CN113215107A

CN113215107A - 一种检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN113215107A
Application number: CN202110722998.6A
Authority: CN
Inventors: 黄若磐; 徐部灼; 宋旭东; 罗树红
Original assignee: Reboo Guangzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Reboo Guangzhou Biotechnology Co ltd; Raybiotech Inc
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2041-06-28
Also published as: CN113215107B

Abstract

本发明涉及一种检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫试剂盒及其制备方法，其中杂交瘤细胞株COVID19‑SRBD‑8，保藏编号为CCTCC No：C202167。该杂交瘤细胞制备得到的SARS‑CoV‑2 S1‑RBD单克隆抗体具有高度特异、灵敏度高、效价高等特性，其和市售新型冠状病毒单克隆抗体，能分别识别SARS‑CoV‑2S1‑RBD抗原的不同表位，两者在制备颗粒结合物和充当硝酸纤维素膜上的捕获剂方面具有良好的表现效果，基于其制备得到的试纸条实现了对常规样本中的新型冠状病毒定量检测，且重复性好、精密度强、灵敏度高，还发现其与核酸检测结果有很高的阴阳性符合率，预示其具有良好的临床应用前景。

Description

一种检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫试剂盒及其制备方法。

背景技术

抗体的功能取决于其与抗原结合的表面位点。抗体因结合表面位点不同而发挥特定的功能，如激活或抑制活性。了解抗体识别位点有助于评价抗原检测的精准度。而丰富表面位点的对照抗体，也常用于疫苗效果评估。因此，筛选不同位点抗体，可应用于新型冠状病毒检测及疫苗保护效力评估等方面。

SARS-Cov-2属于单股正链RNA病毒，基因组分为非结构基因和结构基因。其中非结构基因含有两个开放阅读框（ORF1a和ORF1b），编码16个非结构蛋白（Nsp1到16），而结构基因则编码4个蛋白：S、E、M、N。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)四种主要的结构蛋白：刺突蛋白（Spike protein，S蛋白），核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N蛋白），膜蛋白（Membrane protein，M蛋白），包膜蛋白（Envelope protein，E蛋白）。新型冠状病毒刺突蛋白S蛋白有两个亚基：S1和S2，受体结合位点（RBD）位于S1亚基上。它以三聚体的形式组成病毒粒子外膜表面的刺突，其主要功能是识别宿主细胞表面受体，介导与宿主细胞的融合。

由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的COVID-19大流行在世界各地肆虐，并造成数百万住院和死亡。全世界的政府和组织一直在史无前例地努力控制其进一步扩散并减轻其对人类生命和经济大屠杀的巨大破坏。需要有效地控制许多工具和策略的组合。最有效的方法之一是快速筛选，检测和隔离感染者。这种检测/隔离策略使得非常需要简单，便携式和低成本的检测工具来提供快速的结果，以便可以立即识别和隔离受感染的人。

关于SARS-CoV-2的检测和实验室测试方法的许多评论已经发表。当前有三种主要的检测方法已经在紧急使用授权下商业化。他们每个人都有自己的优点和局限性。最广泛使用的诊断检测方法是基于病毒核酸的检测，例如实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和环介导的等温扩增。一方面，它们是高度敏感和特异的，另一方面，它们通常很昂贵并且提供结果的速度很慢。在当前情况下，RT-PCR需要两到三天的周转时间。如果感染者继续从事某些类型的社交活动，并有可能在采样时间和检测结果报告之间将SARS-CoV-2传播给其他人，则这是不可接受的。对于非传染性场景的这种积极检测结果给受影响的人带来了不必要的负担。

血清抗体检测是另一种已广泛使用的检测。已经开发和发表了大量基于免疫色谱分析的快速血清学检测方法。他们不是检测SARS-CoV-2病毒的遗传特征，而是检测由对SARS-CoV-2的免疫应答产生的抗体。它们主要基于免疫测定，并且通常便宜且易于使用。它们对于筛查，跟踪和监视暴露于SARS-CoV-2的人员非常有用。通常，直到感染的相对晚期才在被感染的人中产生IgM或IgG抗体。IgM通常在受感染的人中出现较早，并随着IgG的增加而逐渐降低。这些血清学检测很可能为感染早期的人提供阴性结果。错误的负面结果会给人以错误的安全感，并可能导致结果扩散更大。

第三类测试是抗原测试。抗原测试方法主要通过免疫测定法检测SARS-CoV-2的一种或多种特征蛋白。两种主要的特征蛋白，刺突蛋白（S蛋白）和核衣壳（N蛋白）已被用作抗原检测的靶标。已经开发了许多测试方法，并在文献中进行了报道，以检测和定量SARS-CoV-2抗原。这些方法包括基于化学发光的免疫分析和基于电化学发光的免疫分析（来自Roche的Elecsys-SARS-Cov-2 Antigen test）。一种特别流行的测试类型是用于检测SARS-CoV-2抗原的免疫色谱免疫测定法（侧向流免疫测定法）。它们通常便宜且易于使用，并提供快速的结果。但是，它们的敏感性有限，通常应仅用作筛查工具，而不能用于最终诊断。快速的旁流抗原测试对于有限资源的设置和即时医疗设置特别有用。

除了上述三种主要的测试方法外，还报道了许多新的检测技术。基于生物传感器的检测方法特别有趣，因为在某些情况下，它们有潜力提供快速而灵敏的检测而不会破坏样品。但是，它们仍处于早期开发阶段，目前还不够成熟，无法在对抗SARS-CoV-2大流行中发挥任何主要作用。基于荧光的检测技术已广泛用于基于核酸的测定和免疫测定。与依靠荧光信号和背景噪声（例如，激发光子的散射光，样品基质的自发荧光）之间的波长差异进行信号收集的传统荧光检测方法相比，TRF检测技术利用了硅的长寿命荧光信号和短寿命背景噪声之间的寿命差进行检测。与传统的荧光检测技术相比，TRF检测技术具有许多优势。它们通常具有较低的背景和较高的信噪比，因此当信号荧光的寿命远长于背景时，可能会导致更高的检测灵敏度。众所周知，TRF检测技术通常可以达到比常规荧光技术更高的信噪比，最高可达两个数量级。与常规的荧光检测技术不同，TRF检测技术可能不需要通过简单地使用低成本的电子元件就可以进行信号噪声分离的昂贵的带通滤光器。如果可以使用长寿命的荧光探针，则可以构建更便宜，更小巧的便携式TRF阅读器来测量TRF信号。

对于任何基于免疫测定的测试方法，抗体对目标抗原的强结合强度和高特异性是确定测试总体性能（例如灵敏度和特异性）的最重要特征之一。免疫法检测灵敏度和特异性与相应制备的抗体、抗原特异性密切相关，另外，用于信号产生的检测方法对于检测灵敏度和准确性，特别是对于定量检测，也至关重要。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种能稳定分泌针对新型冠状病毒S1RBD蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

具体技术方案如下：

一种杂交瘤细胞株COVID19-SRBD-8，所述细胞株的保藏编号为CCTCC No：C202167。

本发明的目的之一还在于提供一种单克隆抗体。

实现上述目的的技术方案如下：

一种单克隆抗体，其由上述杂交瘤细胞株COVID19-SRBD-8分泌产生。

在其中一些实施例中，上述单克隆抗体是以SARS-CoV-2S1RBD重组蛋白为免疫原，免疫小鼠得到的单克隆抗体；所述SARS-CoV-2S1RBD重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为SEQ ID NO.1经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。

本发明的目的之一还在于提供上述杂交瘤细胞株COVID19-SRBD-8在制备新型冠状病毒检测试剂和/或药物中的应用。

本发明的目的之一还在于提供单克隆抗体在制备新型冠状病毒检测试剂和/或药物中的应用。

在其中一些实施例中，采用上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞制备的新型冠状病毒检测试剂可以通过常规的免疫学检测实现，免疫学检测方法的原理基于抗原抗体结合反应，例如免疫检测方法中的酶联免疫检测方法或免疫层析技术，免疫组化法，或蛋白质印迹法（western blot）、免疫渗滤法、蛋白芯片法等等。为了快速检测，优选地，选择酶联免疫检测方法、化学发光免疫测定技术或免疫层析技术。

本发明的目的之一还在于提供一种新型冠状病毒检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下：

一种新型冠状病毒检测试剂盒，其制备原料包括上述单克隆抗体。

在其中一些实施例中，上述试剂盒包括用于新型冠状病毒检测的试纸条。

在其中一些实施例中，上述试纸条包括底板以及沿所述底板的长度方向顺次粘覆于所述底板上的样品垫、包被膜和吸水纸，其中，所述结合垫上喷有标记抗体，所述标记抗体为荧光微球标记鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG抗体，所述包被膜上设置有相间隔的由山羊抗兔IgG抗体包被形成的质控线和由上述单克隆抗体包被形成的检测线；或，所述样品垫上喷有标记抗体，所述标记抗体为荧光微球标记的上述单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG抗体，所述包被膜上设置有相间隔的由山羊抗兔IgG抗体包被形成的质控线和由鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体包被形成的检测线。

在其中的一些实施例中，上述质控线靠近所述样品垫，所述检测线靠近所述吸水纸。

在其中的一些实施例中，上述样品垫上的标记抗体由标记抗体稀释液稀释，所述标记抗体稀释液包括：0.1M~0.3M NaH₂PO₄，0.1M~0.3MNa₂HPO₄，10%~30%海藻糖，1%~5%BSA，0.1%~2%酪蛋白，0.1%~1%TWEEN-20，0.1%~1%prociln300。

在其中的一些实施例中，上述荧光微球为Eu³⁺镧系元素荧光微球，所述荧光微球的直径为290nm-350nm。

在其中的一些实施例中，上述荧光微球标记的鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体浓度为0.1mg/ml-0.2mg/ml，所述荧光微球标记的兔IgG抗体浓度为0.05mg/ml-0.1mg/ml；上述荧光微球标记的鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体溶液按300μl-600μl//30cm×2.9cm喷涂至样品垫上。

在其中的一些实施例中，上述检测线和质控线上的包被抗体由包被抗体稀释液稀释，所述包被抗体稀释液包括质量百分比为0.1%-1.8%NaCl，0.01%-0.05%KCl，0.01%-0.3%NaHPO₄，0.01%-0.05%KH₂PO₄，1%-5%海藻糖，5%-15%蔗糖和0.01%-0.3%proclin300。

在其中的一些实施例中，上述检测线包被的权利要求2-3任一项所述单克隆抗体的浓度为1mg/ml-2mg/ml，按30μl-40μl/30cm划线至包被膜上；所述质控线包被的山羊抗兔IgG抗体的浓度为0.1mg/ml-0.5mg/ml，按30μl-40μl/30cm划线至包被膜上。

本发明的目的之一还在于提供一种SARS-CoV-2 S1-RBD抗原检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下：

一种SARS-CoV-2S1-RBD抗原检测试剂盒，其包括上述新型冠状病毒检测试纸条。

在其中一些实施例中，上述试剂盒还包括样品稀释液，所述样品稀释液，每800ml中包括8g-10gNa₂HPO₄、1g-3gNaH₂PO₄·2H₂O、6g-8gNaCl、1g-3g酪蛋白和0.1ml-2mlProclin300。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的发明人通过研究开发多种单克隆抗体，成功找到一种通过杂交瘤细胞制备得到的SARS-CoV-2 S1-RBD单克隆抗体，该抗体具有高度特异、灵敏度高、效价高等特性，对其杂交瘤细胞株进行生物保藏（保藏编号为CCTCC No：C202167），经进一步研究发现该单克隆抗体和市售新型冠状病毒单克隆抗体（Raybiotech. Life .Inc cat#130-10815），能分别识别SARS-CoV-2S1-RBD抗原的不同表位，两者在制备颗粒结合物和充当硝酸纤维素膜上的捕获剂方面都具有良好的表现效果。基于这对单克隆抗体制备得到的试纸条将时间分辨免疫层析技术引入新型冠状病毒的定量检测中，并对检测试纸条的技术参数进行了一系列改进优化，实现了对常规样本中的新型冠状病毒定量检测，且重复性好、精密度强、灵敏度高，检测试剂盒的检测灵敏度低于10pg/ml，并发现其与新型冠状病毒核酸检测结果有很高的阴阳性符合率，预示其具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1为实施例4中本发明试纸条喷垫位置示意图。

图2为实施例4中本发明试剂条组装的结构模式图。

图3为实施例6中本发明试剂盒SARS-CoV-2S1-RBD检测标准曲线建立图。

图4为实施例7中本发明试剂盒检测线性结果图。

图5为实施例7中本发明试剂盒钩状效应检测结果图。

图6为实施例8中本发明试剂盒测得的S1-RBD抗原水平（pg / ml）与逆转录PCR检测的箱形图。

图7为实施例8中本发明试剂盒测得的临床拭子样本中SARS-CoV-2 S1-RBD抗原的ROC曲线。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。

此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

本发明的杂交瘤细胞株COVID19-SRBD-8，已于2021年2月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072) ，保藏编号为CCTCCNo：C202167。

实施例1 SARS-CoV-2S1RBD抗原的制备

（1）pET28a-S1RBD重组载体的构建

根据Genbank中提供的SARS-CoV-2S1RBD的DNA序列（QHD43416），PCR法得到全长669 bp的S1RBD基因。该基因表达的S1RBD蛋白序列为223个氨基酸。其中蛋白序列具体如下所示：

SEQ ID NO.1：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF。

PCR法采用的引物序列如下：

引物1：agggtccaaccaacagagagc，SEQ ID NO.2；

引物2：gaagttcacacacttgttcttcac，SEQ ID NO.3。

通过PCR扩增得到SARS-CoV-2S1RBD的目的基因，将载体pET-28a及经过琼脂糖凝胶纯化的S1RBD1基因片段，得到重组质粒pET-28a-S1RBD，并连接产物转化进入大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选阳性克隆，小量制备质粒，测序结果表明重组的SARS-CoV-2S1RBD片段与设计的序列完全一致。

（2）SARS-CoV-2S1RBD重组蛋白的表达

经上述测序验证后的阳性质粒，转化进入大肠杆菌（BL21），在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，可在LB平板上挑选阳性克隆并进行常规质粒酶切鉴定，最终获得含有SARS-CoV-2S1RBD的重组质粒工程菌。

在表达时，将SARS-CoV-2S1RBD的重组质粒工程菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养，A600达到0.5-0.6之间，然后加入终浓度为0.5 mM的Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside（IPTG）于37℃诱导4 h，诱导完成后的菌液4,000 rpm离心10 min，收集菌体，并用PBS洗涤沉淀；PBS重悬沉淀后置于冰浴中，超声破菌后12000 rpm离心20min，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果表明：表达的SARS-CoV-2S1RBD重组蛋白为胞浆不可溶性表达，将该重组蛋白命名为BL21-S1RBD，分子量为35 kDa左右。

（3）BL21-S1RBD的纯化和定量

将大量表达得到的菌体，经超声破碎后离心，再进行包涵体洗涤，洗涤完成后用GEHealthcare公司的His Trap FF纯化柱将蛋白进行纯化（按照产品说明书进行试剂配制和纯化）。最终获得的蛋白用SDS-PAGE电泳进行分析，用BCA蛋白定量试剂盒测得其浓度为0.41 mg/ml。

实施例2 鼠抗SARS-CoV-2 S1RBD单克隆抗体的制备

（1）鼠抗SARS-CoV-2 S1RBD杂交瘤细胞株的建立及单抗亚型的鉴定

a. 免疫程序采用4次基础免疫和1次加强免疫。选用8周龄、体重18 g左右且健康的雌性BALB/c小鼠2只，适应性饲养1周后，采集其鼠尾血作为阴性对照用。

b. 采用中程免疫方案（0.3 ml/只，2周/次），首次免疫时（50 µg/只）按免疫原（上述重组蛋白BL21-S1RBD）与等体积的弗氏完全佐剂搅拌乳化，背部皮下多点注射，此后按免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂搅拌乳化进行常规免疫。

c. 3次免疫时，一般50 µg抗原与TiterMax（SIGMA）等量混合乳化后背部多点注射，7天后测效价。小鼠效价明显达到一定要求（大于阴性血清的检测值的2倍的最低抗原包被量）后加强免疫，加强免疫不加佐剂，加强免疫剂量为50μg，加强免疫后3天，摘眼球采血，分离血清保存。

d. 细胞融合时，将上述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞按4:1左右进行混合，并在聚乙二醇（PEG，分子量为1450）的促融作用下进行融合，融合细胞再HAT选择性培养液（ThermoFisher Scientific）中进行培养，10天后通过间接ELISA方法筛选出能与SARS-CoV-2S1RBD蛋白反应的阳性杂交瘤细胞，并将初筛得到的阳性杂交瘤细胞扩大培养，两天后进行标签蛋白（His-tag）杂交瘤细胞的排除，以复筛出针对SARS-CoV-2 S1RBD蛋白而非标签的杂交瘤细胞。

e. 用有限稀释法将获得的阳性杂交瘤细胞连续亚克隆至少两次以上，每次亚克隆用HT选择性培养基进行培养，亚克隆8-10天后进行ELISA筛选，直至单克隆细胞阳性率为100%为止，获得15株能稳定分泌抗BL21-S1RBD蛋白的单克隆抗体的细胞株。针对这些细胞株进行性能筛选实验。

首先采用间接ELISA筛选细胞株，检测结果分别如下表2-1、2-2所示，其中对照组为PBS缓冲液：

表2-1抗体效价测定（OD450）

表2-2抗体效价测定（OD450）

通过上述间接ELISA实验结果中可知，COVID19-SRBD-8细胞株对应的抗体经过320000倍稀释后，其检测值仍然比PBS对照大9倍。可见相同抗原制备的抗体的效价区别大，由细胞株COVID19-SRBD-8分泌产生的抗体具有高度特异、灵敏度高、效价高等特性。

为了获得更好的抗体对，我们进行如下交叉实验，获取细胞株COVID19-SRBD-1、COVID19-SRBD-5、COVID19-SRBD-8、COVID19-SRBD-9和COVID19-SRBD-11分泌的抗体，并于Raybiotech. Life .In购买鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体：130-10784，130-10798，130-10814，130-10815。将这9个抗体包被在96孔板上，孵育后洗涤，加入相同质量抗体，孵育后洗涤，再加入经过HRP标记的9个抗体两两配对，最后加入显色液。检测结果如下表2-3所示：

表2-3

综上所述，COVID-19-SRBD-8抗体与130-10815抗体为最佳抗体对。而COVID-19-SRBD-1，COVID-19-SRBD-5，COVID-19-SRBD-8, COVID-19-SRBD-9，COVID-19-SRBD-11几乎未能形成有效配对。通过抗原表位验证，得知COVID-19-SRBD-1，COVID-19-SRBD-5，COVID-19-SRBD-8，COVID-19-SRBD-9，COVID-19-SRBD-11是针对抗原N端表位的抗体。

f. 应用小鼠单克隆抗体亚型鉴定芯片试剂盒（购自美国Raybiotech公司）鉴定单抗亚型，按芯片试剂盒说明书将单克隆细胞株上清分别用DMEM无血清培养基进行80-100倍稀释，加入到阵列中，一个孔含有测定所有亚型的阵列，每个亚型有4次重复，结果显示：杂交瘤细胞COVID19-SRBD-8上清的抗体亚型为IgG。

经过上述筛选后，将能稳定分泌抗SARS-CoV-2-S1RBD（BL21-S1RBD）蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株COVID19-SRBD-8于2021年2月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072) ，保藏编号为CCTCC No：C202167。通过常规抗体分离纯化方法制备得到单克隆抗体（鼠抗BL21-S1RBD）。

实施例3 SARS-CoV-2 S1RBD的间接ELISA检测方法的建立

在本实施例中，应用实施例1中获得的重组蛋白（BL21-S1RBD）作为包被抗原，以实施例2中制备的单克隆抗体（鼠抗BL21-S1RBD）作为检测抗体，建立检测SARS-CoV-2S1RBD的间接ELISA的方法。

a）酶标板的包被

用包被液（Na₂CO₃ 1.5 g，NaHCO₃ 2.9 g，Na₂N₃ 1.2 g，加ddH₂O到1 L，调pH到9.6）将抗原稀释成1μg/ml，混合均匀后加入到96孔酶标板中，每孔100μl，将板密封于4℃过夜。

b）酶标板的封闭

用含有5%脱脂牛奶的PBS作为封闭液。首先将包被过夜的酶标板拍干，加入200μl/孔的封闭液，37℃封闭2h，用洗板机洗板6次后将酶标板拍干，并于4℃备用，或-20℃长期保存。

c）加入本发明中制备的梯度稀释单克隆抗体，100μl/孔，于37℃温育1h，用洗板机洗板6次后将酶标板拍干，再加入一定浓度的生物素标记的羊抗鼠IgG抗体（购自美国Raybiotech），100μl/孔，于37℃温育1h；洗板后加入链霉素标记的辣根过氧化物酶（HRP），100μl/孔，于37℃温育1h；洗板后加入TMB显色液，待显色完全后，加入2 M的浓硫酸终止显色，并用酶标仪（美国Biotek）测定OD₄₅₀，结果如表所示。

表3-1. 鼠抗BL21-S1RBD单克隆抗体的抗体效价测定

阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。因此，根据上表检测结果可知，其中当抗体浓度为1.562时，检测吸光值为对照血清的2倍以上，可知检测抗体的效价为1.562 ng/ml。

实施例4检测卡的制备

检测卡由试纸条及塑料卡壳组成：试纸条主要由底衬、以及依次设在底衬上的样品垫、硝酸纤维素膜（NC膜）和吸水纸组成，其中，本发明所述样品垫具有传统的样品垫和结合垫的功能，该样品垫上固定有荧光微球标记的鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体（Raybiotech. Life .Inc cat#130-10815）和荧光微球标记的兔IgG抗体（杭州博茵生物技术有限公司，货号：N160701），其采用玻璃纤维膜，能够载有足量荧光微球，且遇样本后能快速释放微球；包被膜为硝酸纤维膜（NC膜），包括平行设置、且相互间隔0.5cm的检测区（T线）和对照区（C线），检测区靠近吸水纸，包被有鼠抗BL21-S1RBD单克隆抗体（杂交瘤细胞，细胞株保藏号C2021067），对照区靠近样品垫，包被有山羊抗兔IgG抗体（杭州博茵生物技术有限公司，货号：P200301）。

荧光微球选用本领域公知的用于标记抗体的Eu³⁺镧系元素荧光微球，微球表面带有羧基活性基团，可以连接蛋白、糖类等生物物质，内含荧光素，其直径约为300nm。粒子的最大荧光峰位于615nm，最大吸收峰位于365nm左右，斯托克位移为240nm。即使它们共沉积在结合垫中，也可以使用不同的粒子结合物来生成校准信号和检测信号。

本发明试纸条使用镧系元素的时间分辨荧光微球标记抗体，结合免疫层析技术，采用双抗夹心法的原理，定性检测人口咽拭子、鼻拭子中的新型冠状病毒S蛋白抗原。当样本中含有相应待测物不小于检出限时，待测物与时间分辨荧光微球标记的抗体反应形成复合物，在层析作用下，反应复合物沿着硝酸纤维素膜向前移动至检测区（T），与硝酸纤维素膜上预先包被的抗体反应形成抗体-抗原-抗体复合物沉积在检测区。在激发光源的作用下，荧光物质发射特定波长的荧光信号，经干式荧光免疫分析仪俘获荧光信号，通过信号转化及定标曲线自动转化成数值，可检测出样本中的新型冠状病毒S蛋白抗原的浓度，结合参考区间判断阴阳性。

通过对检测试纸条制备工艺进一步优化，得到如下具体制备步骤：

1、制备荧光微球标记的单克隆检测抗体，并喷涂在样品垫上；

其中，以标记1mg的抗体为例，所需试剂组成如下表所示：

1.1 取300nm时间分辨荧光微球（1mg/ml）500µL放入离心管中，再加入2ml的偶联活化液，振荡混匀。

1.2 14000r/min 10分钟离心洗涤。去上清，加入2.5ml偶联活化液超声复溶。

1.3 加入10mg/ml 40µL EDC及10mg/ml 80µL NHS，振荡混匀，室温（23～30℃）振荡30分钟。

1.4 14000r/min 10分钟离心洗涤，去上清，加入2.5ml偶联活化液，超声复溶。重复洗涤2次。

1.5加入2ml偶联活化液，超声复溶。加入1mg抗体，用偶联活化液补充体系体积到2.5ml，振荡混匀。室温（23～30℃）振荡2小时。

1.6加入600µL封闭液，室温（23～30℃）振荡30分钟。

1.7 14000r/min 10分钟，去上清，加入1ml保存液，超声复溶（每超声5秒钟，间歇5秒钟，共五次）。重复洗涤2次。

1.8 加入1ml保存液，使终浓度为1mg/ml，放置2～8℃冰箱保存，待用。

2、样品垫制备

以制备1条样品垫（30cm×2.9cm）为例：

2.1根据工艺参数与生产量要求，计算所需T线时间分辨荧光微球标记抗体结合物和C线时间分辨荧光微球标记抗体结合物的量，用标记抗体稀释液配制喷膜液。

2.2 1mL喷膜液配方量如下：

T线时间分辨荧光微球标记抗体结合物为上述荧光微球标记的鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体（Raybiotech. Life .Inc cat#130-10815）；C线时间分辨荧光微球标记抗体结合物为上述荧光微球标记的兔IgG抗体。其中，荧光微球标记的鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体浓度为0.2mg/ml，荧光微球标记的兔IgG抗体浓度为0.1mg/ml。

其中，标记抗体稀释液配方为：0.2M NaH₂PO₄，0.2M Na₂HPO₄，20%海藻糖，2%BSA，1%酪蛋白，0.5%TWEEN-20，0.4%prociln300，pH7.4。

2.3环境湿度要求：15%～35%。喷液速率：4.0ul/mm。

2.4取一条样品垫放置到自制的凹槽板中，并对齐样品垫两端。把凹槽板移到喷垫划线仪的操作平台上，水平对齐喷口。每一条样品垫采用上述配制的喷膜液经1:3用标记抗体稀释液稀释后平行喷垫三次（喷垫位置不得重叠），喷垫位置参考图1所示。

2.5喷垫后把样品垫从凹槽板中移动到不锈钢筛网中，用紫外手电筒仔细观察已喷膜的样品垫是否有断隔、大小不一等情况，如果有，找出对应的样品垫相应位置，用笔标明。

2.6用75%酒精喷洒在凹槽板上，再用纸巾或棉花擦干，然后进行下一条样品垫喷垫。

2.7把已喷垫的样品垫移到电热鼓风干燥箱中，50℃干燥24±2小时。

2.8将干燥好的样品垫取出，加入干燥剂，用铝箔袋密封保存。

3、包被膜制备：以制备一板包被膜为例。

3.1根据工艺参数与生产量要求，计算所需T线包被抗体与C线包被抗体的量，用包被抗体稀释液配制T线包被液与C线包被液。

其中包被抗体稀释液配方：0.8%NaCl，0.02%KCl，0.116%NaHPO₄，0.024%KH₂PO₄，3%海藻糖，10%蔗糖，0.1%proclin300，PH 7.4。

3.2 T线包被液的制备：

T线包被有鼠抗BL21-S1RBD单克隆抗体（杂交瘤细胞，细胞株保藏号C2021067），以包被抗体浓度为5mg/ml，配制1ml浓度为1.5mg/ml的T线包被液的配方量如下：

3.3 C线包被液的制备：

C线包被有山羊抗兔IgG抗体（杭州博茵生物技术有限公司，货号：P200301），以包被抗体浓度为4 mg/ml，配制1ml浓度为0.2mg/ml的C线包被液的配方量如下：

3.4划线：湿度要求：55%～75%。使用划线标准卡对齐喷膜划线仪的T线与C线喷嘴，T线与C线喷嘴距离是5mm。观察T线与C线是否粗细不一、是否有锯齿状、是否有断线，如果有，用笔在NC膜上标明。

3.5将已划线的NC膜板放置铁架上，并移置电热鼓风干燥箱50℃干燥48±2小时。

4组装：参考图2顺序，在底衬上搭接粘贴样品垫、包被膜和吸水纸，进行试纸条组装。

5切条：裁切前先调试切条机是否正常，并用75%的酒精喷洒切条机的刀片滚轴，用棉花擦干。在微电脑自动斩切机或数控辅料裁条机上将大板切4.0mm±1mm宽的试纸条用于组装检测卡，其中每份试纸条中，样品垫长度约2.9cm、包被膜长度约2.5cm、吸水纸长度约2.4cm。

6、检测卡储存条件在2～30℃保存。

本发明的试纸条配置与大多数商用或先前报道的侧流免疫色谱分析设备均有不同，具体而言在这些试纸条中，质控区（C）位于上游，下游放置检测区（T），参考图2试纸条结构模式图。

实施例5 试剂盒的制备

本发明SARS-CoV-2 S1-RBD抗原检测试剂盒主要由试剂卡、运送培养液、ID卡（储存试剂盒标准曲线的载体）和样本稀释液组成。

其中样本稀释液依下表5-1配方配制，配制好后于4℃密封保存：

表5-1

运送培养液购自深圳达科为生物工程有限公司（经典型，粤深械备：20200570号）。

AFS-1000干式荧光免疫分析仪的基本测量原理为：由于Eu粒子的荧光寿命长和斯托克频移大，因此TRF检测技术可提供高信噪比和出色的检测灵敏度。读取器使用365nm的LED作为激发光源，并使用硅二极管进行荧光测量。与使用昂贵的带通滤光片的常规荧光检测器不同，AFS-1000干式荧光免疫分析仪使用便宜的截止滤光片和门控定时电路来测量荧光信号。在样品盒中放入样品后15分钟即可提供结果。本发明试剂盒的使用步骤具体如下：

1、准备

1.1打开仪器（干式荧光免疫分析仪，AFS-1000）的电源开关，进入初始界面；

1.2将试剂从冷藏环境取出，并平衡至室温；

1.3从试剂中取出ID卡并插入仪器，并点击读ID卡读取标准曲线；

1.4选择样本类型，以及根据需要手动输入样本号；

1.5撕开试剂卡铝箔袋，取出试剂卡。

2、分泌物采集：

2.1鼻拭子分泌物采集：轻轻插入无菌拭子，将拭子保持在鼻中隔附近，同时将拭子轻轻推入鼻腔约1.5cm，沿着内鼻壁做圆周旋转拭子4～6次，然后从鼻孔中取出，重复取样另一个鼻孔。

2.2 咽拭子分泌物采集：将拭子从口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上颚扁桃的发红部位为中心，适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部，取出拭子。

2.3 将含有咽喉分泌物/鼻咽分泌物样本的取样拭子放入300-500μl样本稀释液中处理，取该样本稀释液100μl加样，取试剂卡对此处理后的样本进行检测。

3、检测，将测试卡插入检测槽，按“测试”键，仪器将自动对测试卡进行检测，按“打印”键打印检测结果。

4、退卡，将用过的测试卡从仪器中取出，并和多余的样本稀释液及移液器枪头按传染性物品进行处理。

实施例6 试剂盒的检测

A、拟合标准曲线绘制

本发明试剂盒的标准曲线建立步骤如下：

在实施例1的时间分辨免疫层析试纸条的加样区加入不同浓度的重组SARS-CoV-2S1-RBD蛋白（即实施例1制备得到的重组蛋白BL21-S1RBD），用样本稀释液配制成20000pg/ml、10000pg/ml、3000pg/ml、1000pg/ml、300pg/ml、100pg/ml、30pg/ml、10pg/ml和0pg/ml，每个浓度重复4次。反应10分钟后，仪器读取质控线C、检测线T信号，信号结果的统计参数如下表6-1所示，以检测的样品的检测线荧光值与质控线的荧光值的比值（T/C）为横坐标，SARS-CoV-2S1-RBD标准品浓度为纵坐标，建立方程并拟合成标准曲线y=1.2608x+3.2149。标准曲线R2＝0.9959，曲线如图3所示，线性较好，可以通过该标准曲线对样品中所含SARS-CoV-2S1-RBD蛋白浓度进行定量分析。

表6-1

B、样本检测

在实施例1的时间分辨免疫层析试纸条的加样区加入待测样品，膜层析反应15分钟。开启荧光检测设备，读取ID卡里的标准曲线，并将检测条插入荧光检测设备的插卡口，运行仪器，仪器通过相应的分析软件自动计算出待测样本中的SARS-CoV-2S1-RBD蛋白浓度，根据定标卡上的信息将实际检测值带入预设的标准曲线中算出定量的结果。

实施例7 试剂盒性能测定

对试剂盒进行性能方面的测定，包括重复性、准确度、最低检测限、线性范围等。

1）试剂盒的重复性检测

使用浓度分别为100pg/ml，300pg/ml和1000pg/ml的重组SARS-CoV-2S1-RBD蛋白（即实施例1制备得到的重组蛋白BL21-S1RBD），每个浓度重复10次，评估实施例5中试剂盒检测的重复性。检测结果如下表7-1所示：

表7-1

通过上述表中检测数据可知，本发明试剂盒重复性在1000pg/ml、300pg/ml、100pg/ml的变异系数（CV）分别是4.18%、12.01%、8.65%，检测结果的变异系数（CV）均≤15%，表明其检测具有良好重复性。

2）试剂盒的准确度检测（相对偏差）

使用浓度分别为100pg/ml，300pg/ml和1000pg/ml的重组SARS-CoV-2S1-RBD蛋白（即实施例1制备得到的重组蛋白BL21-S1RBD），每个浓度重复3次，评估实施例5中试剂盒检测的准确性。检测结果如下表7-2所示：

表7-2

通过上述表中检测数据可知，本发明试剂盒试剂盒准确度的变异系数（CV）≤15%，表明其检测具有良好的准确度，进一步将平均测得的SARS-CoV-2S1-RBD理论浓度与真实SARS-CoV-2S1-RBD浓度的比较，通过使用B =（M-T）/ T×100％计算它们的浓度相对偏差B，其中平均测得浓度为M，T为样品的真实浓度。下表7-3总结了三个标准样品的检测结果。测量结果1000pg/ml、300pg/ml、100pg/ml的准确度分别是-7.31%、-6.53%和-4.01%，均显示与真实抗原浓度的相对偏差不大于15％。表明本发明试剂盒有良好的准确度。

表7-3

3）试剂盒的批间差

取两个批次的试剂盒，分别针对三个浓度1000pg/ml，300pg/ml和100pg/ml的重组SARS-CoV-2S1-RBD蛋白（即实施例1制备得到的重组蛋白BL21-S1RBD）进行检测，每个浓度重复10次。检测结果显示，100pg/ml、300pg/ml、1000pg/ml浓度的批间差（CV）分别为9.88％、12.33％、12.85％，总体而言，批间差（CV）都处于不大于15%，证明两个批次的试剂盒都是合格的。

表7-4

4）试剂盒的最低检测限

使用两个批次的本发明SARS-CoV-2 S1-RBD检测试剂盒和AFS-1000干式荧光免疫分析仪检测进行最低检测限检测。采用样本稀释液（即重组SARS-CoV-2S1-RBD蛋白浓度为0pg/ml）作为参考品进行检测，每个批次试剂盒进行20次重复检测。计算20个检测值的平均值M及标准差SD，M+2SD≤10pg/ml（不大于10pg/ml）为本试剂盒的最低检测限。

表7-5

通过上表检测结果显示，这两个批次的检测试剂盒的检出限分别为5.26pg/ml和6.60pg/ml。因此，快速检测试剂盒的检测灵敏度低于10pg/ml。

5）试剂盒的线性范围

参考品制备

取上述实施例1中的重组SARS-CoV-2 S1-RBD蛋白，用样本稀释液配制成20000pg/ml、10000pg/ml、3000pg/ml、1000pg/ml、300pg/ml、100pg/ml、30pg/ml、10pg/ml。每个浓度重复4次，评估实施例2中试剂盒的检测线性范围。检测结果如下表7-6所示：

表7-6

通过上市结果绘制的线性曲线如图4所示，表明重组SARS-CoV-2 S1-RBD蛋白在浓度范围为10-20000pg/ml内，检测线性良好，相关系数R≥0.9900。

6）试剂盒的HOOK效应检测

为了评估本发明试剂盒的钩状效应（HOOK效应），避免SARS-CoV-2 S1-RBD浓度过高时，可能会产生钩状效应，并产生假阴性结果。我们制备了一系列稀释的实施例1中的重组SARS-CoV-2 S1-RBD蛋白样本，其浓度分别为35000pg/ml、30000pg/ml、25000pg/ml、20000pg/ml、10000pg/ml、3000pg/ml、1000pg/ml、300pg/ml。每个浓度重复4次进行检测，以获得平均值。检测结果如下表7-7所示：

表7-7

检测结果如图5，表明平均值随SARS-CoV-2 S1-RBD浓度变化的曲线图。显然，当重组SARS-CoV-2 S1-RBD的浓度达到＞20ng/ml时，就会开始发生钩状效应。

实施例8 临床样本检测

为了评估本发明 SARS-CoV-2 S1-RBD检测试剂盒的性能，使用了商业实时聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（购自达安基因）进行对比检测。取临床鼻咽拭子97例，其中阳性拭子样品的纳入标准为具有Covid-19症状的病例，并已通过RT-PCR确认。阴性样品的纳入标准是没有任何Covid-19症状的病例，也已通过RT-PCR确认为阴性。排除标准是那些临床诊断不清楚，标本不足以进行测试的标准。在这些样本中，有75个拭子样本是对Covid-19的阴性诊断，其余22个样本是有阳性的诊断。这些拭子样品通过RT-PCR试剂盒和本发明 SARS-CoV-2 S1-RBD检测试剂盒同时进行检测。检测总体结果如下表8-1所示：

表8-1 SARS-CoV-2 S1-RBD抗原检测试剂盒与RT-PCR检测的总体检测结果

进一步将检测结果进行综合分析，得到如图6所示测得的S1-RBD抗原水平（pg /ml）与逆转录PCR的箱形图。显示比较了测得的S1-RBD抗原水平（pg / ml）和RT-PCR检测的CT值。ρ值为-0.76，p值<2.2e-16（<0.001）。统计数据显示，本发明 SARS-CoV-2 S1-RBD抗原检测试剂盒结果与RT-PCR检测结果之间存在显着相关性。

如图7所示的临床拭子样本中SARS-CoV-2 S1-RBD抗原的ROC曲线, 显示了本发明SARS-CoV-2 S1-RBD抗原检测试剂盒与RT-PCR检测结果的ROC分析。本发明SARS-CoV-2 S1-RBD抗原检测试剂盒的敏感性为81.8％（95％置信区间0.597-0.948）。特异性为82.7％（95％置信区间0.722-0.904）。准确性为82.5％（95％置信区间0.734-0.895），Kappa值为0.563。表明其与核酸检测（新型冠状病毒的RT-PCR检测）结果有很高的阴阳性符合率，具有良好的临床应用前景。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 瑞博奥（广州）生物科技股份有限公司

<120> 一种检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫试剂盒及其制备方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

agggtccaac caacagagag c 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gaagttcaca cacttgttct tcac 24

Claims

1.一种杂交瘤细胞株COVID19-SRBD-8，其特征在于，所述细胞株的保藏编号为CCTCCNo：C202167。

2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述杂交瘤细胞株COVID19-SRBD-8分泌产生。

3.根据权利要求2所述单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是以SARS-CoV-2S1RBD重组蛋白为免疫原，免疫小鼠得到的单克隆抗体；所述SARS-CoV-2S1RBD重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为SEQ ID NO.1经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。

4.权利要求1所述杂交瘤细胞株COVID19-SRBD-8在制备新型冠状病毒检测试剂和/或药物中的应用。

5.权利要求2-3任一项所述单克隆抗体在制备新型冠状病毒检测试剂和/或药物中的应用。

6.一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的制备原料包括权利要求2-3任一项所述单克隆抗体。

7.一种新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板以及沿所述底板的长度方向顺次粘覆于所述底板上的样品垫、包被膜和吸水纸；

其中，所述样品垫上喷有标记抗体，所述标记抗体为荧光微球标记鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG抗体，所述包被膜上设置有相间隔的由山羊抗兔IgG抗体包被形成的质控线和由权利要求2-3任一项所述单克隆抗体包被形成的检测线；或，所述样品垫上喷有标记抗体，所述标记抗体为荧光微球标记的权利要求2-3任一项所述单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG抗体，所述包被膜上设置有相间隔的由山羊抗兔IgG抗体包被形成的质控线和由鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体包被形成的检测线。

8.根据权利要求7所述新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，所述质控线靠近所述样品垫，所述检测线靠近所述吸水纸。

9.根据权利要求7所述新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，所述标记抗体由标记抗体稀释液稀释，所述标记抗体稀释液包括：0.1M~0.3M NaH₂PO₄，0.1M~0.3MNa₂HPO₄，10%~30%海藻糖，1%~5%BSA，0.1%~2%酪蛋白，0.1%~1%TWEEN-20，0.1%~1%prociln300。

10.根据权利要求7所述新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，所述荧光微球为Eu³⁺镧系元素荧光微球，所述荧光微球的直径为290nm-350nm。

11.根据权利要求7所述新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记的鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体浓度为0.1mg/ml-0.2mg/ml，所述荧光微球标记的兔IgG抗体浓度为0.05mg/ml-0.1mg/ml；所述荧光微球标记的鼠抗新型冠状病毒S1-RBD蛋白单克隆抗体和兔IgG抗体溶液按300μl-600μl//30cm×2.9cm喷涂至样品垫上。

12.根据权利要求7所述新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，所述检测线或所述质控线上包被的抗体由包被抗体稀释液稀释，所述包被抗体稀释液包括质量百分比为0.1%-1.8%NaCl，0.01%-0.05%KCl，0.01%-0.3%NaHPO₄，0.01%-0.05%KH₂PO₄，1%-5%海藻糖，5%-15%蔗糖和0.01%-0.3%proclin300。

13.根据权利要求7-12任一项所述新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，所述检测线包被的权利要求2-3任一项所述单克隆抗体的浓度为1mg/ml-2mg/ml，按30μl-50μl/30cm划线至包被膜上；

所述质控线包被的山羊抗兔IgG抗体的浓度为0.1mg/ml-0.5mg/ml，按30μl-50μl/30cm划线至包被膜上。

14.一种SARS-CoV-2S1-RBD抗原检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求7-13任一项所述新型冠状病毒检测试纸条。

15.根据权利要求14所述SARS-CoV-2S1-RBD抗原检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液，所述样品稀释液，每800ml中包括8g-10g Na₂HPO₄、1g-3g NaH₂PO₄·2H₂O、6g-8g NaCl、1g-3g酪蛋白和0.1ml-2ml Proclin300。