CN107389955A - 能扩宽hcg检测范围的免疫胶体金检测装置及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能扩宽HCG检测范围的免疫胶体金检测装置及检测方法，所述检测装置中的HCG检测试纸包括含有胶体金标记HCG抗体的胶体金垫和NC膜，所述NC膜上包被有配对HCG抗体作为T线、抗鼠IgG作为C线，检测时将被检样本加入到样本孔中，然后在稀释液孔中加入70ul样品稀释液，在15‑20分钟内，用免疫层析结果判读记录仪对检测结果进行判定，所述检测装置能判断HCG免疫胶体金检测中检测样本是否存在钩状效应，又能直接对存在钩状效应的HCG样本进行直接判读检测，测试方法准确性高。

Description

能扩宽HCG检测范围的免疫胶体金检测装置及检测方法

技术领域

本发明涉及体外免疫检测技术领域，尤其是一种能扩宽HCG检测范围的免疫胶体金检测装置及检测方法。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，它是由α和β二聚体的糖蛋白组成。人绒毛膜促性腺激素(HCG)αβ，由合体滋养细胞合成。分子量为36700的糖蛋白激素。HCG的检查对早期妊娠诊断有重要意义，对与妊娠相关疾病、滋养细胞肿瘤等疾病的诊断、鉴别和病程观察等有一定价值。人绒毛膜促性腺激素在受孕后8-10天开始分泌。在妊娠最初3个月，HCG水平每(2.2±0.5)天约升高一倍，到6-8周孕期HCG浓度达到高峰，约15000～200000mIu/mL，至孕期第4个月始降至中等水平，约10000～100000mIu/mL，并一直维持到妊娠末期。葡萄胎、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌及睾丸畸胎瘤等患者尿中HCG显著升高，可达10万到百万mIU/mL，如男性尿中HCG升高，要考虑睾丸肿瘤如精原细胞癌、畸形及异位HCG瘤等。

因此，在临床上能扩宽HCG检测范围的定量检查对早期妊娠诊断有重要意义，对与妊娠相关疾病、滋养细胞肿瘤等疾病的诊断、鉴别和病程观察等有一定价值。

在免疫胶体金定量试验中，检测范围受抗体(或抗原)性质和抗体(或抗原)使用量的影响。在免疫胶体金检测中高浓度样本会产生钩状效应，对试剂的检测范围都有局限性，不能满足临床样本对试剂的需要。钩状效应即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。例如，当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

目前，市场上HCG定量检测的技术有很多，包括酶联免疫吸附法，放射性免疫法，化学发光法和免疫荧光法等，但这些检测技术都需要配备特定的仪器，对实验室和检测人员的要求也较高，检测时间过长，患者当天都不能取到检测结果，浪费人力物力，增加了检测成本，不能对病症进行及时对症治疗。

专利(CN102890157A)提供的HCG定量免疫胶体金试纸条，其定量检测范围为10-15000mIu/mL。该方法的最高检测值为15000mIu/mL，对于存在钩状效应的HCG高浓度样本可能误判，不能用于妊娠相关疾病、滋养细胞肿瘤等疾病的诊断。专利(CN101825640A)提供的一种HCG定性定量两用试纸条，其定量检测范围为100-15000mIu/mL，对于妊娠前期的翻倍无法测定，只能定性测量，要包被三条线操作繁琐，该方法的最高检测值为15000mIu/mL，对于存在钩状效应的HCG高浓度样本可能误判，不能用于妊娠相关疾病、滋养细胞肿瘤等疾病的诊断。专利(CN104991078A)提供了一种HCG胶体金免疫侧向层析试纸条及其检测方法，分别包被HCG抗原线(C)和HCG抗体检测线(T)，通过标准品的浓度值与对应T/C值做标准曲线进行HCG定量检测，其定量检测范围10-200000mIu/mL，无法满足对于HCG值可达百万mIU/mL的葡萄胎、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌及睾丸畸胎瘤等患者的诊断，可能造成误判。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种能扩宽HCG检测范围的免疫胶体金检测装置。

本发明所要解决的技术问题在于提供一种应用上述免疫胶体金检测装置的HCG检测方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，包括HCG检测试纸，所述HCG检测试纸包括含有胶体金标记HCG抗体的胶体金垫和NC膜，所述NC膜上包被有配对HCG抗体作为T线、抗鼠IgG作为C线。

优选的，上述扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，所述NC膜是一种由硝酸纤维素构成的多孔结构的膜，孔径为8-15um。

优选的，上述扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，所述NC膜是由下述方法制备得到的：以0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)将配对的HCG抗体配制成0.8-1.5mg/mL，用喷膜仪在NC膜上以1.2-1.4ul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在NC膜上包被1-2mg/ml的抗鼠IgG作为C线，干燥，即得。

优选的，上述扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，所述胶体金垫是由下述方法制备得到的：采用氯金酸－柠檬酸三钠法制备直径为40±5nm的胶体金溶液，取胶体金溶液，用0.2M K₂CO₃将溶液调到pH7.0-pH8.0，然后将胶体金缓慢搅拌，按每1ml溶液加入5ug-10ug将HCG标记抗体加入到溶液中，继续搅拌30分钟，再加入到终浓度为0.5％的PEG2000和0.5％的水解酪蛋白进行封闭，标记结束后以12000rpm离心，弃上清，沉淀按60％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(0.1MTris/HCl缓冲液，pH7.5，含0.2％水解酪蛋白，6％蔗糖，0.5％Tween 20)。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm²的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥3-5小时，制成胶体金垫。

优选的，上述扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，所述HCG检测试纸由胶体金垫、NC膜、样品垫、吸样垫和塑料底板组成，所述样品垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫从塑料底板一端依次排列至另一端。

优选的，上述扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，所述样品垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。

优选的，上述扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，所述HCG检测试纸的宽度为3-5mm，长度为7-8cm。

优选的，上述扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，包括HCG检测试纸、卡壳和免疫层析判读结果记录仪，所述卡壳包含上盖和下盖两个部分，所述卡壳下盖内部平行放置所述HCG检测试纸组成检测卡，所述卡壳上盖一侧对应HCG检测试纸的样品垫部分设置了样品孔和稀释液孔，用于加入样本和稀释液，卡壳上盖的中间部分应对试纸NC膜中部设置了视窗口，用于观察NC膜上的C、T线，并判定结果，所述免疫层析判读结果记录仪内置了是否发生钩状效应的判定方法和对应区域(未发生钩状效应区域和发生钩状效应区域)的相应标准曲线，所述检测卡与该免疫层析判读结果记录仪配合使用，用于对检测结果的定量判定，对HCG检测范围为10-1600000/mL。

优选的，上述扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，所述检测卡的装配方法如下：在相对湿度小于30％的条件下，取塑料底板，将已包被HCG的NC膜粘贴在底板的中部，在NC膜T线一侧粘贴胶体金垫，在胶体金垫另一侧粘贴样品垫；在NC膜C线一侧粘贴吸样垫；各粘贴组分接口相互叠压1-2mm，粘贴好的大板切成3-5mm宽的试纸条作为HCG检测试纸，然后将试纸条放置于卡壳下盖的槽中，然后盖上上盖，压紧，完成装配。

一种应用上述免疫胶体金检测装置的HCG检测方法，检测时将被检样本(如5μl血清、血浆或10μl全血样本)加入到样本孔中，然后在稀释液孔中加入70ul样品稀释液(PBS)，在15-20分钟内，用免疫层析结果判读记录仪对检测结果进行判定。

优选的，上述HCG检测方法，所述免疫层析结果判读记录仪的判断方法如下：分别在t0.5和t时间时使用免疫层析判读记录仪测定胶体金测试条的反应线(T线)的信号值GOD0.5和GOD值，t表示完全反应的时间，t0.5表示完全反应时信号值一半的时间，当GOD/GOD0.5>1.5时判定为未出现钩状效应，按直线回归方程对检测结果的信号值进行浓度值计算，当GOD/GOD0.5<1.5时判定为出现钩状效应，按照logistic曲线拟合四参数法方程对检测结果的信号值进行浓度值的计算。

上述免疫层析结果判读记录仪内置了是否发生钩状效应的判定方法和对应区域(未发生钩状效应区域和发生钩状效应区域)的相应标准曲线，具体判断方法如下：

(1)上述使用的免疫层析判读记录仪为本公司生产(中新科炬生物制药股份有限公司)编号为NS3001和NS7001。

(2)所述时间t和t0.5是通过如下方法确定的，取一已知低浓度的阳性样本(未发生钩状效应的样本)，使用免疫层析判读记录仪连续监测该阳性样本的胶体金测试条的反应线的信号值随时间变化，待反应线信号值不再随时间的变化而变化时，即确定出完全反应的时间t，t0.5为完全反应时信号值一半的时间。

(3)所述判定是否发生钩状效应的方法，使用免疫层析判读记录仪连续监测已知浓度的阳性样本的胶体金测试条的反应线的信号值随时间的变化发现未发生钩状效应的样本，反应线的信号值会随着时间的增加而缓慢增加，不会在短时间内达到峰值，故GOD/GOD0.5>1.5，而发生钩状效应的样本，反应线的信号值会随着时间的增加而迅速增加，会在短时间内达到峰值，故GOD/GOD0.5<1.5。

(4)上述免疫胶体金未发生钩状效应的区域和发生钩状效应的区域的标准曲线通过以下方法确定的：

(i)分别用浓度为0，10，100，500，1000，2500，5000，10000，25000，50000，100000，500000，1000000，1600000mIu/mL的HCG标准品对试剂在t和t0.5时间内进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带转化成信号值，所得出的信号值符合GOD/GOD0.5>1.5时，小于该浓度值的范围为未发生倒钩区域，所得出的信号值符合GOD/GOD0.5＜1.5时，大于该浓度值的范围为发生倒钩区域(未发生倒钩反应的最大浓度值为发生钩状效应区域的起始浓度)，判断出未发生倒钩区域和发生倒钩区域的浓度范围。

(ii)上述未发生钩状效应的区域的标准曲线是由下述方法确定的：

将已知浓度的且处于未发生倒钩的目标标准品分别进行检测时间为t的重复十次的检测，所得出的信号值的平均值即为该浓度所对应的信号值，以其为Y轴，以处于未发生倒钩的目标标准品的浓度为X轴，所得的直线回归曲线即为该区域的标准曲线。

(iii)上述发生钩状效应的区域的检测信号值的标准曲线是由下述方法确定的：

(a)将已知浓度的且处于发生倒钩的目标标准品分别进行检测时间为t的重复十次的检测，所得出的信号值的平均值即为该浓度所对应的信号值，以其为Y轴(包含未发生倒钩反应的最大浓度值所对应的信号平均值)，以目标标准品的浓度为X轴(包含未发生倒钩反应的最大浓度值，该浓度值为发生钩状效应区域的起始浓度)，用ELISA Cale回归/拟合计算程序软件的logistic曲线拟合(四参数)进行分析得到的曲线Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D即为该区域的标准曲线。

(b)上述曲线方程Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D中，A代表X趋于无穷大或者无穷小时Y的最大值，B代表斜率，C代表拐点浓度，D代表X趋于无穷大或无穷小时Y的最小值。

本发明的有益效果是：

上述能扩宽HCG检测范围的免疫胶体金检测装置，能判断HCG免疫胶体金检测中检测样本是否存在钩状效应，又能无需二次检测，直接对存在钩状效应的HCG样本进行直接判读检测，无需浪费试剂，仅一次检测便可测定HCG检测结果，使HCG定量检测范围扩宽至10-1600000mIU/mL，满足对于HCG值可达百万mIU/mL的葡萄胎、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌及睾丸畸胎瘤等患者的诊断和早期妊娠HCG水平每(2.2±0.5)天约升高一倍的定量诊断的需要；所述检测方法快速容易、准确性高。

附图说明

图1为为标准样本的HCG免疫胶体金信号值与时间的关系。

图2为HCG检测试纸的结构示意图，

图中，1-胶体金垫 2-T线 3-C线 4-NC膜 5-样品垫 6-吸样垫。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。

实施例1

装配能扩宽HCG检测范围的免疫胶体金检测装置及检测

(1)HCG抗体胶体金标记采用氯金酸－柠檬酸三钠法制备直径为40±5nm的胶体金溶液，取胶体金溶液，用0.2M K₂CO₃将溶液调到pH7.0-pH8.0，然后将胶体金缓慢搅拌，按每1ml溶液加入5ug-10ug将HCG标记抗体加入到溶液中，继续搅拌30分钟，再加入到终浓度为0.5％的PEG2000和0.5％的水解酪蛋白进行封闭，标记结束后以12000rpm离心，弃上清，沉淀按60％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(0.1MTris/HCl缓冲液，pH7.5，含0.2％水解酪蛋白，6％蔗糖，0.5％Tween 20)。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm²的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥3-5小时，制成胶体金垫。

(2)NC膜包被用0.01M pH7.4PBS将配对的HCG抗体配制成1.0mg/mL，羊抗鼠IgG稀释成1mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按1.4ul/cm进行分别划线包被，包被完成后将NC膜在在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥4小时，T线(配对的HCG抗体)和C线(抗鼠IgG)的间距为6mm。

(3)在相对湿度小于30％的条件下，取塑料底板，将已包被HCG的NC膜粘贴在底板的中部，在NC膜T线一侧粘贴胶体金垫，在胶体金垫另一侧粘贴样品垫；在NC膜C线一侧粘贴吸样垫；各粘贴组分接口相互叠压1-2mm，粘贴好的大板切成3-5mm宽、7-8cm长的试纸条。然后将试纸条放置于卡壳下盖的槽中，然后盖上上盖，压紧，完成装配，所述卡壳上盖一侧对应HCG检测试纸的样品垫部分设置了样品孔和稀释液孔，用于加入样本和稀释液，卡壳上盖的中间部分应对试纸NC膜中部设置了视窗口，用于观察NC膜上的C、T线，并判定结果，所述免疫层析判读结果记录仪内置了是否发生钩状效应的判定方法和对应区域(未发生钩状效应区域和发生钩状效应区域)的相应标准曲线，所述检测卡与该免疫层析判读结果记录仪配合使用，用于对检测结果的定量判定，对HCG检测范围为10-1600000/mL。

装配后的HCG检测试纸如图2所示，由胶体金垫、NC膜、样品垫、吸样垫和塑料底板组成，所述样品垫5、胶体金垫1、NC膜4和吸样垫6从塑料底板一端依次排列至另一端，所述NC膜上包被有T线2和C线3。

(4)HCG的时间t和t0.5的确定

取低浓度5000mIu/mL和高浓度10000mIu/mL的HCG目标标准品样本，采用免疫层析判读记录仪连续检测HCG免疫胶体金测试条的反应线的信号值与时间的关系见图1所示，反应线的信号值恒定不变的开始时间即为完全反应的时间，从图1曲线可看出高低浓度的HCG的t为10分钟，而反应线完全反应时信号值的一半的时间即为t0.5，从图1曲线可看出高低浓度的HCG的t0.5为80s。

(5)内置HOOK效应判断方法和对应区域的标准曲线定值方法分别用0，10，100，500，1000，2500，5000，10000，25000，50000，100000，500000，1000000，1600000mIu/mL的HCG标准品对试剂进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带转化成信号值，分别检测在时间80s和10分钟的HCG信号值，若GOD/GOD0.5>1.5，则判定为未发生钩状效应的样本，以其GOD值为Y轴，以目标标准品的浓度(0，10，100，500，1000，2500，5000，10000，25000)为X轴，所得的直线回归曲线即为该区域的标准曲线。若GOD/GOD0.5<1.5，则判定为发生钩状效应的样本。以GOD值为Y轴，以目标标准品的浓度(25000，50000，100000，500000，1000000，1600000mIu/mL)为X轴，用ELISA Cale回归/拟合计算程序软件的logistic曲线拟合(四参数)进行分析得到的曲线Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D即为该区域的标准曲线。上述曲线方程Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D中，A代表X趋于无穷大或者无穷小时Y的最大值，B代表斜率，C代表拐点浓度，D代表X趋于无穷大或无穷小时Y的最小值，并输入免疫层析结果判读记录仪中，完成HCG标准曲线参数设置将HCG的Cutoff值设为25mIu/mL，完成结果判定参数设置。

(6)检测方法1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2)分别精确吸取5μl血清、血浆或10μl全血样本，加入到样本孔中，立即分别在下部的稀释液孔中加入70μL样本稀释液(PBS)，15-20分钟内用免疫层析结果判读记录定量判定结果；3)设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出HCG样品浓度的定量测定结果；以及对妊娠情况的综合检测结果。

(7)临床样本检测对10份临床定值阳性样本进行检测，结果见表1，和临床相比，阳性、阴性预期值均为100％。在定量检测方面，未发生钩状效应区域和发生钩状效应区域的定量检测与实际样本浓度的偏差均不大于10％，远远小于试剂本身的偏差15％，准确性好。通过以上结果可以判定检测装置的性能良好，具有操作简便、反应快速、结果准确、可信、能扩宽HCG免疫胶体金的检测范围，满足对于HCG值可达百万mIU/mL的葡萄胎、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌及睾丸畸胎瘤等患者的诊断等优点，适合临床对更为准确、简便检测的需要。

表1检测结果与实际结果的对比

实际HCG浓度(mIu/mL)	检测HCG结果(mIu/mL)	偏差(％)
			59.03	53.68	-9.06％
442.57	465.04	5.08％
			1153.36	1096.67	-4.92％
2607.43	2659.65	2.00％
			5233.06	5315.86	1.58％
15963.82	15368.06	-3.73％
			52679.22	53721.49	1.98％
205986.35	213168.06	3.49％
			867594.06	845389.23	-2.56％
1468732.62	1426543.65	-2.87％

可见，本发明所述免疫胶体金检测装置使HCG定量检测范围扩宽至10-1600000mIU/mL，即将检测范围分为线性范围区域(未发生钩状效应的区域)和钩状效应区域，对两个区域内的样本分别进行定值，且操作简便、反应快速、结果准确、可信。

上述参照实施例对该能扩宽HCG检测范围的免疫胶体金检测装置及检测方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，其特征在于：包括HCG检测试纸，所述HCG检测试纸包括含有胶体金标记HCG抗体的胶体金垫和NC膜，所述NC膜上包被有配对HCG抗体作为T线、抗鼠IgG作为C线。

2.根据权利要求1所述扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，其特征在于：所述NC膜是一种由硝酸纤维素构成的多孔结构的膜，孔径为8-15um。

3.根据权利要求1所述的扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，其特征在于：所述NC膜是由下述方法制备得到的：以0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)将配对的HCG抗体配制成0.8-1.5mg/mL，用喷膜仪在NC膜上以1.2-1.4ul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在NC膜上包被1-2mg/ml的抗鼠IgG作为C线，干燥，即得。

4.根据权利要求1所述的扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，其特征在于：所述胶体金垫是由下述方法制备得到的：采用氯金酸－柠檬酸三钠法制备直径为40±5nm的胶体金溶液，取胶体金溶液，用0.2M K₂CO₃将溶液调到pH7.0-pH8.0，然后将胶体金缓慢搅拌，按每1ml溶液加入5ug-10ug将HCG标记抗体加入到溶液中，继续搅拌30分钟，再加入到终浓度为0.5％的PEG2000和0.5％的水解酪蛋白进行封闭，标记结束后以12000rpm离心，弃上清，沉淀按60％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(0.1MTris/HCl缓冲液，pH7.5，含0.2％水解酪蛋白，6％蔗糖，0.5％Tween 20)。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm²的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥3-5小时，制成胶体金垫。

5.根据权利要求1所述的扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，其特征在于：所述HCG检测试纸由胶体金垫、NC膜、样品垫、吸样垫和塑料底板组成，所述样品垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫从塑料底板一端依次排列至另一端。

6.根据权利要求5所述的扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，其特征在于：所述样品垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。

7.根据权利要求1所述的扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，其特征在于：所述HCG检测试纸的宽度为3-5mm，长度为7-8cm。

8.优选的，上述扩宽HCG免疫胶体金检测范围的检测装置，包括HCG检测试纸、卡壳和免疫层析判读结果记录仪，所述卡壳包含上盖和下盖两个部分，所述卡壳下盖内部平行放置所述HCG检测试纸组成检测卡，所述卡壳上盖一侧对应HCG检测试纸的样品垫部分设置了样品孔和稀释液孔，用于加入样本和稀释液，卡壳上盖的中间部分应对试纸NC膜中部设置了视窗口，用于观察NC膜上的C、T线，并判定结果，所述免疫层析判读结果记录仪内置了是否发生钩状效应的判定方法和对应区域(未发生钩状效应区域和发生钩状效应区域)的相应标准曲线，所述检测卡与该免疫层析判读结果记录仪配合使用，用于对检测结果的定量判定，对HCG检测范围为10-1600000/mL。

9.一种应用上述免疫胶体金检测装置的HCG检测方法，检测时将被检样本(如5μl血清、血浆或10μl全血样本)加入到样本孔中，然后在稀释液孔中加入70ul样品稀释液(PBS)，在15-20分钟内，用免疫层析结果判读记录仪对检测结果进行判定。

10.优选的，上述HCG检测方法，所述免疫层析结果判读记录仪的判断方法如下：分别在t0.5和t时间时使用免疫层析判读记录仪测定胶体金测试条的反应线(T线)的信号值GOD0.5和GOD值，t表示完全反应的时间，t0.5表示完全反应时信号值一半的时间，当GOD/GOD0.5>1.5时判定为未出现钩状效应，按直线回归方程对检测结果的信号值进行浓度值计算，当GOD/GOD0.5<1.5时判定为出现钩状效应，按照logistic曲线拟合四参数法方程对检测结果的信号值进行浓度值的计算。