CN102707071A - Pct/crp联合检测用胶体金试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于临床医学检验领域，具体涉及一种PCT/CRP检测用胶体金试纸条，包括试纸条底衬，以及试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴的样品垫、涂覆有金标抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸，包被膜上设有一条包被兔抗鼠IgG抗体的控制线，包被膜上还设有与所述控制线平行的两条检测线，分别包被能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原CRP特异结合的抗体；所述金标抗体有两种，分别为胶体金标记的能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原CRP特异结合的抗体。本发明能同时检测PCT/CRP，提高了炎症反应诊断准确率，操作简便。

Description

PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于临床医学检验领域，具体涉及PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术

降钙素原（procalcitonin, PCT）是无激素活性的降钙素前体物质，是由116个氨基酸组成，分子量为13KD的糖蛋白。PCT由神经内细胞分泌（包括甲状腺、肺和胰腺组织细胞）表达，经酶切分解为降钙素（CT）、羧基端肽及氨基端肽。PCT在人体内的半衰期为25-30h，稳定性好，在正常人血清中含量极低。

在导致全身炎症反应综合征（SIRS）的许多情况下，诸如细菌性感染、胰腺炎、烧死、多发伤，血中CT前肽物质的所剪切产物异常升高，其中PCT是最主要的产物，而CT无明显变化。血PCT水平与感染及损伤的严重程度呈正相关，且已成为用于脓毒症、严重脓毒症、脓毒休克的诊断和疗效监测的有效指标。

C反应蛋白（C-reactive protein, 简称CRP）是一种能和肺炎链球菌的荚膜C多糖结合，机体受到微生物入侵或组织损伤等刺激时肝细胞合成的γ球蛋白，分子量约为105KD，痕量存在于健康人血清中（约580ng/ml）。当发生炎症疾病或组织损伤6～8小时内，血清或血浆CRP量迅速升高，并在48～72小时达高峰，但随着病情改善或组织结构功能恢复其含量也恢复正常。因此血清或血浆中C反应蛋白的水平，可以作为判断有无感染、疾病是否处于活动期的指标。

研究表明在诊断炎症有关疾病，单独使用一种指标CRP或PCT不能有效和准确诊断。如在自身免疫疾病的炎症性疾病（如红斑狼疮、反应性关节炎和炎症性肠病）活动期间，仅测定PCT含量，会发现其与正常人的含量没有显著差异。但是如果测定CRP时，CRP含量明显高于正常人。因此，结合这两种指标的结果，才能最终确定病人是否有炎症反应。Hammer等对78例心脏或肺脏移植患者研究显示，急性排异期C反应蛋白和白细胞记数升高，而PCT无变化。因此一种指标不能确定是否炎症感染。合并全身细菌或真菌感染时PCT>1ng/ml，PCT用来鉴别急性排异反应与感染。

李卫军.医学新知，2010，研究血清降钙素原与C反应蛋白联合检测在下呼吸道感染性疾病中的临床价值，结果表明在鉴别细菌性与非细菌性感染中，PCT、CRP及PCT+CRP的敏感度分别为78.6%、97.6%和97.6%,特异度分别为80.0%、37.1%和82.9%。结论联合检测血清中PCT、CRP含量可提高下呼吸道感染性疾病诊断与分类的可靠性。

但是，目前还没有一种能够同时检测PCT和CRP的方法或者手段。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条，可以解决现有技术存在的不能在一个试纸条中同时检测PCT/CRP的问题。

本发明的另一个目的是提供该试纸条的制备方法。

本发明的目的可通过采用以下技术方案予以实现：

PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条，包括试纸条底衬、以及试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴的样品垫、涂覆金标抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸，包被膜上设有包被兔抗鼠IgG抗体的控制线，包被膜还设有与所述的控制线平行的两条检测线，分别包被能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原CRP特异结合的抗体；所述金标抗体有两种，分别为胶体金标记的能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原CRP特异结合的抗体。

所述样品垫为两层样品垫。

所述的与待检抗原PCT是人PCT, 所述待检抗原CRP是人CRP。

所述的与待检抗原特异结合的抗体为能够与待检抗原特异结合的单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体。

所述的两条检测线中一条包被PCT单克隆抗体，另一条包被CRP单克隆抗体。

所述的金标抗体为胶体金标记的PCT单克隆抗体和胶体金标记的CRP单克隆抗体。

PCT/CRP检测用胶体金试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1）制备包被膜：用包被缓冲液分别稀释能与待检抗原之一特异结合的抗体以及兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的三种抗体分别平行地喷于硝酸纤维素膜的中部，三种抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成两条检测线和兔抗鼠IgG抗体包被的控制线；

2）制备涂覆金标抗体的聚酯膜：分别制备两种胶体金标记的能与待检抗原之一特异结合的抗体，利用这两种抗体混合物涂覆聚酯膜；

3）组装试纸条：在试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴样品垫、涂覆有金标抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸。

步骤 1）所述的制备包被膜：用包被缓冲液稀释PCT单克隆抗体①或PCT多克隆抗体、CRP单克隆抗体①或CRP多克隆抗体以及兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的三种抗体分别平行地喷于硝酸纤维素膜的中部上，三种抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成包被PCT单克隆抗体①或多克隆抗体的检测线、包被CRP单克隆抗体①或多克隆抗体的检测线和兔抗鼠IgG抗体的控制线。

步骤2）所述的制备涂覆金标抗体的聚酯膜的方法是：将胶体金调节为碱性条件下，加入链亲和素溶液，封闭反应后，加入接有生物素的抗体反应，离心去上清，沉淀以金标抗体保存液恢复体积。所述的接有生物素的抗体连接有PCT单克隆抗体②或接有生物素的CRP的单克隆抗体②。

本发明所述的PCT/CRP联合检测胶体金试纸条在同时检测人PCT和人CRP中的应用。

本试纸条可以用来检测PCT和CRP液体样品，操作时，将全血或血浆，血清按一定的量滴加在本试纸条的样品垫上，当出现的结果是在试纸条的PCT检测线、CRP检测线和控制线位置上各出现一条紫红色带时，表现为两者都是阳性。PCT检测线和控制线各出现一条红色带，说明PCT为阳性；CRP检测线和控制线各出现一条红色带，说明CRP为阳性；仅试纸条的控制线8位置出现一条紫红色带时，为阴性结果；在试纸条的控制线8位置上未出现紫红色条带时，为无效结果。

有益效果：

本发明采用了现代POCT检测中最流行的胶体金技术，通过试纸条上同时设置包被有PCT单克隆抗体或PCT多克隆抗体检测线、包被有CRP单克隆抗体或CRP多克隆抗体的检测线和兔抗鼠IgG抗体的控制线，能够同步检测连个指标（待测抗原或蛋白），并且两种抗原不会相互干扰，结果准确，快速，操作简便，可以广泛用于炎症反应等疾病的检测。

附图说明

图1 本发明的胶体金试纸条的横断面结构示意图；

其中：1、底衬；2、第一层样品垫；3、第二层样品垫；4、聚酯膜；5、包被膜；6、吸水纸；7、包被PCT抗体的检测线；8、包被CRP抗体的检测线；9、包被兔抗鼠IgG抗体的控制线。

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

如图1所示，PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条，包括试纸条底衬1，以及试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴的第一层样品垫2和第二层样品垫3、涂覆金标抗体的聚酯膜4、包被膜5和吸水纸6，包被膜5中部有一条包被鼠抗PCT的单克隆抗体16B5检测线7、一条包被鼠抗CRP单克隆抗体DF92的检测线8和一条包被兔抗鼠IgG抗体的控制线9。以上抗体购自Fitzgerald公司。

上述检测线7还可以是包被双抗PCT的多克隆抗体，检测线8还可以是鼠抗CRP的多克隆抗体。所述多克隆抗体是采用本领域熟练技术人员熟知的常规方法免疫鼠获得抗血清制备而得。

涂覆金标抗体的聚酯膜中有由胶体金颗粒标记的PCT单克隆抗体2E1和由胶体金颗粒标记的CRP单克隆抗体CC8。以上抗体购自南京强欣生物技术有限公司。

胶体金试纸条的具体制备方法如下：

1）包被膜5的制备：

a)包被缓冲液的制备：将0.025M、pH7.4的PBS用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期7天；

b)封闭液的制备：将含1%BSA，1%蔗糖，0.025M、pH7.5的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期3天；

c) 鼠抗PCT的单克隆抗体检测线7的制备：将鼠抗PCT的单克隆抗体16B5按2mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；

d)鼠抗CRP的但克隆抗体检测线8的制备：将CRP单克隆抗体DF92按4.5mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜中部上划线，该线与检测线6平行，两线相隔4mm,细致均匀在干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；

e)控制线9的制备：将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜上部划线，该线与检测线7平行，两线相隔4mm，细致均匀，放入干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；

f)用上述封闭液将含有检测线6、检测线7和控制线8的硝酸纤维素膜于37℃封闭60分钟，取出后置37℃烘干处理两个小时，封袋备用。

2）涂覆金标抗体的聚酯膜4的制备

a)氯金酸水溶液的配制：将10g氯金酸1000ml的三蒸水溶解，配制成1%的水溶液，置于4℃备用，有效期3个月；

b)柠檬酸三钠的配制：用三蒸水溶解柠檬酸三钠，配制1%的水溶液，用0.22μ膜滤过，置于4℃备用，有效期7天；

c)1%碳酸钾水溶液的配制：将1g碳酸钾用100ml用三蒸水溶解，用0.22μ膜滤过，置于4℃备用，有效期7天；

d)金标抗体保存液的配制：将15g的蔗糖，20μl的叠氮钠，在100mlpH 7.4的1%BSA溶解，用0.22μ膜滤过，置于4℃备用，有效期7天；

e)胶体金颗粒的制备：用三蒸水将1%氯金酸稀释成0.01%，置于95℃反应10分钟，加入1ml柠檬酸三钠，继续反应15分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却后加入2ml 1%碳酸钾溶液备用。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物；

f)金标抗体的制备：用1%碳酸钾溶液调节胶体金pH值至7.5，按照10μg链亲和素/ml胶体金的量加入链亲和素溶液充分混匀，置于25℃水浴反应30分钟后再加入5%BSA,封闭20分钟后，离心取沉淀，用BSA恢复其终浓度为1%，4℃保存备用。按50μg单抗-生物素/ml胶体金的量将PCT单克隆抗体2E1-生物素加入胶体金中，37℃搅拌反应40分钟，加入5%BSA，封闭脚不能20分钟，6000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀以金标抗体保存液恢复体积，4℃保存。金标CRP的单克隆抗体CC8按上述方法制备。将两种金标抗体按1:1混合，4℃保存；

g)将混合好的胶体金均匀的铺在聚酯膜上，喷量为1.0μl/cm*3道，干燥，封袋，备用。

3）样品垫2和样品垫3的处理

将样品垫用100mM PBS缓冲液侵泡数小时，取出干燥后。

4）胶体金试纸条的组装：

底衬1、样品垫2、样品垫3和吸水纸6是本领域通用的部件。将上述样品垫2和样品垫3、涂覆有金标抗体的聚酯膜4、包被膜5及吸水纸6顺次相互搭接粘贴得到试纸条，最后将试纸条切割成不同宽度的试纸条即可。

实施例2

PCT血样试验：

经罗氏E170化学发光仪配套本发明检测试剂盒测定含有不同定值的PCT的血清标本，比较显色程度与参考血清的差异，结果见表1。

表1

	0.12ng/ml	2ng/ml	10ng/ml	25ng/ml	50ng/ml
						PCT检测线	+	++	+++	++++	++++
CRP检测线	—	—	—	—	—

CRP血样试验：

经罗氏E170化学发光仪配套本发明检测试剂盒测定含有不同定值的CRP的血清标本，比较显色程度与参考血清的差异，结果见表2。

表2

	5mg/L	20mg/L	40mg/L	80mg/L	120mg/L
						CRP检测线	+	++	+++	++++	++++
PCT检测线	—	—	—	—	—

PCT和CRP血样试验：

经罗氏E170化学发光仪配套本发明检测试剂盒同时测定含有不同定值的PCT和CRP的血清标本，比较显色程度与参考血清的差异，结果见表3。

表3

无PCT和CRP的血样试验：

经罗氏E170化学发光仪配套PCT检测试剂盒和CRP检测试剂盒同时测定的不同定值血清标本，比较显色程度与参考血清的差异，结果见表4。

表4

由表4结果可知检测数值PCT<0.1ng/ml，CRP<1.5mg/L，都显示为阴性结果。

阳性：

两条或三条紫红色条带出现，一条位于质控区（C）内，如果另一条位于PCT测试区（T）,可判断PCT指标为阳性；同样，如果另一条位于CRP测试区（T），可判断CRP指标为阳性；如果位于PCT测试区（T）和CRP测试区（T）都出现红色带，可判断PCT和CRP指标均为阳性。

阴性：

仅质控区（C）出现一条紫红色条带，在测试区（T）无紫红色条带出现或质控区（C）出现一条紫红色条带，在测试区（T）PCT检测线不显示或显色程度<“+”,表明样品中不含PCT或PCT含量低于可检测范围；或质控区（C）出现一条紫红色条带，在测试区（T）CRP检测线不显示或显色程度<“+”，表明样品中不含CRP或CRP含量低于可检测范围。

表1-表4中PCT或CRP的浓度由罗氏E170化学发光仪测得，显色程度为本发明试纸条测得的结果，“+”表示阳性结果，“+”的数量表示显色程度即阳性的严重程度，越多代表显色越深即阳性严重程度越高，“-”表示不显色即阴性结果。

在以上实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

Claims (10)

1.PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条，包括试纸条底衬，以及试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴的样品垫、涂覆有金标抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸，包被膜上设有一条包被兔抗鼠IgG抗体的控制线，其特征在于包被膜上还设有与所述控制线平行的两条检测线，分别包被能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原CRP特异结合的抗体；所述金标抗体有两种，分别为胶体金标记的能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原CRP特异结合的抗体。

2.根据权利要求1所述的PCT/CRP联合检测胶体金试纸条，其特征在于所述的样品垫为两层样品垫。

3.根据权利要求1所述的PCT/CRP联合检测胶体金试纸条，其特征在于所述的与待检抗原PCT是人PCT，所述待检抗原CRP是人CRP。

4.根据权利要求1所述的PCT/CRP联合检测胶体金试纸条，其特征在于所述的与待检抗原特异结合抗体是与待检抗原特异结合的单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体。

5.根据权利要求1所述的PCT/CRP联合检测胶体金试纸条，其特征在于所述两条检测线中一条包被PCT单克隆抗体①，另一条包被CRP单克隆抗体①。

6.根据权利要求1所述的PCT/CRP联合检测胶体金试纸条，其特征在于所述金标抗体为胶体金标记的PCT单克隆抗体②和CRP单克隆抗体②。

7.根据权利要求1所述的PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）制备包被膜：用包被缓冲液分别稀释能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原CRP特异结合的抗体、兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的三种抗体分别平行地喷于硝酸纤维素膜的中部上，三种抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成两条检测线和兔抗鼠IgG抗体包被的控制线；

2）制备涂覆金标抗体的聚酯膜：分别制备胶体金标记的能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原CRP特异结合的抗体，利用这两种金标抗体混合物涂覆聚酯膜；

3）组装试纸条：在试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴样品垫、涂覆有金标抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸。

8.根据权利要求7所述的PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条的制备方法，其特征在于步骤1）所述的制备包被膜：用包被缓冲液稀释PCT单克隆抗体①或PCT多克隆抗体、CRP单克隆抗体①或CRP多克隆抗体以及兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的三种抗体分别平行地喷于硝酸纤维素膜的中部上，三种抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成包被PCT单克隆抗体①或多克隆抗体的检测线、包被CRP单克隆抗体①或多克隆抗体的检测线和兔抗鼠IgG抗体的控制线。

9.根据权利要求7所述的PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条的制备方法，其特征在于步骤2）所述的制备涂覆金标抗体的聚酯膜的方法是：将胶体金调节为碱性条件下，加入链亲和素溶液，封闭反应后，加入接有生物素的PCT单克隆抗体②和CRP单克隆抗体②反应，离心去上清，沉淀以金标抗体保存液恢复体积。

10.权利要求1所述的PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条在同时检测人PCT和人CRP中的应用。

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