CN104316702A - Pct 与crp定量联检层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条及其制备方法，所述试纸条包括底衬及设在所述底衬上的包被膜，所述包被膜上设有样品垫、包被线区和吸水纸，所述包被线区包括从靠近所述样品垫端至靠近所述吸水纸端依次平行设置的包被荧光胶乳标记抗体的标记线、包被鸡IgY抗体的质控线、包被能与待检抗原CRP特异性结合的另一株CRP单克隆抗体的CRP检测线、以及包被能与待检抗原PCT特异性结合的另一株PCT单克隆抗体的PCT检测线。本发明的试纸条简化了普通试纸条的结构，通过去掉传统试纸条中荧光乳胶标记抗体得以固化的结合垫，将抗体改为固化在包被膜上，提高了测试的精密度，降低了试纸条成本。

Description

PCT 与CRP定量联检层析试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体地说，本发明涉及一种PCT与CRP定量联检层析试纸条及其制备方法。
背景技术
CRP是环状五球体蛋白，属于Oligomeric钙结合蛋白，相对分子质量约120000，由5个相同的单体以非共价键构成，是炎性淋巴因子白介素-6、白介素-1、肿瘤坏死因子刺激肝脏上皮细胞合成的。CRP在感染发生后6～8h即开始升高，24～48h达到高峰，高峰值可达正常的数百倍，在感染消除后其含量急骤下降，一周内可恢复正常。而CRP在病毒感染时无显著升高，这为疾病早期感染类型的鉴别提供了极其重要的依据。
hsCRP(0.1～10mg/L)对未来心血管疾病发生危险程度的预测:近年来，通过很多前瞻性研究,已经对hsCRP的升高在心血管疾病包括冠心病、中风、外周血管疾病发病的危险性方面的作用有所认识。hsCRP对于急性冠脉综合征的诊断也有十分重要的作用。
临床实验室CRP检测一直采用透射免疫和散射免疫方法,这些方法的参考值范围变动很大，从3mg/L到超过200mg/L。随着人们对于低水平CRP与心血管疾病关系的认识，这些测定方法的灵敏度远远不能满足要求。
降钙素原(procalcitonin,PCT)是1992年发现的人类降钙素的前体物质，无激素活性，是由116个氨基酸残基组成，相对分子量为13kD的糖蛋白。
PCT能有效地反映感染导致的炎症损伤程度，具有高灵敏度、特异性。它在细菌或真菌感染合并严重全身系统反应或器官低灌注时显著升高，而在病毒或局灶感染时水平正常或轻度升高。这个特性使得PCT用来鉴别系统感染和非感染性炎症或局灶感染。此外，PCT还可用来判断治疗的有效性、疾病的严重程度和预后。
健康成人的PCT浓度<0.1ng/ml，严重全身感染者血PCT在24h内可升高达1000倍。脓毒症时一般PCT升高且>2ng/ml，通常PCT>5ng/ml提示重症感染，包括免疫抑制患者如艾滋病人群，高浓度的PCT、特别是抗生素治疗后无下降者常提示预后不良。
目前PCT检测方法有：
1、放射免疫学分析法——该方法能检测正常人的血清PCT，可靠敏感度为4pg/ml，但该法检测耗时长(19～22h)，而且有放射性元素的污染，使得使用受到限制。
2、双抗夹心免疫化学发光法——该法操作简便，特异性强，敏感性高，测定的低限值为0.1ng/ml，2h可以出结果。
3、金标法——该法具有快速简便，易观察的特点。但是灵敏度不高。
4、透射免疫浊度法——该测定方法简便、快速，可自动化，适合于批量检测，但是免疫透射比浊的方法学及临床应用尚需做进一步的验证。
PCT是特异性较高的早期细菌感染标志物，可较好地区别细菌感染与非细菌感染。CRP测定虽有助于感染性疾病的早期诊断，但单独测定不能确定诊断。PCT与CRP联合检测可提高敏感性和特异性，减小误诊率。
何静发表在“检验医学与临床”的文章“联合测定血清PCT与CRP对感染性疾病的诊断价值”，研究对90例感染性患者PCT、CRP的含量变化进行检测，结果显示细菌感染组与病毒感染组比较，PCT水平明显升高，而且重症细菌感染组与一般细菌感染组比较，PCT浓度亦有明显增加。血中PCT的升高可能与细菌内毒素可刺激机体，诱导体内甲状腺外组织产生大量PCT有关。细菌感染组的PCT与CRP之间存在正相关，这说明细菌感染引起CRP改变的同时，也会引起PCT的改变，而病毒感染组中PCT与CRP之间无相关性，表明病毒能刺激机体CRP合成增多，而不能诱导PCT合成。
戴佩佩发表在“检验医学”的文章“降钙素原与C反应蛋白联合检测在细菌感染中的应用”，研究对ICU的60例细菌感染患者PCT、CRP的含量及动态变化进行检测，以PCT>0.5ng/ml为界，诊断细菌感染的敏感性为96.7％(58/60)，特异性为85.3％(29/34)，阳性预测值92.1％(58/63)，阴性预测值93.5％(29/31)；以CRP>8mg/L为界，诊断细菌感染的敏感性为96.7％(58/60)，特异性为73.5％(25/34)，阳性预测值86.6％(58/67)，阴性预测值92.5％(25/27)。PCT在敏感性与CRP相差不大的情况下，特异性却显著高于CRP。同时测定血CRP和PCT有助于提高细菌感染性疾病早期判断的特异性，对抗菌药物应用有一定的参考价值。在局部感染时，PCT一般轻度升高，而CRP升高相对明显，在没有全身表现的感染时,CRP可能是一个重要的观察指标。
然而，目前市面上仅有南京基蛋生物科技有限公司发明的定性用的PCT/CRP联合检测免疫层析试纸条(申请号为201210212105.4)，采用胶体金作为标记抗体的载体，来检测人全血、血浆、学清中的PCT和CRP。该试纸条采用的是定性的方法，只能给出阴性和阳性判断，无法给出明确的定量结果。方法学采用胶体金，灵敏度低。且试纸条的结构复杂：包括底衬、顺次搭接粘贴的样品垫、聚酯膜、包被膜和吸水纸。
另外，现有技术中还公开了一种PCT与CRP联合检测用上转发光材料(UCP)试纸条(申请号为201310257936.8)，该试纸条包括试纸条底衬，以及试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴的样品垫、涂覆有UCP生物标记物抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸，包被膜上设有一条包被兔抗鼠IgG抗体的控制线，包被膜上还设有与所述控制线平行的两条检测线，分别包被能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原CRP特异结合的抗体；所述UCP生物标记物抗体有两种，分别为上转发光材料(UCP)标记的能与待检抗原PCT特异性结合的抗体以及与待检抗原CRP特异结合的抗体。该试纸条结构复杂：包括底衬、顺次搭接粘贴的样品垫、聚酯膜、包被膜和吸水纸。且该试纸条采用的也是定性的方法，只能给出阴性和阳性判断，无法给出明确的定量结果。
本发明发明人经过反复试验发现，当用普通的荧光胶乳定量层析检测试纸条的结构套在PCT与CRP双项联检上时，CRP的线性范围只能达到0.1-40mg/L，同时CV值大于5，而正常检测要求CRP的线性范围必须是0.1-150mg/L，正常情况下CV值小于5，目前已控制到3以内；且使用普通结构的试纸条实现联检时，CRP检测中容易出现hook效应(钩状效应)，影响结果判断；而PCT检测对灵敏度的要求又极高；同时CRP检测的需样量少，PCT检测需样量多。因此，采用普通的试纸条结构并不能顺利实现CRP和PCT的联检。如何使PCT与CRP联合检测试纸条既能满足CRP的宽线性范围又能符合PCT的高灵敏度要求，是现有技术中一个难以解决的问题。且目前还没有可以定量联检PCT与CRP的产品。因此，发明一种既能满足CRP的宽线性范围又能符合PCT的高灵敏度的PCT与CRP定量联检试纸条很有必要。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条，包括底衬及设在所述底衬上的包被膜，所述包被膜上设有样品垫、包被线区和吸水纸，所述包被线区包括从靠近所述样品垫端至靠近所述吸水纸端依次平行设置、且相互间隔的包被荧光胶乳标记有CRP单克隆抗体、PCT单克隆抗体和羊抗鸡IgY抗体的标记线、包被鸡IgY抗体的质控线、包被能与待检抗原CRP特异性结合的另一株CRP单克隆抗体的CRP检测线、以及包被能与待检抗原PCT特异性结合的另一株PCT单克隆抗体的PCT检测线。
在其中一个实施例中，所述标记线上荧光胶乳标记的抗体采用包被缓冲液Ⅰ进行稀释，所述包被缓冲液Ⅰ包括：0.2％～3％BSA，5％～20％蔗糖，1％～5％海藻糖，0.2％～3％酪蛋白，0.1％～0.5％Tween-20，0.1～0.5％PVP，0.05～0.1％NaN3，余量为0.01～0.05M、pH7.4的PBS；所述质控线、CRP检测线、和PCT检测线上包被的抗体均采用包被缓冲液Ⅱ进行稀释，所述包被缓冲液Ⅱ包括：3％～5％甲醇，余量为0.01-0.05M、pH7.4的PBS。
在其中一些实施例中，所述包被膜为硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的爬速为95s～135s/4cm。
在其中一些实施例中，所述荧光胶乳标记的CRP单克隆抗体和荧光乳胶标记的PCT单克隆抗体的浓度均为0.5～2mg/ml，在试纸条上的用量均为0.02～0.1μg/cm2，按5％～30％的比例进行稀释；所述荧光乳胶标记的羊抗鸡IgY抗体的浓度为0.5～2mg/ml，按5％-15％的比例进行稀释，在试纸条上的用量为0.001～0.025μg/cm2。
在其中一些实施例中，所述质控线上包被的鸡IgY抗体的浓度为0.5～1mg/ml，用量为20μl/27～35cm；所述检测线上包被的CRP单克隆抗体和PCT单克隆抗体的浓度均为0.5～2mg/ml，用量均为20μl/27～35cm。
在其中一个实施例中，所述待检抗原CRP为人CRP，所述待检抗原PCT为人PCT。
在其中一个实施例中，所述包被线区还包括设置于PCT检测线与吸水纸之间的含有伊文斯兰染料的记号线。记号线可以减少工人在贴膜过程中的操作失误。所述记号线位于CRP与PCT检测线之后，记号线与质控线分别位于两条检测线的两端。前面的质控线还有利于避免仪器读数错误；后面的记号线一方面可起到标记作用，避免生产组装试纸条时颠倒出错，另一方面，当样本层析到记号线时，由于记号线是由染料构成，线上的染料会被样本冲散，褪去颜色，从而可根据记号线的有无，检验样本是否正常层析反应，与质控线一起起到双质控作用。
在其中一个实施例中，所述标记线、质控线、CRP检测线、PCT检测线和记号线之间的相互间隔为3～8mm。
在其中一个实施例中，所述荧光胶乳颗粒的直径为0.1μm～1μm，受激发后发射的波长为180nm～800nm。
本发明还提供了上述PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)、标记线的制备
用包被缓冲液Ⅰ稀释标记有CRP单克隆抗体的荧光胶乳、标记有PCT单克隆抗体的荧光胶乳和标记有羊抗鸡IgY抗体的荧光胶乳，将这三种标记抗体的胶乳混合，划线于包被膜上形成标记线；其中荧光胶乳标记的CRP单克隆抗体和荧光胶乳标记的PCT单克隆抗体的浓度均为0.5～2mg/ml，用量均为0.02～0.1μg/cm2；荧光胶乳标记的羊抗鸡IgY抗体的浓度为0.5～2mg/ml，用量为0.001～0.025μg/cm2；所述包被缓冲液Ⅰ中含有0.2％～3％BSA，5％～20％蔗糖，1％～5％海藻糖，0.2％～3％酪蛋白，0.1％～0.5％Tween-20，0.1～0.5％PVP，0.05～0.1％NaN3，余量为0.01～0.05M、pH7.4的PBS；
(2)、质控线和检测线的制备
用包被缓冲液Ⅱ稀释鸡IgY抗体、能与待检抗原CRP特异结合的不同于步骤(1)的CRP单克隆抗体的另一株CRP单克隆抗体、以及能与待检抗原PCT特异结合的不同于步骤(1)的PCT单克隆抗体的另一株PCT单克隆抗体，并将稀释后的三种抗体分别依次平行地划线于包被膜上形成质控线、CRP检测线和PCT检测线；其中，质控线包被的鸡IgY抗体的浓度为0.5～1mg/ml，用量为20μl/27～35cm；CRP检测线包被的CRP单克隆抗体的浓度为0.5～2mg/ml，用量为20μl/27～35cm；PCT检测线包被的PCT单克隆抗体的浓度为0.5～2mg/ml，用量为20μl/27～35cm；所述包被缓冲液Ⅱ中含有3％～5％甲醇，余量为0.01-0.05M、pH7.4的PBS；所述标记线、质控线、CRP检测线、PCT检测线之间相互间隔3～8mm；
(3)、包被膜的制备
将包被好标记线、质控线、CRP检测线、PCT检测线的包被膜置于湿度<30％的40～50℃的烘箱，干燥24～72h后，于2℃～30℃密封干燥平衡7天以上；
(4)、试纸条的制备
在底衬上搭接粘贴包被膜，在包被膜靠近标记线的一端搭接粘贴样品垫，在包被膜靠近PCT检测线的一端搭接粘贴吸水纸，即得。
在其中一个实施例中，所述试纸条的制备方法还包括记号线的制备步骤：用纯净水将伊文斯兰染料按0.5％～2％的稀释比稀释后，于PCT检测线和吸水纸之间划线，形成记号线。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，所述荧光胶乳标记抗体的制备步骤为：将常规方法共价活化后的荧光胶乳超声波200W～400W处理20～30秒后，按照50～200μg标记抗体/100μl荧光胶乳的比例加入CRP单克隆抗体、PCT单克隆抗体和羊抗鸡IgY抗体，混匀后室温搅拌反应2小时，离心洗涤3次，每次10000～15000xg、离心10分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30秒，用PBS-TBN恢复离心前体积，4℃保存，备用。
本发明发明人通过换用不同材料的结合垫等方法都不能实现本发明的发明目的。最后撤掉结合垫，直接将材料包被在包被膜上，并改用特殊的包被缓冲液，再通过包被参数的逐一调配，最终使CRP线性范围达到0.1-150mg/L，同时也符合了PCT灵敏度高的要求。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
1、本发明的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条简化了普通试纸条的结构，通过去掉传统试纸条中荧光乳胶标记抗体得以固化的结合垫，将荧光乳胶标记的抗体改为固化在包被膜上，从而提高了测试的精密度，并降低了标记抗体的用量，最终降低了试纸条成本。
2、本发明的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条利用特殊的包被缓冲液将荧光乳胶标记的抗体固化在包被膜上，固化后能有效的促使标记胶乳在层析过程中的释放，从而有利于提高测试的精密度。
3、本发明的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条与普通试纸条的硝酸纤维素包被膜的爬速并不一样，可以有效防止信号峰出现本底前翘，使测试结果的精密度更高。
4、本发明的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条PCT与CRP检测线设在质控线后面，而不是在质控线前面，与普通试纸条的检测线和质控线位置设定并不相同，这有利于确保降低仪器扫描荧光信号时出错的风险；若将PCT或CRP检测线设于质控线之前，当较为靠近标记线的检测线的结果为阴性，没有荧光信号聚集时，同时，反应后的标记线上也没有明显的荧光信号聚集，两线的信号曲线较为类似，因此荧光检测仪进行信号扫描时可能会受标记线的荧光信号影响取错信号值，进而读错数据；而将质控线设在PCT或CRP检测线之前时，由于质控线可捕获荧光信号，质控线处会产生明显的信号峰，如质控线后面的检测线结果为阴性，则由于质控线和该检测线的荧光信号值相差较大，仪器较容易将两者分辨开，读取正确的波段荧光信号值；反之，如质控线后的检测线结果为阳性，则质控线和该检测线处荧光信号强度大，均会出现明显荧光信号峰，也易于仪器判读取值。
5、本发明的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条可以实现定量检测人全血、血浆和血清里的PCT和CRP，PCT的检测范围是0.1～100ng/ml，CRP的检测范围是0.1～150mg/L；PCT的灵敏度达到0.1ng/ml，CRP灵敏度达到0.1mg/L。
6、本发明的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条解决了CRP取样量过少不易操作的问题，检测时间短，只需15min。
附图说明
图1为本发明实施例1的PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条的结构示意图；
图2为本发明实施例6中PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条与对照试剂测试相同临床样本时，两者PCT与CRP相关性图；
图3为本发明试验例2中两种包被液配方对CRP与PCT的热破坏稳定性的影响图；
图4为本发明试验例3中普通用膜和本发明的硝酸纤维素膜对测试结果的影响图；
图5为本发明试验例4中CRP检测线和PCT检测线孰前孰后对标准曲线的比较图；其中P-C表示PCT检测线在前，CRP检测线在后；C-P表示CRP检测线在前，PCT检测线在后；
附图标记：1、底衬；2、包被膜；3、样品垫；4、吸水纸；5、标记线；6、质控线；7、CRP检测线；8、PCT检测线；9、记号线。
具体实施方式
以下通过附图和具体实施例来详细说明本发明。
以下实施例中所使用的原料如无特别说明，均来源于市售。
实施例1PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条及其制备方法
如图1所示，为本发明的PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条的结构示意图。一种PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条，包括底衬1及设在所述底衬1上的包被膜2，所述包被膜2上设有样品垫3、包被线区和吸水纸4，包被线区包括靠近所述样品垫3端至靠近所述吸水纸4端依次平行设置、且相互间隔的包被荧光胶乳标记有CRP单克隆抗体、PCT单克隆抗体和羊抗鸡IgY抗体的标记线5、包被鸡IgY抗体的质控线6、包被能与待检抗原CRP特异性结合的另一株CRP单克隆抗体的CRP检测线7、以及包被能与待检抗原PCT特异性结合的另一株PCT单克隆抗体的PCT检测线8、以及含有伊文斯兰染料的记号线9。
在该实施例中，所述包被膜2为爬速在95s/4cm的硝酸纤维素膜。
该实施例的PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条的制备方法如下，包括以下步骤：
1.荧光胶乳的共价活化
超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×1012/ml，15000xg离心10分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水或者100mMpH6.0磷酸钠溶液溶解，并超声波200W处理30秒；先加入50μl的100mg/mlEDC，震荡混匀，再加入50μl的50mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sμlfo-NHS)，震荡混匀；室温孵育30分钟后15000xg、离心15分钟，沉淀用100mM、pH6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置在2～8℃条件下备用；
2.荧光胶乳微粒标记蛋白的制备
将活化后的荧光胶乳超声波200W处理30秒后，按照50μg标记抗体/100μl荧光胶乳的比例加入羊抗鸡IgY抗体(购自CELLWAY-LAB公司)、PCT单克隆抗体(购自Hytest公司)、CRP单克隆抗体(购自Hytest公司)，混匀后室温搅拌反应2小时，离心洗涤3次，每次15000xg、离心10分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30秒，用PBS-TBN恢复离心前体积，4℃保存，备用；
3.制备硝酸纤维素包被膜
a.标记线的制备
用包被缓冲液Ⅰ稀释标记有CRP单克隆抗体的荧光胶乳、标记有PCT单克隆抗体的荧光胶乳和标记有羊抗鸡IgY抗体的荧光胶乳，将这三种标记抗体的胶乳混合，划线于硝酸纤维素膜上。荧光胶乳标记的CRP单克隆抗体的浓度为0.5mg/ml，按15％的稀释比，0.02μg/cm2的用量划线在试纸条上；荧光胶乳标记的PCT单克隆抗体的浓度为0.5mg/ml，按15％的稀释比，0.02μg/cm2的用量划线在试纸条上；荧光胶乳标记的羊抗鸡IgY抗体的浓度为0.5mg/ml，按5％的稀释比，0.001μg/cm2的用量划线在试纸条上。(包被缓冲液Ⅰ的制备：含有0.2％BSA，5％蔗糖，1％海藻糖，0.2％酪蛋白，0.1％Tween-20，0.1％PVP，0.05％NaN3，余量为0.01M、pH7.4的PBS，用0.22μm滤膜过滤，置于4℃备用，有效期30天。)
b.质控线和检测线的制备：用包被缓冲液Ⅱ稀释鸡IgY抗体(购自CELLWAY-LAB公司)以及能与待检抗原之一特异结合的另一单克隆抗体(购自Hytest公司)，并将稀释后的三种抗体分别依次平行地划线于硝酸纤维素膜上，所述质控线靠近标记线。质控线包被的鸡IgY抗体的浓度为0.5mg/ml，用量为20μl/27-35cm，CRP检测线包被的CRP单克隆抗体的浓度为0.5mg/ml，用量为20μl/27-35cm，PCT检测线包被的PCT单克隆抗体的浓度为0.5mg/ml，用量为20μl/27-35cm。(包被缓冲液Ⅱ的制备：将3％甲醇，余量为0.01M、pH7.4的PBS，用0.22μm滤膜过滤，置于4℃备用，有效期30天)
c.记号线的制备：用纯净水将伊文斯兰染料按2％的稀释比稀释，稀释后划线于硝酸纤维素膜上，所述记号线靠近PCT检测线。
标记线、质控线、CRP检测线、PCT检测线与记号线相互间隔3mm。
将包被好的硝酸纤维素膜置于湿度<30％的50℃的烘箱，干燥72h后，于2℃～30℃密封干燥平衡7天以上封袋备用。
4.制备试纸条
在底衬1上搭接粘贴包被膜2，在包被膜2靠近标记线5的一端搭接粘贴样品垫3，在包被膜2靠近记号线9的一端搭接粘贴吸水纸4，得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。
实施例2PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条及其制备方法
该实施例的试纸条的结构与实施例1的试纸条的结构相同。不同之处在于，在该实施例中，所述包被膜2为爬速在110s/4cm的硝酸纤维素膜。
该实施例的PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条的制备方法如下，包括以下步骤：
1.荧光胶乳的共价活化
同实施例1。
2.荧光胶乳微粒标记蛋白的制备
同实施例1。
3.制备硝酸纤维素包被膜
a.标记线的制备
用包被缓冲液Ⅰ稀释标记有CRP单克隆抗体的荧光胶乳、标记有PCT单克隆抗体的荧光胶乳和标记有羊抗鸡IgY抗体的荧光胶乳，将这三种标记抗体的胶乳混合，划线于硝酸纤维素膜上。荧光胶乳标记的CRP单克隆抗体的浓度为1mg/ml，按20％的稀释比，0.1μg/cm2的用量划线在试纸条上；荧光胶乳标记的PCT单克隆抗体的浓度为1mg/ml，按20％的稀释比，0.1μg/cm2的用量划线在试纸条上；荧光胶乳标记的羊抗鸡IgY抗体的浓度为1.0mg/ml，按10％的稀释比，0.025μg/cm2的用量划线在试纸条上。(包被缓冲液Ⅰ的制备：含有2％BSA，10％蔗糖，3％海藻糖，1％酪蛋白，0.2％Tween-20，0.3％PVP，0.09％NaN3，余量为0.02M、pH7.4的PBS，用0.22μm滤膜过滤，置于4℃备用，有效期30天。)
b.质控线和检测线的制备
将用包被缓冲液Ⅱ稀释后的三种抗体分别依次平行地划线于硝酸纤维素膜上，所述质控线靠近标记线。质控线包被的鸡IgY抗体的浓度为0.8mg/ml，用量为20μl/27-35cm，CRP检测线包被的CRP单克隆抗体的浓度为1.0mg/ml，用量为20μl/27-35cm，PCT检测线包被的PCT单克隆抗体的浓度为1.0mg/ml，用量为20μl/27-35cm。(包被缓冲液Ⅱ的制备：将4％甲醇，余量为0.03M、pH7.4的PBS，用0.22μm滤膜过滤，置于4℃备用，有效期30天)
c.记号线的制备
用纯净水将伊文斯兰染料按1％的稀释比稀释，稀释后划线于硝酸纤维素膜上，所述记号线靠近PCT检测线。
标记线、质控线、CRP检测线、PCT检测线与记号线相互间隔5mm。
将包被好的硝酸纤维素膜置于湿度<30％的50℃的烘箱，干燥72h后，于2℃～30℃密封干燥平衡7天以上封袋备用。
4.制备试纸条
同实施例1。
实施例3PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条及其制备方法
该实施例的试纸条的结构与实施例1的试纸条的结构相同。不同之处在于，在该实施例中，所述包被膜2为爬速在135s/4cm的硝酸纤维素膜。
该实施例的PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条的制备方法如下，包括以下步骤：
1.荧光胶乳的共价活化
同实施例1。
2.荧光胶乳微粒标记蛋白的制备
同实施例1。
3.制备硝酸纤维素包被膜
a.标记线的制备
用包被缓冲液Ⅰ稀释标记有CRP单克隆抗体的荧光胶乳、标记有PCT单克隆抗体的荧光胶乳和标记有羊抗鸡IgY抗体的荧光胶乳，将这三种标记抗体的胶乳混合，划线于硝酸纤维素膜上。荧光胶乳标记的CRP单克隆抗体的浓度为2mg/ml，按30％的稀释比，0.1μg/cm2的用量划线在试纸条上；荧光胶乳标记的PCT单克隆抗体的浓度为2mg/ml，按30％的稀释比，0.1μg/cm2的用量划线在试纸条上；荧光胶乳标记的羊抗鸡IgY抗体的浓度为2mg/ml，按15％的稀释比，0.025μg/cm2的用量划线在试纸条上。(包被缓冲液Ⅰ的制备：含有3％BSA，20％蔗糖，5％海藻糖，3％酪蛋白，0.5％Tween-20，0.5％PVP，0.1％NaN3，余量为0.05M、pH7.4的PBS，用0.22μm滤膜过滤，置于4℃备用，有效期30天。)
b.质控线和检测线的制备
将用包被缓冲液Ⅱ稀释后的三种抗体分别依次平行地划线于硝酸纤维素膜上，所述质控线靠近标记线。质控线包被的鸡IgY抗体的浓度为1mg/ml，用量为20μl/27-35cm，CRP检测线包被的CRP单克隆抗体的浓度为2mg/ml，用量为20μl/27-35cm，PCT检测线包被的PCT单克隆抗体的浓度为2mg/ml，用量为20μl/27-35cm。(包被缓冲液Ⅱ的制备：将5％甲醇，余量为0.05M、pH7.4的PBS，用0.22μm滤膜过滤，置于4℃备用，有效期30天)
c.记号线的制备
用纯净水将伊文斯兰染料按0.5％的稀释比稀释，稀释后划线于硝酸纤维素膜上，所述记号线靠近PCT检测线。
标记线、质控线、CRP检测线、PCT检测线与记号线相互间隔8mm。
将包被好的硝酸纤维素膜置于湿度<30％的50℃的烘箱，干燥72h后，于2℃～30℃密封干燥平衡7天以上封袋备用。
4.制备试纸条
同实施例1。
实施例4PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条
在该实施例中，PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳设有两个开孔，加样孔和显示窗，加样孔对应于实施例1所述的PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条的样品垫3，结果显示窗则对应于试纸条的质控线6、检测线7、检测线8和记号线9，在使用时，从该塑料外壳中取出所述试纸条。
实施例5测试实施例1所述的PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条的荧光定量光谱检测系统
在该实施例中，设置有用来测试实施例1所述的PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条的荧光定量光谱检测系统，主要包含荧光光源系统、检测系统及自动软件分析控制系统。
荧光光源系统发出单色激发光，照射在试纸条的检测线7和8，检测线7和8通过反应凝集的荧光胶乳在激发光的作用下，发射出荧光信号，该荧光信号被检测系统捕获，检测系统由光电倍增管和固态检测器组成，检测系统接收入射荧光信号，由光电倍增管实现光信号的放大，然后由固态检测器将光信号转换为电信号，由电信号读出电路将电信号输出，再经过自动软件分析控制系统处理，在显示屏上显示结果。实现对样本的精确定量。
对CRP进行测定时，采用德灵公司的DN-100特种蛋白分析仪做检测标准，对PCT进行测定时，采用梅里埃公司的VIDAS做检测标准。表1为采用本发明实施例1的试纸条对部分样品进行定量测定的结果。
表1采用本发明实施例1的试纸条对样本的定量测试结果
从表1可知，采用实施例1的试纸条对样本进行测定时，可以得到与检测标准相当的结果，说明本发明的试纸条可以实现准确定量测定。
实施例6实施例1的PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条的性能测定
对试剂条进行了性能方面的测定，包括最低检测限和精密度。
1、相关性及最低检测限分析
如图2所示，CRP以德灵公司的DN-100特种蛋白分析仪测试400份临床样本(全血/血清/血浆)，两种产品结果相关系数R2＞0.99；PCT以梅里埃公司的VIDAS做检测标准测试400份临床样本(全血/血清/血浆)，两种产品结果相关系数R2＞0.97，因此，该实施例的PCT与CRP定量联合检测免疫层析试纸条跟对照试剂的相关性好；CRP的最低检测限(最低检测限＝阴性测试值+2SD)为0.1mg/L，PCT的最低检测限(最低检测限＝阴性测试值+2SD)为0.1ng/ml。
2、精密度
在精密度方面，采用实施例1的试纸条对含量分别为高值、低值和中值的样本，连续检测至少10次，计算变异系数(CV)。
对于CRP含量高值(99.9mg/L)、中值(5.4mg/L)、低值(0.44mg/L)血液样本各一例分别测定10次，根据其测定数据，利用SPSS统计酸碱分析得(批内CRP重复测定结果以均值±标准差表示)高值(100.48±8.72)mg/L，CV2.2％；中值(5.41±0.52)mg/L，CV3.3％；低值(0.43±0.06)mg/L，CV2.1％；检验结果CV值均小于15％；
对于PCT含量高值(79ng/ml)、中值(5ng/ml)、低值(0.35ng/ml)血液样本各一例分别测定10次，根据其测定数据，利用SPSS统计酸碱分析得(批内PCT重复测定结果以均值±标准差表示)高值(78.93±9.51)ng/ml，CV3.2％；中值(5.18±0.60)ng/ml，CV3.5％；低值(0.36±0.06)ng/ml，CV2.3％；检验结果CV值均小于15％。
以上结果说明实施例1的试纸条的精密度良好。
试验例1本发明的试纸条与普通试纸条的优异性试验
现有技术中，标记胶乳都固定在普通试纸条的结合垫上，而本发明的试纸条则选择固定在硝酸纤维素包被膜上。对两者的精密度、成本、及结构方面进行了比较，比较结果分别如下所述：
1、精密度
比较标记胶乳固化在传统的结合垫和硝酸纤维素包被膜上，两者的精密度，结果如表2所示。
表2标记胶乳固化在结合垫和包被膜上的精密度比较
从表2结果可知，固化在包被膜上CRP与PCT的平均CV小于3，固化在结合垫上CRP与PCT的平均CV大于5，因此标记胶乳固化在硝酸纤维素包被膜上，精密度更高。
2成本
比较标记胶乳固化在传统的结合垫和硝酸纤维素包被膜上，两者的成本，结果如表3所示。
表3标记胶乳固化在结合垫和包被膜上的成本比较
结合垫 硝酸纤维素包被膜
标记胶乳的用量 0.04μg(标记胶乳)/条 0.004μg(标记胶乳)/条
从表3结果可知，标记胶乳固化在硝酸纤维素包被膜上，成本仅为固化在结合垫上的十分之一。
3结构
传统的试纸条结构包括：底衬、顺次搭接粘贴的样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸；而本发明的试纸条省去了结合垫，整个试纸条的构成仅包括底衬、样品垫、包被膜和吸水纸，因此，结构更为简单。
试验例2包被液配方对本发明的试纸条的影响
传统试纸条中，将荧光乳胶标记抗体包被在结合垫上时，进行稀释的包被液配方为：0.5％BSA，2％海藻糖，0.1％TritonX-100，0.2％PEG-20000，0.3％FSG，0.09％NaN3，0.01M、pH7.8的PBS。而本发明中，将将荧光乳胶标记抗体包被在包被膜上时，进行稀释的包被液配方为：0.2％～3％BSA，5％～20％蔗糖，1％～5％海藻糖，0.2％～3％酪蛋白，0.1％～0.5％Tween-20，0.1～0.5％PVP，0.05～0.1％NaN3，余量为0.01～0.05M、pH7.4的PBS。在该试验例中，包被液的配方为：0.2％BSA，20％蔗糖，5％海藻糖，0.2％酪蛋白，0.1％Tween-20，0.5％PVP，0.05％NaN3，余量为0.01～0.05M、pH7.4的PBS。
本试验例比较了两种包被液配方对CRP与PCT热破坏稳定性的影响，结果见图3。从图3可以看出，本发明所采用的包被液与现有技术的包被液相比，拥有更好的热破坏稳定性。因此，使得荧光乳胶固化后能有效的促使标记胶乳在层析过程中的释放，从而有利于提高测试的精密度。
试验例3包被膜材料对本发明的试纸条的影响
现有技术中，普通用膜的爬速是135s～180s/4cm，而本发明的试纸条采用爬速为95s～135s/4cm的硝酸纤维素膜作为包被膜。
本试验例比较了现有技术的普通用膜和本发明的硝酸纤维素膜对测试结果的影响。结果见图4所示。从图4可以看出，采用普通用膜，信号峰会出现本底前翘，最终影响测试结果。
试验例4质控线和检测线位置的确定
本试验例考察了质控线和两条检测线位置对结果的影响，结果见图5，从图5A和图5B可以看到；T(CRP)检测线在前，T(PCT)检测线在后，可以让CRP和PCT拥有更好的线性范围。而质控线置于检测线之前可以消除在样本特殊的情况下由于本底前翘导致T检测峰扫描出错的风险。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条，其特征在于，包括底衬及设在所述底衬上的包被膜，所述包被膜上设有样品垫、包被线区和吸水纸，所述包被线区包括从靠近所述样品垫端至靠近所述吸水纸端依次平行设置的、且相互间隔的包被荧光胶乳标记有CRP单克隆抗体、PCT单克隆抗体和羊抗鸡IgY抗体的标记线、包被鸡IgY抗体的质控线、包被能与待检抗原CRP特异性结合的另一株CRP单克隆抗体的CRP检测线、以及包被能与待检抗原PCT特异性结合的另一株PCT单克隆抗体的PCT检测线。
2.根据权利要求1所述的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条，其特征在于，所述标记线上包被的荧光胶乳标记抗体采用包被缓冲液Ⅰ进行稀释，所述包被缓冲液Ⅰ包括：0.2％～3％BSA，5％～20％蔗糖，1％～5％海藻糖，0.2％～3％酪蛋白，0.1％～0.5％Tween-20，0.1～0.5％PVP，0.05～0.1％NaN3，余量为0.01～0.05M、pH7.4的PBS。
3.根据权利要求1所述的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条，其特征在于，所述包被膜为硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的爬速为95s～135s/4cm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光胶乳标记的CRP单克隆抗体和荧光乳胶标记的PCT单克隆抗体的浓度均为0.5～2mg/ml，按10％～30％的比例进行稀释，在试纸条上的用量均为0.02～0.1μg/cm2；所述荧光乳胶标记的羊抗鸡IgY抗体的浓度为0.5～2mg/ml，按5％～15％的比例进行稀释，在试纸条上的用量为0.001～0.025μg/cm2。
5.根据权利要求1-3任一项所述的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条，其特征在于，所述质控线上包被的鸡IgY抗体的浓度为0.5～1mg/ml，用量为20μl/27～35cm；所述检测线上包被的CRP单克隆抗体和PCT单克隆抗体的浓度均为0.5～2mg/ml，用量均为20μl/27～35cm。
6.根据权利要求1-3任一项所述的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条，其特征在于，所述待检抗原CRP为人CRP，所述待检抗原PCT为人PCT。
7.根据权利要求1-3任一项所述的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条，其特征在于，所述包被线区还包括设置于PCT检测线和吸水纸之间的含有伊文斯兰染料的记号线。
8.一种PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、标记线的制备
用包被缓冲液Ⅰ稀释标记有CRP单克隆抗体的荧光胶乳、标记有PCT单克隆抗体的荧光胶乳和标记有羊抗鸡IgY抗体的荧光胶乳，将这三种标记抗体的胶乳混合，划线于包被膜上形成标记线；其中荧光胶乳标记的CRP单克隆抗体和荧光胶乳标记的PCT单克隆抗体的浓度均为0.5～2mg/ml，用量均为0.02～0.1μg/cm2；荧光胶乳标记的羊抗鸡IgY抗体的浓度为0.5～2mg/ml，用量为0.001～0.025μg/cm2；所述包被缓冲液Ⅰ中含有0.2％～3％BSA，5％～20％蔗糖，1％～5％海藻糖，0.2％～3％酪蛋白，0.1％～0.5％Tween-20，0.1～0.5％PVP，0.05～0.1％NaN3，0.01～0.05M、pH7.4的PBS；
(2)、质控线和检测线的制备
用包被缓冲液Ⅱ稀释鸡IgY抗体、能与待检抗原CRP特异结合的不同于步骤(1)的CRP单克隆抗体的另一株CRP单克隆抗体、以及能与待检抗原PCT特异结合的不同于步骤(1)的PCT单克隆抗体的另一株PCT单克隆抗体，并将稀释后的三种抗体分别依次平行地划线于包被膜上形成质控线、CRP检测线和PCT检测线；其中，质控线包被的鸡IgY抗体的浓度为0.5～1mg/ml，用量为20μl/27～35cm；CRP检测线包被的CRP单克隆抗体的浓度为0.5～2mg/ml，用量为20μl/27～35cm；PCT检测线包被的PCT单克隆抗体的浓度为0.5～2mg/ml，用量为20μl/27～35cm；所述包被缓冲液Ⅱ中含有3％～5％甲醇，0.01-0.05M、pH7.4的PBS；
(3)、包被膜的制备
将包被好标记线、质控线、CRP检测线、PCT检测线的包被膜置于湿度<30％的40～50℃的烘箱，干燥24～72h后，于2℃～30℃密封干燥平衡7天以上；
(4)、试纸条的制备
在底衬上搭接粘贴包被膜，在包被膜靠近标记线的一端搭接粘贴样品垫，在包被膜靠近PCT检测线的一端搭接粘贴吸水纸，即得。
9.根据权利要求8所述的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述试纸条的制备方法还包括记号线的制备步骤：用纯净水将伊文斯兰染料按0.5％～2％的稀释比稀释后，于PCT检测线与吸水纸之间划线，形成记号线。
10.根据权利要求8所述的PCT与CRP定量联检免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，荧光胶乳标记抗体的制备步骤为：将常规方法共价活化后的荧光胶乳超声波200W～400W处理20～30秒后，按照50～200μg标记抗体/100μl荧光胶乳的比例加入CRP单克隆抗体、PCT单克隆抗体和羊抗鸡IgY抗体，混匀后室温搅拌反应2小时，离心洗涤3次，每次10000～15000xg、离心10分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30秒，用PBS-TBN恢复离心前体积，4℃保存。
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