清白蛋白溶液封闭氨基芯片,制成完全封闭的氨基生物芯片。
(3)CRP标记抗体的生物素化
离心超滤除去CRP抗体中的叠氮化钠后,按照CRP抗体(1mg/mL)与生物素琥珀酰亚胺酯(10mmol/L)摩尔比为1:50的量进行混合,4摄氏度中振荡反应2小时后,CRP抗体上偶联上生物素,离心超滤去除未反应的生物素琥珀酰亚胺酯后得到生物素化的CRP标记抗体。
(4)CRP标记抗体上添加磁颗粒标签
将上述生物素化的CRP标记抗体与亲和素化的磁颗粒按摩尔比4:1进行混合,在4摄氏度震荡反应2小时,然后使用磁力架分离纯化磁颗粒,得到磁颗粒标记的CRP抗体。
(5)生物芯片组装
将生物芯片组装于带有微流体的测试体系中,其中磁颗粒标记的CRP抗体冻干在进样孔底部,如图3所示。
实施例3:CRP检测钩状效应的判定及检测范围的确定
将CRP抗原配制成0、0.003、0.006、0.012、0.025、0.049、0.098、0.195、0.391、0.552、0.781、1.105、1.563、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、350、450μg/mL的抗原标准品系列,分别测量不同浓度的标准品,得到相应的磁信号强度(即磁致电阻率变化值),并根据抗原浓度和磁信号强度分别拟合出“靶标区”和“指示区”标准曲线A和B,标准曲线采用经典的四参数拟合(Logistic Equation),方程为:y=A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p),如图4A和4B所示,将两图拟合到一起,得到图4C。
使用夹心免疫法检测CRP,检测范围为0.003μg/mL-0.781μg/mL,当抗原浓度达到0.781μg/mL时,“靶标区”检测信号达到最大值2.662,当抗原浓度超过0.781μg/mL时,夹心免疫反应结果出现了很明显的钩状效应,信号值反而降低,造成假阴性结果。当“靶标区”输出某一低于2.662的信号时,曲线上会对应两个浓度与该信号对应。
使用竞争法检测CRP,检测范围在0.2μg/mL-50μg/mL,用此范围定量仍不能满足检测要求(CRP的阳性样本可升至200μg/mL以上)。当“靶标区”检测信号达到最大值(2.662)时,开始产生钩状效应,“指示区”信号为1.745,当“指示区”的输出信号低于该临界信号时,提示夹心免疫反应发生钩状效应,标准曲线应采用Ahigh;当“指示区”的输出信号高于该临界信号时,提示夹心免疫反应未发生钩状效应,标准曲线应采用Alow。使用这种添加抗原指示,利用钩状效应定量的方式,CRP的检测范围可以扩展到0.003μg/mL-350μg/mL。
实施例4:磁敏噬中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)生物芯片的制备,制备方法同实施例2,只不过捕获抗体及标记抗体为抗噬中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的单克隆抗体,抗原为噬中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白。
实施例5:NGAL检测钩状效应的判定及检测范围的确定
将NGAL抗原配制成0、0.5、2、10、50、100、200、500、1000、1500、2000、4000、8000、12000ng/mL的抗原标准品系列,分别测量不同浓度的标准品,得到相应的磁信号强度(即磁致电阻率变化值),并根据抗原浓度和磁信号强度分别拟合出“靶标区”和“指示区”标准曲线,标准曲线采用经典的四参数拟合(Logistic Equation),方程为:y=A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p),如图5所示。
使用夹心免疫法检测NGAL,检测范围为0.5ng/mL-200ng/mL,当抗原浓度达到200ng/mL时,“靶标区”检测信号达到最大值3.040,当抗原浓度超过200ng/mL时,夹心免疫反应结果出现了很明显的钩状效应,信号值反而降低,造成假阴性结果。当“靶标区”输出某一低于3.040的信号时,曲线上会对应两个浓度与该信号对应。
使用竞争法检测NGAL,检测范围在100ng/mL-2000ng/mL,用此范围定量不能满足检测要求(10-1500ng/mL)。当“靶标区”检测信号达到最大值(3.040)时,开始产生钩状效应,“指示区”信号为2.072,当“指示区”的输出信号低于该临界信号时,提示夹心免疫反应发生钩状效应,标准曲线应采用上升段;当“指示区”的输出信号高于该临界信号时,提示夹心免疫反应未发生钩状效应,标准曲线应采用下降段。使用这种添加抗原指示,利用钩状效应定量的方式,NGAL的检测范围可以扩展到0.5ng/mL-12000ng/mL。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定,对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无法对所有的实施方式予以穷举,凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (8)
1.一种非诊断目的利用钩状效应拓展检测范围的检测方法,其特征在于:该方法包括:
(1)组装生物芯片,所述生物芯片包括至少一个靶标区,所述靶标区内固定有捕获抗体,所述捕获抗体与分析物复合,通过与分析物复合的标记抗体产生可检测的信号,用于样品中分析物的定量分析;
至少一个指示区,所述指示区内固定有抗原;所述固定抗原不与分析物复合,而与未复合分析物的标记抗体复合,产生可检测的信号,用于判定是否发生了钩状效应;
(2)标准曲线的绘制:将一系列浓度的待测分析物标准品分别与标记抗体混合,形成混合溶液;该混合溶液流经步骤(1)所述的生物芯片,形成一反应体系;反应结束后,所述靶标区和指示区分别输出信号,根据分析物标准品的浓度和信号值分别拟合出靶标区的标准曲线A和指示区的标准曲线B,确定靶标区的标准曲线A中发生钩状效应时的临界分析物浓度及对应的指示区标准曲线B中的临界信号;
(3)将待测样品与标记抗体混合,形成二者的混合溶液;
(4)将该混合溶液流经步骤(1)所述的生物芯片,形成一反应体系;
(5)反应结束后,将指示区输出的信号与临界信号比对,判断是否发生钩状效应,从而使用靶标区的检测结果进行分析物定量。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述靶标区位于指示区的任意侧。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:靶标区用于固定捕获抗体的载体材料或指示区用于固定抗原的载体材料分别为单晶硅、玻璃、聚苯乙烯、金膜、硝化纤维、氟化聚乙烯、聚阳离子树脂、亲水性聚合物薄膜、多孔材料、树脂或硝化纤维树脂。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述标记抗体的标记物为带荧光、放射性、化学发光或显色基团的标记物。
5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述分析物为抗原性物质、半抗原或这些物质的组合。
6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤(5)中,当指示区信号高于所述临界信号时,钩状效应没有发生,使用靶标区的标准曲线A的上升段进行分析物定量;当指示区信号低于所述临界信号时,钩状效应发生,使用靶标区的标准曲线A的下降段进行分析物定量。
7.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述信号值随分析物浓度变化关系的标准曲线使用四参数方程拟合,其中分析物浓度为横坐标,信号值为纵坐标。
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于:所述四参数方程为:y = A2 + (A1-A2)/(1 + (x/x0)^p)。
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