CN103630692B - 快速检测尿液c肽的胶体金免疫层析试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

一种快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析试剂盒及其检测方法，样本垫材质为玻璃纤维膜，金结合物垫含有胶体金抗C肽抗体交联物；硝酸纤维素膜上的检测线为包被有固相化的C肽抗原的T线，控制线为包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的C线。用滴定管加3滴尿液样本到样本垫上；平放静置2-15分钟；2分钟以上，可以进行定性或半定量检测，对比试剂盒附带的比色卡，估计尿液C肽含量范围；或者等待15分钟，使用专用的定量读数仪，进行定量检测尿液样本的C肽浓度。本发明一种家用或诊所用动态监测装置，能方便地检测尿液C肽水平。其检测灵敏度达到0.25ng/ml水平；填补了国内外空白。成本低、使用方便、灵敏度高、检测时间短。

Description

快速检测尿液 C 肽的胶体金免疫层析试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及检测尿液C肽的快速检测试剂盒及胶体金免疫层析测试法，具体地说是一种应用竞争抑制原理的胶体金免疫层析法实现对尿液中C肽进行定量检测的方法。

背景技术

食物摄入过多、消耗少、能量正平衡可能导致许多代谢性紊乱或疾病，如肥胖、2型糖尿病、多种心血管疾病（如动脉粥样硬化、高血压，冠心病等）、脂肪肝，心血管疾病等等，是当前人们极其关心的健康议题。目前在中国，已有超过50%的中国人有超重和体重过多的担忧，逾30％的人肥胖，有近10-20%的中国人罹患由此而来的代谢紊乱或疾病，如隐性糖尿病、2型糖尿病等。这些人得到医学治疗或医疗帮助的不多，除非他们有很严重的代谢性紊乱、晚期糖尿病或其并发症。其余的则通常不寻求医学咨询或医疗协助。

基础胰岛素水平升高是这些代谢性紊乱或疾病的重要原因。采取措施控制基础胰岛素水平，如增加运动和控制饮食等，可能能降低罹患这类代谢紊乱或疾病的风险。测试基础胰岛素水平，可以评估罹患上述疾病的风险。因此，动态监检测基础胰岛素水平，可以预知自身的健康状况。很有必要发明一种家用或诊所用动态监测装置，能方便地检测基础胰岛素水平。然而，胰岛素稳定性低、半衰期短，直接测量体液（包括血液，尿液等）中的胰岛素水平非常困难。C肽和胰岛素是胰岛β-细胞分泌的胰岛素原降解的产品。C肽与胰岛素是等摩尔量从胰腺分泌释放入血。而且，C肽在尿液中比胰岛素要稳定得多。因此，测定和分析C肽比胰岛素更准确。目前，通常测量人血液样本或24小时的尿液样本中的C肽，来评估胰岛β-细胞功能。送检样本通常被送往正规实验室，需几天后才可返回结果。显然，需要一个更快更方便的方法来跟踪检测基础C肽水平。胶体金免疫层析法已被广泛用来检测人体小分子和各类蛋白，如检测50纳克/毫升的肉毒杆菌神经毒素、0.68纳克/毫升的绒毛膜肾上腺素和0.1纳克/毫升的降钙素原。

发明内容

为解决背景技术中提到的方便测试基础胰岛素水平的方法需求，本发明提供了一种简单、可靠、成本低廉、灵敏度高的快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析试剂盒及其检测方法。

为了达到本发明的目的，本发明技术方案如下：一种快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析试剂盒，包括长方体状盒体、位于盒体内底部的长条形黏贴支架，在黏贴支架上方从左到右依次黏贴有样本垫、金结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；在硝酸纤维素膜上中间部位从左到右设有一道检测线和一道控制线；其特点是：所述的样本垫材质为玻璃纤维膜，经过主要含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理液进行处理过夜；所述的金结合物垫是由经过含Tris、S-17、牛血清白蛋白等的专用处理液处理过的玻璃纤维膜构成，含有胶体金抗C肽抗体交联物；所述的硝酸纤维素膜上的检测线为包被有固相化的C肽抗原的T线，T线包被的固相化的C肽量高于样本中能与金结合物垫中胶体金交联抗体的C肽量。所述的硝酸纤维素膜上的控制线为包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的C线。

一种快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析检测方法，其特点是：被检测样本为尿液，采用上述快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析试剂盒，被检测样本为尿液，采用上述权利要求1至2任意一项所述的快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析试剂盒；1）用加油枪加100ul或用滴定管加3滴尿液样本到样本垫上。或者手持检测端，垂直把样本垫至刻度处浸入尿液样本中1秒钟；2）平放静置2-15分钟；3）2分钟后，进行定性或半定量检测，对比试剂盒附带的比色卡，估计尿液C肽含量范围；4）或者等待15分钟，使用专用的定量读数仪，进行定量检测尿液样本的C肽浓度。

本发明运用胶体金标记鼠单克隆抗C肽单克隆抗体，以竞争抑制法这一技术来实现对尿液中C肽的定量检测。该方法用于测定尿液C肽以评估过夜饥饿后的基础胰岛素水平；该方法也可被用于测定血液中C肽含量。正常人尿液中基础C肽水平低于1.8纳克/毫升，胶体金免疫层析法适应于检测正常人尿液中基础C肽水平；本发明是一种家用或诊所用动态监测装置，能方便地检测尿液C肽水平。其检测灵敏度达到0.25 ng/ml水平；填补了国内外空白。本发明成本低、使用方便、灵敏度高、检测时间短，可以快速检测尿液C肽的浓度。

附图说明

图1是本发明快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析试剂盒的结构示意图。

图2是本发明的0-4纳克/毫升C肽的比色卡的标准测试颜色。

具体实施方式

从图1、图2可见，本发明的快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析试剂盒，包括长方体状盒体、位于盒体内底部的长条形黏贴支架，在黏贴支架上方从左到右依次黏贴有样本垫、金结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；在硝酸纤维素膜上中间部位从左到右设有一道检测线和一道控制线；所述的样本垫材质为玻璃纤维膜，经过主要含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理液进行处理过夜；所述的金结合物垫含有胶体金抗C肽抗体交联物；所述的硝酸纤维素膜上的检测线为包被有固相化的C肽抗原的T线，T线包被的固相化的C肽量高于样本中能与金结合物垫中胶体金交联抗体的C肽量；所述的硝酸纤维素膜上的控制线为包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的C线。

本发明的快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析检测方法：被检测样本为尿液，采用上述快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析试剂盒，用加油枪加100ul或用滴定管加3滴尿液样本到样本垫上；或者手持检测端，垂直把样本垫至刻度处浸入尿液样本中1秒钟；用定时器计时，平放静置2-15分钟；2分钟以上，可以进行定性或半定量检测，对比试剂盒附带的比色卡，估计尿液C肽含量范围；或者等待15分钟，使用专用的定量读数仪（器），进行定量检测尿液样本的C肽浓度（ng/ml）。

当将样本滴入到试纸样本垫中，样本通过样本垫到达金结合物垫，样本中的C肽可以结合特异的金标记抗C肽抗体，该抗原抗体复合物向着检测T线区和控制C线区迁移，金标记抗体在T线区与C肽结合而产生酒红色颜色。剩余金标记抗体继续向右前移，与固定在控制C线区的羊抗鼠抗体反应而形成第二条酒红色条带；根据样本中C肽浓度，T线颜色从白色到红色不等。颜色越深表明样本中C肽含量越少。图2是比色卡的<2ng/ml，正常、2.5ng/ml、3ng/ml、和4ng/ml C肽的标准测试颜色。

胶体金标记的鼠抗人C肽单克隆抗体能特异地识别和捕获待检样本中的C肽，然后通过毛细作用移动到达检测区。在那里，已经捕获样本中C肽的胶体金-抗体再捕获检测T线区中的C肽的能力业已丧失，因此在检测区形成胶体金酒红色条带的颜色会浅。如果样本中C肽含量少，到达检测T线区的裸露胶体金-抗体就会多，它们可以更多的结合位于检测T区的C肽抗原，因此在检测T线区形成胶体金酒红色条带的颜色越浅，反映样本中C肽含量就越多；反之，在检测T线区形成胶体金酒红色条带的颜色越深，反映样本中C肽含量就越少。这就是采用竞争抑制法原理的胶体金免疫层析检测方法。

实施例：

一、合成C肽和优化鼠抗人C肽抗体胶体金结合

为了达到检测尿液C肽的目的，我们制作了3株单克隆抗人C肽抗体。用ELISA测试了它的敏感性和特异性。这3株单克隆抗体识别C肽的不同抗原决定簇。因为每个决定簇的电荷和疏水性是不同的，与特异抗体的相互作用受不同因素的影响，如pH，离子强度和其他因素的存在，如化学物质和蛋白等等。因此，我们评估了不同pH值（尿液pH波动范围在4.5-8之间）和不同的盐离子强度（尿钠排泄为2.9 ± 1.3毫当量/公斤、每24小时）对C肽与抗体结合的敏感性和特异性的影响，尿液成分对其影响也在检测之中，如肌酐（尿正常范围浓度：0.5〜1.0毫克/分升）、尿素（正常尿范围：6-10毫克/毫升）和白蛋白（正常尿值<15微克/毫升）等。ELISA法测C肽的最低浓度为0.25 ng/ml。用ELISA法分析各种非特异性因素（如白蛋白、尿素和肌酐等）存在时该抗体的特异性非常高。

抗体与胶体金的交联（结合）。抗体与胶体金的结合主要取决于独立但相关的因素三个：1）带负电荷的胶体金与带正电的蛋白质存在离子吸引力；2）抗体和胶体金表面之间的疏水亲和力；3）蛋白质的氨基酸与胶体金可能的电子和硫原子亲和力。每个抗体的亲和特征受这三个因素的影响，因此，每个抗体与胶体金的亲和结合会有所不同。我们调整了pH值和胶体金的大小来优化抗体结合条件，认为应用25nm胶体金粒子可以达到最佳状态。为达到这个目标，我们事先进行了滴定，最后交联，并纯化了该交联抗体。交联抗体最好在蛋白质的等电点附近进行。不同pH值下（pH，7，8，9，10，等等）可用于鉴定蛋白质的等电点。胶体金交联的抗体可存放直到下一步使用。

二、组装并优化C肽快速检测试纸条

该C肽快速检测试纸条的基本结构如图1所示。当试纸条浸入标本，如尿液，该样本可移动通过样本垫到达胶体金结合垫。任何标本中C肽会特异性地结合金标记抗体，通过毛细管作用迁移到检测T线区和控制C线区。根据样本中不同的C肽浓度，T线的颜色可从白色到酒红色变化。多余的交联胶体金或游离的交联胶体金将与在T线的固定化C肽结合，而形成酒红色条带。T线的颜色反映样本中C肽的浓度，因此，样本中C肽含量可以通过比较测试T线的颜色来确定。

半定量检测：为达到这一个目的，我们设计了标准比色卡（见图2）。将T线条带与比色卡比较，根据不同的颜色判断C肽的浓度范围（见图2）。标准比色卡有不同色度代表不同的C肽浓度：<2纳克/毫升,正常；2.5纳克/毫升，3纳克/毫升，4纳克/毫升四档，可以用于判断被检样本中C肽浓度范围：<2纳克/毫升,正常；<2～2.5纳克/毫升，2.5～3纳克/毫升，3～4纳克/毫升及大于4纳克/毫升。正常人的尿液的基础C肽水平是<1.8纳克/毫升。因此，我们设定阈值为2纳克/毫升来建议胰岛素分泌水平的超高。该阈值将被进一步明确和调整，如正常人、超重、肥胖以及有无高胰岛素血症等状况下的C肽水平。其他标准，如3纳克/毫升、4纳克/毫升、或更高，是被用于确定胰岛素分泌是否相对过剩。此设置是特别为那些人想要知道如何以及在他们的努力下，胰岛素分泌水平是否会减少。

我们制作的快速检测试剂盒包括试纸条，由以下几个部分（见图1）组成：样本垫，金结合物垫，硝酸纤维素膜（NC膜），吸水垫，黏贴支架，外盒。

1）样本垫，材质为玻璃纤维膜，经过样本垫处理液（主要含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10）处理过夜，样本垫用于去除样品中的大颗粒及缓冲检测系统以保障环境体系中C肽抗原与特异性抗体交联。

2）金结合物垫，经过专用处理液（含Tris、S-17、牛血清白蛋白等）处理过的玻璃纤维膜，含有胶体金抗C肽抗体交联物。胶体金标记抗体的确切点样量需要严格测试，以适合T线显色检测C肽，还要使多余胶体金标记抗体进入C区而显现颜色。胶体金标记抗体不足时C区颜色将不会显示，成为失效条。过量的胶体金标记抗体到达T区可出现假阳性。

3）硝酸纤维素膜（NC膜）。在硝酸纤维素膜划线的第一个区是T线检测区，在硝酸纤维素膜划线的第二个区是C线控制区。T线和C线在此膜包被成线状。T线含固相化的C肽，以捕获任何多余的胶体金交联抗体。T线固相化的C肽量高于胶体金结合垫中胶体金交联抗体的量。当C肽-胶体金交联复合物从交联垫以毛细运动到达C线时，该复合物将被羊抗鼠IgG抗体捕获，而形成可见的酒红色条带。C线为控制线，以便检验检测系统的有效性。如C线不出线，表明检验无效。

4）吸水垫为Whatman滤纸，促进样本层析经过样本垫、胶体金-抗体结合物垫、硝酸纤维素膜，到达吸水垫区，以吸收多余的样本而完成检测。

5）黏贴支架为PVC支持垫：由薄PVC塑料制成以支撑上述组件。

定量检测：为达到这一个目的，我们设计了配套的免疫层析定量读数仪，也设计了配套的电子定量读数器。两套产品可以用于医院、医疗服务机构及家庭使用。

评估检测试纸条，包括敏感性、特异性和准确性。检测试纸条浸入标准浓度的C肽溶液（0.5-4纳克/毫升）以评估其敏感性和特异性。C肽溶液中的pH 4-7、2N Na钠盐、8M尿素、2M肌酐和15%蛋白对检测无干扰。

本发明产品的阳性参考品符合率、重复性、稳定性、批间差、最低检出量等指标均符合行业标准。

本发明产品的最低检出量为0.25ng/mL。

本发明产品的定性检测时间为2分钟，定量检测时间为15分钟。

Claims (2)

1.一种快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析试剂盒，包括长方体状盒体、位于盒体内底部的长条形黏贴支架，在黏贴支架上方从左到右依次黏贴有样本垫、金结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；在硝酸纤维素膜上中间部位从左到右设有一道检测线和一道控制线；所述的样本垫材质为玻璃纤维膜，经过主要含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理液进行处理过夜；所述的金结合物垫是由经过含Tris、S-17、牛血清白蛋白等的专用处理液处理过的玻璃纤维膜构成，含有胶体金抗C肽抗体交联物；所述的硝酸纤维素膜上的检测线为包被有固相化的C肽抗原的T线；所述的硝酸纤维素膜上的控制线为包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的C线；其特征在于：所述的T线包被的固相化的C肽量高于样本中能与金结合物垫中胶体金交联抗体结合的C肽量。

2.一种快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析检测方法，其特征在于：被检测样本为尿液，采用上述权利要求1所述的快速检测尿液C肽的胶体金免疫层析试剂盒；

1）用加油枪加100ul或用滴定管加3滴尿液样本到样本垫上；或者手持检测端，垂直把样本垫至刻度处浸入尿液样本中1秒钟；

2）平放静置2-15分钟；

3）2分钟后，进行定性或半定量检测，对比试剂盒附带的比色卡，估计尿液C肽含量范围；

4）等待15分钟，使用专用的定量读数仪，进行定量检测尿液样本的C肽浓度。