CN104569414A - Pct/saa联合快速检测用试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人降钙素原/血清淀粉样蛋白A(PCT/SAA)联合快速检测用试纸条，包括检测卡外壳、测试条、以及样本垫、涂覆有两种胶体金标记抗体的金结合物垫、硝酸纤维素膜及吸水纸，硝酸纤维素膜上设有一道包被有固相化的配对的抗SAA单克隆抗体的T1检测线和另一道包被有固相化配对的抗PCT单克隆抗体的T2检测线，以及一道与所述检测线平行的包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的控制C线。所述胶体金标记抗体有两种，分别为胶体金标记的能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原SAA特异性结合的抗体。本发明能同时联合快速检测病人样本中的PCT/SAA，提高了感染性疾病早期炎症反应的诊断准确率，操作简单，快捷方便。

Description

PCT/SAA联合快速检测用试纸条及其制备方法
技术领域
    本发明属于生物医药领域，涉及一种人降钙素原（procalcitonin，PCT）和血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A protein，SAA）联合快速检测用试纸条及其制备方法，具体地说是一种应用双抗夹心法原理的胶体金免疫层析法，配合免疫层析读数仪，同时实现对PCT/SAA二项目进行现场快速检测的方法。
背景技术
本品采用双抗夹心法和胶体金免疫层析技术，同时快速检测人全血、血清或血浆样本中的降钙素原（PCT）和血清淀粉样蛋白A（SAA），可用于炎症等感染类疾病的辅助诊断。
近年来，随着胶体金免疫层析技术及生化制备技术的发展，用胶体金免疫层析法快速检测人全血、血清或血浆中的一种或同时几种因子、抗原、蛋白已成为现实，本发明所述的PCT/SAA的检测就属于联合检测的一种。
人降钙素原（procalcitonin，PCT）是无激素活性的降钙素（calcitonin，CT）前肽物质，由116个氨基酸组成、分子质量为13kD的糖蛋白。PCT半衰期为25-30h，体内外稳定性很好。正常情况下，PCT在受到荷尔蒙刺激后仅由甲状腺的C细胞分泌，其浓度通常小于0.1ng/ml。而在促炎症刺激下，特别是在受到细菌感染时，PCT由大量全身各类细胞产生。在全身性细菌、真菌、寄生虫感染和脓毒症等异常情况下，PCT异常升高，而降钙素（CT）则无明显变化。血PCT水平与感染及损伤的严重程度呈正相关。在感染刺激下的3-6小时内即可观察到PCT不断上升达高峰，并持续24小时。当PCT浓度大于0.5ng/ml时极可能感染细菌，需要使用抗生素治疗。目前PCT成为早期诊断全身性重症细菌感染的敏感性指标。
血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A protein，SAA）是一种急性时相反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12kD。正常人血清SAA浓度平均值为2.33mg/L。在急性时相反应中，经IL-1、IL-6和TNF刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100-1000 倍，但半衰期短，只有50分钟左右。
SAA的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，有助于诊断非特异炎症、评估其炎症活性程度、监控其炎症活动及对其治疗的效果。且SAA一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白 A (AA) 原纤维的方式沉积在不同的器官中，引起脏器纤维化，在慢性炎症性疾病发生发展过程中影响脏器的功能，而产生一种严重的淀粉样变性并发症。所以在淀粉样变性患者中，将SAA 水平回复至正常为宗旨的治疗，能改善病情发展。另外，与PCT不同的是，在病毒感染的初期SAA水平也明显增高。因此，SAA检测在诊断肾移植排斥反应伴发病毒感染的患者（特别是进行免疫抑制治疗的患者）以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面，比 PCT更能够准确判断炎症的活动状态。
因此，联合快速检测PCT和SAA比二者任一单独使用时应用范围更广，更便捷，在诊断感染时，诊断结果更准确，临床参考价值更高。
胶体金免疫层析法具有快速、简便的特点且操作无须专门仪器和场所，对操作人员没有很高要求，结果分析清楚，易于判断，因此非常适合于在缺少设备的边远山区、基层医院、诊所和床边开展并能满足家庭或个人在诊断、保健、体检等方面的运用。
发明内容
本发明的目的在于为解决背景技术中提到的，方便联合检测人全血、血清或血浆中降钙素原（procalcitonin，PCT）和血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A protein，SAA）含量的方法需求，提供一种PCT/SAA联合快速检测用试纸条，可以解决现有技术存在的不能在一条试纸中同时检测PCT/SAA的问题。本发明提供了一种适合进行现场检测，简单方便、稳定可靠、成本低廉、灵敏度高的快速联合定量检测PCT/SAA的胶体金免疫层析试纸及其检测方法。
本发明的另一个目的是提供该试纸条的制备方法。
本发明目的之一的实现：一种PCT/SAA联合快速检测用试纸条，包括检测卡外壳、测试条、样本垫、金结合物垫、硝酸纤维素膜及吸水纸，所述金结合物垫上涂覆有两种胶体金标记抗体，分别为胶体金标记的能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原SAA特异性结合的抗体；所述的硝酸纤维素膜上设有一道包被有固相化的配对的抗SAA单克隆抗体的T1检测线和另一道包被有固相化配对的抗PCT单克隆抗体的T2检测线，以及一道与所述检测线平行的包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的控制C线。
所述的样本垫材质为玻璃纤维膜，经过含有Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理液进行处理，37摄氏度烘干后，在密封袋中室温保存。所述的金结合物垫材质为玻璃纤维膜，经过含有Tris、柠檬酸三钠、吐温 20的处理液进行处理，37摄氏度烘干后，在密封袋中室温保存。所述样本垫、金结合物垫、硝酸纤维素膜及吸水纸从左到右依次黏贴在测试条黏贴底衬上方。
本发明目的之二的制备方法是由以下步骤实现的：
1）样本垫前处理：将含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的样本垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，于37摄氏度烘干处理后，在密封袋中室温保存。
2）金结合物垫前处理：将含Tris、柠檬酸三钠、吐温 20的金结合物垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，于37摄氏度烘干处理后，在密封袋中室温保存。
3) 金结合物垫的制备：分别制备含有胶体金标记的抗PCT单克隆抗体交联物和胶体金标记的抗SAA单克隆抗体交联物，将这两种胶体金标记抗体混合后，涂覆于步骤2）处理过的金结合物垫上。
4）硝酸纤维素膜上检测线和质控线的制备：用配对的抗SAA单克隆抗体和配对的抗PCT单克隆抗体在所述的硝酸纤维素膜上进行线状点样分别作为T1检测线和T2检测线。用羊抗鼠IgG多克隆抗体在所述的硝酸纤维素上进行线状点样作为控制C线。所述的T1检测线、T2检测线和控制C线的间距为0.3-0.5cm。
5）测试条的组装：在测试条黏贴底衬上方从左到右依次黏贴有步骤1）处理过的样本垫、步骤3）制备的金结合物垫、步骤4）制备的硝酸纤维素膜及吸水垫。
6） 检测卡的组装：将步骤5）组装好的测试条切割成一定宽度的长条，再将切割好的测试条安装在长条扁平薄壳状的检测卡外壳底部卡槽中。
本发明的有益效果在于：本发明联合快速检测PCT和SAA比二者任一单独使用时应用范围更广，更便捷，在诊断感染时，诊断结果更准确，临床参考价值更高。可有效用于同时快速测定全血、血清或血浆中PCT和SAA的水平，适合进行现场检测，简单方便、降低医疗成本、稳定可靠、成本低廉、灵敏度高。
附图说明
    图1是本发明一种PCT/SAA联合快速检测用试纸条的结构示意图，即检测卡。图中：1.检测卡外壳 2.测试条 3.检测窗口 4.加样孔。
图2是本发明一种PCT/SAA联合快速检测用试纸条的剖视结构图，即测试条。图中：5.测试条黏贴底衬 6.样本垫 7.金结合物垫 8.硝酸纤维素膜 9.吸水垫 10.T1检测线 11.T2检测线 12.控制C线。
图3是本发明一种PCT/SAA联合快速检测用试纸条反应的5种结果情况示意图。图中：13.T1检测线、T2检测线和控制C线同时显现酒红色印迹带，说明被检测样本中PCT和SAA的含量均高于正常允许值；14. T1检测线和控制C线同时显现酒红色印迹带，T2检测线不显色，说明被检测样本中PCT含量低于或等于正常允许值，SAA的含量高于正常允许值；15. T2检测线和控制C线同时显现酒红色印迹带，T1检测线不显色，说明被检测样本中SAA含量低于或等于正常允许值，PCT的含量高于正常允许值；16.控制C线显现酒红色印迹带，而T1检测线和T2检测线均不显色，说明被检测样本中PCT/SAA的含量均低于或等于正常允许值；17.试纸条没有出现酒红色控制C线，说明试纸条已失效，此时不管检测线颜色的深浅或有无，检测结果都判为无效。
具体实施方式
    本发明结合具体实施例参见附图进一步说明如下：
实施例1
一种PCT/SAA联合快速检测用试纸条，制备方法如下：
1）样本垫前处理：将含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的样本垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，于37摄氏度烘干处理后，在密封袋中室温保存。
2）金结合物垫前处理：将含Tris、柠檬酸三钠、吐温 20等的金结合物垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，于37摄氏度烘干处理后，在密封袋中室温保存。
3) 金结合物垫的制备：分别制备含有胶体金标记的抗PCT单克隆抗体交联物和胶体金标记的抗SAA单克隆抗体交联物，将这两种胶体金标记抗体混合后，涂覆于步骤2）处理过的金结合物垫上。
4） 硝酸纤维素膜上检测线和质控线的制备：用配对的抗SAA单克隆抗体和配对的抗PCT单克隆抗体在所述的硝酸纤维素膜上进行线状点样分别作为T1检测线和T2检测线。用羊抗鼠IgG多克隆抗体在所述的硝酸纤维素上进行线状点样作为控制质控C线。所述的T1检测线、T2检测线和控制C线的间距为0.3~0.5cm。
5） 测试条的组装：在测试条黏贴底衬上方从左到右依次黏贴有步骤1）处理过的样本垫、步骤3）制备的金结合物垫、步骤4）制备的硝酸纤维素膜及吸水垫。
6） 检测卡的组装：将步骤5）组装好的测试条切割成一定宽度的长条，再将切割好的测试条安装在长条扁平薄壳状的检测卡外壳底部卡槽中。
由以上方法制备出的试纸条是在检测卡外壳1中设置测试条2，检测卡外壳1的结构及测试条2的设置参见附图1和2。
检测卡外壳1为由厚0.1cm工程塑料薄壳制成的长条扁平状壳体。长7cm，宽2cm，厚0.5cm。检测卡外壳1由壳盖与壳座两半联接构成，在检测卡外壳1壳盖上有检测窗口3和加样孔4。测试条2放置在检测卡外壳1底部的卡槽中。
测试条2是多层结构的窄条薄片，长6cm，宽约0.4cm，最厚处约0.2cm。测试条黏贴底衬5为塑料薄片，长6cm; 黏贴底衬5中部黏贴有硝酸纤维素膜8，长2.5cm; 硝酸纤维素膜8上用专业的喷金点膜机线状点制有三道间隔0.4cm的横向显示印迹带，一道为包被有固相化的配对的抗SAA单克隆抗体T1检测线10，另一道为包被有固相化的配对的抗PCT单克隆抗体T2检测线11，第三道为包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的控制C线12；黏贴底衬5靠近控制C线12一端顶部黏贴吸水垫9，长1.7cm；黏贴底衬5另一端顶部黏贴样本垫6，长1.9cm；在样本垫6与硝酸纤维素膜8两者之间夹置黏贴一段金结合物垫7，是含有胶体金标记的抗PCT单克隆抗体交联物和胶体金标记的抗SAA单克隆抗体交联物的混合物的玻璃纤维素膜，长10cm，其中一端搭接在硝酸纤维素膜8上0.2cm；
测试条2放置在检测卡外壳1底部的卡槽中，样本垫6正对加样孔4，硝酸纤维素膜8正对检测窗口3。
一种PCT/SAA联合快速检测用试纸条的主要原理是免疫学的抗体抗原结合反应，被检测样本为血液。检测方法：用加样枪加血液样本到样本垫上，用定时器计时，平放静置2分钟后，使用专用的免疫层析快速读数仪（器），进行快速检测样本中PCT和SAA的浓度。当将样本滴入到试纸样本垫中，样本通过样本垫到达金结合物垫，样本中的SAA可以结合特异的胶体金标记的抗SAA单克隆抗体，样本中的PCT可以结合特异的胶体金标记的抗PCT单克隆抗体。该两种抗原抗体交联物同时通过毛细作用向着检测T线区和控制C线区移行，SAA金标记抗体在T线区与T1检测线的配对抗体结合而产生第一条酒红色条带，PCT金标记抗体在T线区与T2检测线的配对抗体结合而产生第二条酒红色条带，剩余金标记抗体继续前移，与固定在控制C线区的羊抗鼠抗体反应而形成第三条酒红色条带。图3是试纸条反应的5种结果情况示意图。
胶体金标记的鼠抗人PCT单克隆抗体能特异地识别和捕获待检样本中的降钙素原(PCT)，然后通过毛细作用移动到达检测区。在那里，已经捕获样本中PCT的胶体金-抗体再捕获检测T线区中的抗PCT抗体，因此在检测区形成胶体金酒红色条带的颜色会反映样本中PCT含量。如果样本中PCT量少，到达检测T线区的裸露胶体金-抗体就会少，它们可以结合位于T检测线的抗PCT抗体就少，因此在T检测线形成胶体金酒红色条带的颜色越浅，反映样本中PCT含量就越少；反之，在T检测线形成胶体金酒红色条带的颜色越深，反映样本中PCT含量就越多。同样，如果样本中SAA含量少，到达检测T线区的裸露胶体金-抗体也就会少，它们可以结合位于T检测线的SAA抗体就少，因此在T检测线形成胶体金酒红色条带的颜色越浅，反映样本中SAA含量就越少；反之，在T检测线形成胶体金酒红色条带的颜色越深，反映样本中SAA含量就越多。因此，根据样本中PCT和SAA的浓度，T1检测线和T2检测线从白色到酒红色的不同程度显色。

Claims (5)

1. 一种PCT/SAA联合快速检测用试纸条，包括检测卡外壳、测试条、样本垫、金结合物垫、硝酸纤维素膜及吸水纸，其特征在于：所述金结合物垫上涂覆有两种胶体金标记抗体，分别为胶体金标记的能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原SAA特异性结合的抗体；所述的硝酸纤维素膜上设有一道包被有固相化配对的抗SAA单克隆抗体的T1检测线和另一道包被有固相化配对的抗PCT单克隆抗体的T2检测线，以及一道与所述检测线平行的包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的控制C线。
2. 根据权利要求1所述的PCT/SAA联合快速检测用试纸条，其特征在于，所述的样本垫材质为玻璃纤维膜，经过含有Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理液进行处理，37摄氏度烘干后，在密封袋中室温保存。
3. 根据权利要求1所述的PCT/SAA联合快速检测用试纸条，其特征在于，所述的金结合物垫材质为玻璃纤维膜，经过含有Tris、柠檬酸三钠、吐温 20的处理液进行处理，37摄氏度烘干后，在密封袋中室温保存。
4. 根据权利要求1所述的PCT/SAA联合快速检测用试纸条，其特征在于，所述样本垫、金结合物垫、硝酸纤维素膜及吸水纸从左到右依次黏贴在测试条黏贴底衬上方。
5. 根据权利要求1所述的PCT/SAA联合快速检测用试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）样本垫前处理：将含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的样本垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，于37摄氏度烘干处理后，在密封袋中室温保存；
2）金结合物垫前处理：将含Tris、柠檬酸三钠、吐温 20的金结合物垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，于37摄氏度烘干处理后，在密封袋中室温保存；
3) 金结合物垫的制备：分别制备含有胶体金标记的抗PCT单克隆抗体交联物和胶体金标记的抗SAA单克隆抗体交联物，将这两种胶体金标记抗体混合后，涂覆于步骤2）处理过的金结合物垫上；
 硝酸纤维素膜上检测线和质控线的制备：用配对的抗SAA单克隆抗体和配对的抗PCT单克隆抗体在所述的硝酸纤维素膜上进行线状点样分别作为T1检测线和T2检测线，用羊抗鼠IgG多克隆抗体在所述的硝酸纤维素上进行线状点样作为控制C线，所述的T1检测线、T2检测线和控制C线的间距为0.3~0.5cm；
 测试条的组装：在测试条黏贴底衬上方从左到右依次黏贴有步骤1）处理过的样本垫、步骤3）制备的金结合物垫、步骤4）制备的硝酸纤维素膜及吸水垫；
 检测卡的组装：将步骤5）组装好的测试条切割成长条，再将切割好的测试条安装在长条扁平薄壳状的检测卡外壳底部卡槽中。
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