CN112730832A - 一种covid-19抗原检测卡、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种COVID‑19抗原检测卡、其制备方法和应用，属于纳米材料和纳米医学领域，其中所述采用的稀土纳米探针为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，粒径为20nm～30nm，其组成为：NaErF4@NaYF4，其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。本发明的纳米探针为稀土氟化物纳米材料具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将探针与新冠单克隆抗体连接，标记产物稳定，具有灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可对早期新冠疑似患者咽拭子，鼻拭子，鼻咽拭子和唾液样本进行筛查检测，能够快速特异地帮助临床确诊。

Description

一种COVID-19抗原检测卡、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料和纳米医学领域，尤其是一种COVID-19抗原检测卡、其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒基于目前的流行病学调查，潜伏期一般为3-7天，最长不超过14天。感染者以发热、乏力、干咳为主要表现。鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。
新型冠状病毒也称严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒-2，已明确为β属冠状病毒，是感染人类冠状病毒家族中第7个成员，与2003年的SARS冠状病毒一样，由RNA核酸和蛋白等组成，RNA很容易降解，蛋白衣壳将RNA包裹在其中，加上一层由脂质和糖蛋白组成的包膜外衣，从而使其RNA得到保护，病毒RNA编码四种主要结构蛋白，包括刺突糖蛋白(S，SpikeProtein)、小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein)和膜糖蛋白(M，Membrane Protein)，及核衣壳(N)蛋白，其中S蛋白对于病毒识别与入侵有着关键的作用。病毒通过S-蛋白与人ACE2互作的分子机制，来感染人的呼吸道上皮细胞，病毒进入人体后，主要通过激活免疫系统，通过细胞因子、炎症因子等导致肺损伤。并且利用宿主细胞进行复制增殖。因此可以通过采集人的特定部位细胞样本，检测其中是否含有病毒RNA核酸，来确认机体是否受到感染。
核酸检测是目前新型冠状病毒感染确诊的“金标准”，然而病毒核酸检测存在检测时间和周期长、环境要求高、技术力量要求高、硬件设备要求高、价格昂贵等一系列问题，只能在省/市级疾控中心和较大规模的三甲医院开展，不利于肺炎患者的快速诊断和筛查，不利于疫情的防控。
若能在家庭或者社区，就能便捷、快速、低成本的对COVID-19病毒感染患者进行筛查，就能够高效的隔离被感染人群、阻断传播途径，将病毒感染的防控端口前移，能够推进COVID-19病毒感染的有效和及时防控。新型冠状病毒在感染的早期存在高滴度病毒血症，可达109～1011拷贝/L，可采用免疫荧光法检测血清中病毒抗原，对早期疑似患者进行筛查检测，能够快速特异地帮助临床确诊。参考其他冠状病毒，已知N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。同时，N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体。因此，可以利用N蛋白建立一种快速、敏感、特异的便捷检测COVID-19血清抗体的方法，这对及时发现病人、控制流行具有极其重要意义。
稀土纳米探针具有荧光寿命长、发射峰半峰宽很窄和Stokes位移大等光学特性，在检测中能够有效降低背景荧光的干扰，能够实现高灵敏度的分析检测，同时还能够进行多标记，实现同时检测样品中的多种物质。利用纳米稀土颗粒的上转换发光特性，制成生物示踪颗粒，应用于体外诊断试剂，与传统的稳定态发光检测技术相比，由于信号/噪声比显著增大，其检测灵敏度大大提高。不仅如此，稀土纳米探针还具有高光化学稳定性、生物兼容性等特点，能够保证检测过程信号的稳定性，提高检测灵敏度，已经在体外诊断领域得到了广泛的应用。
因此，本项目拟基于稀土纳米探针优异的光学特性和生物兼容性，开发一种适用于COVID-19病毒N蛋白抗原高灵敏度、高特异性便携式快速现场检测的新方法、试剂盒。该试剂盒可对密切接触人群和疑似人群，开展便捷、快速的社区即时检测，不仅能有效避免人群大量扎堆前往定点医院，避免因此造成的二次交叉传染，还能有效地对潜伏期的感染人群进行筛查，对于新型冠状病毒感染的防控具有重要意义。
因此开发一种具有灵敏度高、快速测定、咽拭子、鼻咽拭子以及唾液中COVID-19抗原、检测准确度高的上转换试剂盒及方法具有重要意义。
发明内容
发明目的：提供一种COVID-19抗原检测卡、其制备方法和应用，以解决背景技术中所涉及的问题。
技术方案：本发明提供一种COVID-19抗原检测卡，包括：
底衬；作为所述COVID-19抗原检测卡的基底；
包被膜；设置于所述底衬上表面的中部；
样品垫：搭接设置于所述包被膜的上表面的一端；
吸水纸；搭接设置于所述包被膜的上表面的另一端；
其中，所述样品垫喷涂有微球线，所述微球线为由稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体1；所述包被膜上依次设置有检测线和质控线，所述检测线线靠近所述样品垫；所述检测线包被有COVID-19单克隆抗体2，质控线包被有羊抗兔IgG抗体。
优选地，所述稀土纳米探针为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，其组成为：NaErF4@NaYF4；其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。
优选地，所述稀土纳米探针在基态下稳定，在808nm的激发光源作用下发射出波长范围在500-550nm，640-680nm和1500-1600nm的三发射荧光。
优选地，所述稀土纳米探针的制备活化方法，包括以下步骤：
步骤一：合成氟化铒钠核结构：在容器中，加入油酸、1-十八烯、铒的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到NaErF4纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米探针：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液、NaErF4纳米探针环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米探针；
步骤三：活化稀土纳米探针：对步骤二的稀土纳米探针进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；加入碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米探针。
优选地，所述样品垫上喷涂的稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体1的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
优选地，所述检测线中COVID-19单克隆抗体2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
本发明还提供一种COVID-19抗原检测卡的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：根据所述稀土纳米探针的制备活化方法制备得到活化稀土纳米探针；
步骤二：制备稀土纳米探针标记COVID-19单克隆抗体1：对步骤一的活化稀土纳米探针按照50～200μg/200μl加入COVID-19单克隆抗体1，用封闭液封闭后高速离心，用含保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜：分别用COVID-19单克隆抗体2和羊抗兔IgG抗体作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
步骤四：制备样品垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、0.5％酪蛋白、1％BSA的20mM、pH8.2的Tris-HCl浸泡样品垫37度烘干过夜，在样品垫上用稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体1喷涂一条线，烘干；
步骤五：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述COVID-19抗原检测卡。
优选地，所述步骤三中，用微球稀释液将稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体1稀释8～30倍，用量为2～4μl液量/cm样品垫；所述微球稀释液为含0.5％BSA、20％蔗糖的2mM硼酸缓冲液。
本发明还提供一种COVID-19抗原检测卡在制备
COVID-19抗原检测试剂盒的应用，所述COVID-19抗原检测试剂盒包括：
COVID-19抗原检测卡，采用上述的COVID-19抗原检测卡；
含有定标曲线的ID卡，由COVID-19抗原检测卡测定不同抗原浓度的质控品，以质控品抗原浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。
优选地，所述COVID-19抗原检测试剂盒还包括抗原提取液R1，其组成成分为1％曲拉通X-100，150mM氯化钠，1％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，Tris-Hcl(pH7.4)。
本发明还提供一种COVID-19抗原检测试剂盒定量检测COVID-19抗原的方法，包括以下步骤：
步骤一：以咽拭子，鼻拭子，鼻咽拭子和唾液作为检测样本；
1.咽拭子:
让患者头部微仰，嘴张大，发出“啊”的声音，露出两侧咽扁桃体。手持拭子在患者两侧咽扁桃体稍用力来回擦拭至少3次。将拭子标本放入预先加入提取液的抽提管中，旋转拭子约10秒，同时将拭子头压向管壁，以释放拭子中的抗原。
2.鼻拭子:
让患者头部自然放松，慢慢旋转拭子，将拭子紧贴鼻孔壁，进入患者鼻孔至鼻上颚，擦拭时缓缓取出。用同一个拭子擦拭另一个鼻孔；将拭子标本放入预先加入提取液的抽提管中，旋转拭子约10秒，同时将拭子头压向管壁，以释放拭子中的抗原。
3.鼻咽拭子:
将鼻拭子放入采集咽拭子的取样管中。这样，取样管中有咽拭子和鼻拭子，称为鼻咽拭子管。将拭子标本放入预先加入提取液的抽提管中，旋转拭子约10秒，同时将拭子头压向管壁，以释放拭子中的抗原。
4.一次性口腔唾液采集拭子(可拆卸拭子头)
将棉签单手放入口腔内，将棉签头置于上下磨牙之间，轻咬棉签头15-20秒，使唾液吸收；唾液采集后，轻轻取出棉签。一手握住内棒一端，另一手握住外棒推，将棉签头弹出到离心管或其他收集管中；拧紧离心管的盖子并在室温下保存。
步骤二：开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：将抽提管放在工作台上。拭子提取瓶(R1)垂直向下，挤压瓶子使溶液自由滴入提取管而不接触管子边缘。加入6滴抗原提取液R1(约300μL)到抽提管中。
步骤四：将拭子标本放入抽提管中，旋转拭子约10秒，将拭子头压向管壁，以释放拭子中的抗原。将拭子头挤压一下，取出拭子，以便尽可能多地从拭子中取压出液体。按生物危害废物处理方法处理拭子。
步骤五：将抽提管装上滴头并倒置抽提管，轻压滴两滴(约80μL)到测试卡的加样孔中，启动计时器。
步骤六：反应20分钟后用荧光免疫分析仪检测结果。
有益效果：本发明涉及一种COVID-19抗原检测卡、其制备方法和应用，本试剂采用荧光免疫层析原理，样本在毛细管作用下沿着测试卡向前移动。如果标本含有新型冠状病毒抗原，抗原将结合稀土纳米荧光标记的抗新型冠状病毒的单克隆抗体。该免疫复合物将被固定在硝酸纤维素膜上的另一个抗新型冠状病毒的单克隆抗体捕获，借助荧光仪读取检测线的荧光强度，从而判断样本的阴阳性。测试卡还包含质控线C线，无论检测线的荧光强度高或低，质控线C线荧光强度均稳定。用光源(808nm)对检测区扫描检测，检测线和质控线上稀土纳米探针发出荧光(670nm)，在此荧光范围内生物体自发荧光较弱。延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1～10ns)全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
采用了上述技术方案后，本发明具有积极的效果：
(1)本发明的纳米探针为稀土氟化物纳米材料，具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将探针与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽、灵敏度高(最低检出限100TCID50/mL)、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
(2)稀土掺杂纳米材料具有稳定的物理化学性质，窄带发射，宽Stokes位移，长寿命等优点，从而排除激发光干扰，可通过时间分辨延迟检测消除本底荧光干扰，在生物标记过程中不容易受环境影响。稀土发光材料尤其是稀土氟化物具有较低的声子能量，且物理化学性能稳定，适合于稀土发光材料的基质材料，它能减少激活离子激发态的无辐射驰豫从而提高激活离子的发光效率。因此采用稀土氟化物纳米粒子作为标记物，发光寿命长，激发波长为808nm，发射波长为540nm、670nm和1540nm，同时具有近红外及可见光三发射可避免激发光源的干扰，同时结合时间分辨荧光免疫技术，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度和准确性，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
(3)本发明利用稀土氟化物作为基质，通过不同稀土离子的掺杂，合成了高性能的氟化铒钠包覆氟化钇钠纳米探针，全铒掺杂的纳米材料通过表面包覆一层氟化钇钠壳层，提高能量转化的效率，具有高灵敏度的特点，方便了其检测，故而制备出了光化学性质稳定强、发光寿命长的稀土纳米探针。
(4)本发明利用NaErF4@NaYF4纳米稀土颗粒的上转换发光特性，制成生物示踪颗粒，应用于体外诊断试剂，与传统的稳定态发光检测技术相比，由于信号/噪声比显著增大，其检测灵敏度大大提高，在新型冠状病毒检测中，由于上转发光现象产生于晶体结构内部，完全避免发光淬灭；具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
附图说明
图1为本发明的COVID-19抗原检测卡的结构示意图。
图2为NaErF4@NaYF4稀土纳米探针在808nm激发下的荧光光谱图。
图3为NaErF4@NaYF4稀土纳米探针透射电镜图，纳米探针粒径在20-30nm。
附图标记为：底衬1、样品垫2、微球线21、包被膜3、检测线31、质控线32、吸水纸4。
具体实施方式
在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
(实施例1)
本实施例的稀土纳米探针，为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，粒径为20nm～30nm，其组成为：
NaErF4@NaYF4，其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。
进一步的，所述稀土纳米探针在基态下稳定，在808nm的激发光源作用下发射出波长范围在500-550nm，640-680nm和1500-1600nm的三发射荧光。NaErF4@NaYF4稀土纳米探针在808nm激发下的荧光光谱图，如图2所示。NaErF4@NaYF4稀土纳米探针透射电镜图，如图3所示。
制备本实施例的稀土纳米探针的方法，包括以下步骤：
步骤一：合成氟化铒钠核结构：在容器中，加入体积比为3～6：7～14的油酸和1-十八烯，再按摩尔比例，加入1份铒的硝酸盐或醋酸盐或氯化物；在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至100～120℃，反应20～30分钟，再升温至150～160℃，反应10～15分钟，得到透明溶液；自然冷却至40～50℃，释放真空，加入摩尔浓度比为1～2：1.6～3.4的NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4次，通入氮气，升温至280～300℃，反应1～2小时，离心处理，随后用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中，得到NaErF4纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米探针：在容器中，加入体积比为3～6：7～14油酸和1-十八烯，加入醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，以及与油酸体积比为3～6：2～4的NaErF4纳米探针环己烷溶液，混合搅拌，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4次，通入氮气，升温至280～290℃，反应1～2小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；所述醋酸钇、NaOH、氟化铵物质的量之比为0.2～0.4：0.5～1：0.8～1.6；利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米探针；
步骤三：活化稀土纳米探针：对步骤二的稀土纳米探针进行1～2min的超声波处理和离心处理(12000～14000rpm高速)，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，超声波处理2～3min；加入20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后12000～14000rpm高速离心5～15min，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米探针。
(实施例2)
如图1所示，本实施例的COVID-19抗原检测卡，包括：
底衬1；作为所述COVID-19抗原检测卡的基底；
包被膜2；设置于所述底衬1上表面的中部；
样品垫3：搭接设置于所述包被膜3的上表面的一端
吸水纸4；搭接设置于所述包被膜3的上表面的另一端；
其中，所述样品垫2喷涂有微球线21，所述微球线21为实施例1提供的稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体1；所述包被膜3上设置有检测线31和质控线32，所述检测线31靠近所述样品垫2，检测线31和质控线32相互平行，间隔距离为3～5mm；所述检测线31包被有COVID-19单克隆抗体2，质控线32包被有羊抗兔IgG抗体。
进一步的，所述样品垫3上喷涂的稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体1的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
更近一步的，所述检测线31中COVID-19单克隆抗体2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线32中羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
制作完成后，将其固定在与检测卡尺寸匹配的塑料底卡上，检测卡表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫2和包被膜3的部分分别预留加样孔和观察窗。
制备本实施例的COVID-19抗原检测卡的方法，包括以下步骤：
步骤一：根据实施例1提供的方法制备得到活化稀土纳米探针；
步骤二：制备稀土纳米探针标记COVID-19单克隆抗体1：对步骤一的活化稀土纳米探针超声波处理1～2min后按照50～200μg/200μl加入COVID-19单克隆抗体1，混匀1～3小时，用含0.5％BSA的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl封闭液封闭0.5～1小时后12000～14000rpm高速离心5～15min，用含1％NaCl、0.5％BSA、0.1％Tween-20的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜：分别用COVID-19单克隆抗体2和羊抗兔IgG抗体作为检测线质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；分别用包被缓冲液将COVID-19单克隆抗体2和羊抗兔IgG抗体调整浓度到0.5～2mg/ml，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔3～7mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜；
步骤四：制备样品垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、0.5％酪蛋白、1％BSA的20mM、pH8.2的Tris-HCl浸泡样品垫37度烘干过夜，在样品垫上将稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体1用微球稀释液稀释8～30倍均匀喷涂一条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜；所述微球稀释液为含0.5％BSA、20％蔗糖的2mM硼酸缓冲液。
步骤五：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、样品垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述COVID-19抗原检测卡。
(实施例3)
本实施例的COVID-19抗原检测试剂盒，包括：
COVID-19抗原检测试剂盒包括抗原提取液R1，其组成成分为1％曲拉通X-100，150mM氯化钠，1％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，Tris-Hcl(pH7.4)。
COVID-19抗原检测卡：采用实施例2所提供的COVID-19抗原检测卡；
含有定标曲线的ID卡：由COVID-19抗原检测卡测定不同抗原浓度校准品，以抗原浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应抗原浓度。
本实施例的COVID-19抗原检测试剂盒定量检测COVID-19的方法，包括以下步骤：
步骤一：以咽拭子，鼻拭子，鼻咽拭子，唾液作为检测样本；
步骤二：开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：将抽提管放在工作台上。拭子提取瓶(R1)垂直向下，挤压瓶子使溶液自由滴入提取管而不接触管子边缘。加入6滴抗原提取液R1(约300μL)到抽提管中。
步骤四：将拭子标本放入抽提管中，旋转拭子约10秒，将拭子头压向管壁，以释放拭子中的抗原。将拭子头挤压一下，取出拭子，以便尽可能多地从拭子中取压出液体。按生物危害废物处理方法处理拭子。
步骤五：将抽提管装上滴头并倒置抽提管，轻压滴两滴(约80μL)到测试卡的加样孔中，启动计时器。
步骤六：反应20分钟后用荧光免疫分析仪检测结果。
氟化铒钠包覆氟化钇钠，粒径为20nm～30nm，其组成为：NaErF4@NaYF4，其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。本发明的纳米探针为稀土氟化物纳米材料具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势
(实施例4)
本实施例进行具体的实例试验并进行测定。
与实施例2的COVID-19抗原检测卡结构一致，样品垫上微球线上使用特定的激发光(808nm)/发射光(670nm)波长的核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠(NaErF4@NaYF4)(直径约20nm～30nm)标记COVID-19单克隆抗体1(100μg抗体/200μl纳米探针)，检测线包被COVID-19单克隆抗体2(1mg/ml)，质控线包被浓度为1mg/ml的羊抗兔IgG抗体(其中COVID-19单克隆抗体采购自菲鹏生物股份有限公司，羊抗兔IgG抗体来自长沙博优生物科技有限公司)。微球线用量为4μl包被液量/cm样品垫、检测线和质控线用量为1μl包被液量/cm膜。
在本实施例中，COVID-19抗原检测试剂盒的制备包括以下步骤：
(1)氟化铒钠核结构合成：
在100mL三口圆底烧瓶中，加入4.5mL油酸和12.5mL 1-十八烯，再按摩尔比例，加入1mmol醋酸铒，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入2.5mmolNaOH和4mmol氟化铵甲醇混合溶液，反应30min；升温至100℃，抽气换气3次，通入氮气，升温至300℃，反应1.5小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于4mL环己烷中。
(2)核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠纳米探针的制备：
在100mL三口圆底烧瓶中，加入3mL油酸和7mL1-十八烯，加入0.5mmol醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入1.25mmolNaOH和2mmol氟化铵甲醇混合溶液，2mL NaErF4纳米探针环己烷溶液，混合搅拌，反应30min；升温至100℃，抽气换气3次，通入氮气，升温至300℃，反应1小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于环己烷中；利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米荧光探针。所述材料尺寸约为20nm，且形貌均一，发光性能好。纳米探针激发波长为808nm，发射波长为540nm、670nm和1540nm。
(3)稀土纳米探针的活化：
超声波处理稀土纳米探针2min后，取200μl纳米探针以14000rpm高速离心15min后，沉淀物用100mM，pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入50μl的100mg/ml碳二亚胺，混匀5min，再加入100μl的100mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀15min后14000rpm高速离心15min，沉淀用pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml。
(4)稀土纳米探针标记COVID-19单克隆抗体1的制备：
在上述活化后的荧光微球超声波处理2min后按照100μg/200μl加入COVID-19单克隆抗体1，混匀2小时，用含0.5％BSA的50mM、pH8.0 Tris-HCl封闭液封闭1小时后14000rpm高速离心15min，用含1％(w/w)Nacl、0.5％(w/w)BSA、0.1％(w/w)Tween-20的50mM、pH8.0的Tris-HCl保存液中缓冲液洗涤两次并超声处理重悬至200μl于4℃避光保存。
(5)包被膜的制备：
分别用包被缓冲液(含2.5％(w/w)蔗糖的20mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液)将COVID-19单克隆抗体2调整浓度到1mg/ml，羊抗兔IgG抗体调整浓度到1mg/ml，用量为1μl包被液量/cm膜，分别作为检测线M、检测线G和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔4mm，在湿度<30％，温度45℃烘箱中烘干过夜，封袋，备用；
(6)样品垫的制备：
用样品垫处理液含0.5％NaCl、0.5％酪蛋白、1％BSA的20mM、pH8.2的Tris-HCl浸泡样品垫37度烘干过夜，在样品垫上将稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体1用微球稀释液(含0.5％(w/w)BSA、20％(w/w)蔗糖的2mM硼酸缓冲液)稀释20倍均匀喷涂一条线，用量为4μl液量/cm样品垫。置于烘箱中，37℃烘干过夜。
(7)检测卡组装：
在底衬(尺寸为80*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(尺寸为31*300mm，玻璃纤维棉材质)、包被膜(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的试纸条。
本发明COVID-19抗原检测卡在使用时由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳设有两个开孔，分别为加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫2，塑料下壳上设置有固定检测试纸条的卡口，结果观察窗对应于检测线31和质控线32，该COVID-19抗原检测卡可以从该塑料外壳中取出。
COVID-19抗原检测试剂盒包括抗原提取液R1，其组成成分为1％曲拉通X-100，150mM氯化钠，1％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，Tris-Hcl(pH7.4)。
COVID-19抗原检测试剂盒中，每盒均含有标准曲线的ID卡(同批次标准曲线相同)，通过稀土纳米荧光试纸条测定不同抗原浓度的校准品，以校准品抗原浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入ID卡并生成二维码，通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。
下面详细介绍标准曲线的绘制
取抗原校准品用阴性临床样本分别稀释，得到8000，3200，1600，800，400，100TCID50/mL每个浓度重复测量三次，取T/C值均值与校准品浓度建立标准曲线。
实验结果及分析见表1：
表1 COVID-19抗原标准曲线
Figure BDA0002933160510000121
以抗原浓度和样本信号T/C平均值绘制标准曲线，曲线数据见表1，通过该标线对样品中所含COVID-19抗原浓度进行定量测定。
下面对COVID-19抗原检测卡进行性能测试(用新型冠状病毒抗原检测试剂国家参考品进行检测)：
1.阴性符合率：检测阴性参考品(N1-N20)，20份均为阴性。
其中阴性参考品包含：金黄色葡萄球菌(N1)，肺炎链球菌(N2)；麻疹病毒(N3)，腮腺炎病毒(N4)、腺病毒3型(N5)、肺炎支原体(N6)、副流感2型(N7)，偏肺病毒(N8)，冠状病毒OC43(N9)，冠状病毒229E(N10)，副百日咳杆菌(N11)，乙型流感病毒(Victoria系)(N12)，乙型流感病毒(Y系)(N13)，甲型HINI(2009)流感病毒(N14)，甲型H3N2流感病毒(N15)，禽流感病毒H7N9(N16)，禽流感病毒H5N1(N17)，EB病毒(N18)，肠道病毒CA16(N19)，鼻病毒(N20)。
2.阳性符合率：检测阳性参考品(P1-P8)，P1-P8均为阳性。
3.最低检出限：最低检出限参考品S，使用各试剂稀释液或纯水进行1:50、1:100、1:200、1:400、1:800及1:1600稀释后标记为S1～S6，分别对以上6个浓度进行检测，S1～S4均为阳性，S5、S6均为阴性；
4.重复性：用同一批次试剂盒，重复性参考品R：使用各试剂稀释液或纯水进行1:10、1:100稀释后标记为R1和R2，对以上两个浓度分别进行10次检测。R1和R2的10次检测结果应均为阳性，且CV均小于15.0％。
为了验证产品性能，还进行了临床样本检测：
本次临床试验样本为321例受试者鼻拭子样本，样本均由PCR结果确认，试验结果归总如下：
1、确诊的阳性样本101例中考核试剂检测结果：阳性为96例，阴性样本220例中考核试剂检测结果：阴性为219例。
2、321例临床血清样本的检查结果显示：
Figure BDA0002933160510000131
灵敏度:96/101 95.05％(95％CI*:88.93％～97.87％)
特异性:219/220 99.55％(95％CI*:97.47％～99.92％)
准确度:315/321 98.13％(95％CI*:95.98％～99.14％)
*95％置信区间
综上所述，本发明的试剂盒利用稀土纳米荧光免疫层析技术的灵敏性，结合干式免疫荧光分析仪，实现了高灵敏度、可准确定量、简便快捷的定量检测COVID-19抗原。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种COVID-19抗原检测卡，其特征在于，包括：
底衬；作为所述COVID-19抗原检测卡的基底；
包被膜；设置于所述底衬上表面的中部；
样品垫：搭接设置于所述包被膜的上表面的一端；
吸水纸；搭接设置于所述包被膜的上表面的另一端；
其中，所述样品垫喷涂有微球线，所述微球线为由稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体1；所述包被膜上依次设置有检测线和质控线，所述检测线靠近所述样品垫；所述检测线包被有COVID-19单克隆抗体2，质控线包被有羊抗兔IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的COVID-19抗原检测卡，其特征在于，所述稀土纳米探针为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，其组成为：NaErF4@NaYF4；
其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。
3.根据权利要求2所述的COVID-19抗原检测卡，其特征在于，所述稀土纳米探针在基态下稳定，在808nm的激发光源作用下发射出波长范围在500-550nm，640-680nm和1500-1600nm的三发射荧光。
4.根据权利要求2所述的COVID-19抗原检测卡，其特征在于，所述稀土纳米探针的制备活化方法，包括以下步骤：
步骤一：合成氟化铒钠核结构：在容器中，加入油酸、1-十八烯、铒的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到NaErF4纳米探针环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米探针：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液、NaErF4纳米探针环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米探针；
步骤三：活化稀土纳米探针：对步骤二的稀土纳米探针进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；加入碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米探针。
5.根据权利要求1所述的COVID-19抗原检测卡，其特征在于，所述样品垫上喷涂的稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
6.根据权利要求1所述的COVID-19抗原检测卡，其特征在于，所述检测线中新型冠状病毒单克隆抗体2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
7.一种基于权利要求1至6任一项所述COVID-19抗原检测卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：根据稀土纳米探针的制备活化方法制备得到活化稀土纳米探针；
步骤二：制备稀土纳米探针标记COVID-19单克隆抗体1：对步骤一的活化稀土纳米探针按照50～200μg/200μl加入COVID-19单克隆抗体1，用封闭液封闭后高速离心，用含保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜：分别用COVID-19单克隆抗体2和羊抗兔IgG抗体作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
步骤四：制备样品垫：用样品垫处理液含0.5％NaCl、0.5％酪蛋白、1％BSA的20mM、pH8.2的Tris-HCl浸泡样品垫37度烘干过夜，在样品垫上用稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体1喷涂一条线，烘干；
步骤五：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述COVID-19抗原检测卡。
8.根据权利要求7所述的COVID-19抗原检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，用微球稀释液将稀土纳米探针标记的COVID-19单克隆抗体稀释8～30倍，用量为2～4μl液量/cm样品垫；所述微球稀释液为含0.5％BSA、20％蔗糖的2mM硼酸缓冲液。
9.一种基于权利要求1至6任一项所述的COVID-19抗原检测卡在制备COVID-19抗原检测试剂盒的应用，其特征在于，所述COVID-19抗原检测试剂盒包括：
COVID-19抗原检测卡；
含有定标曲线的ID卡，由COVID-19抗原检测卡测定不同抗原浓度的质控品，以质控品抗原浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。
10.根据权利要求9所述的COVID-19抗原检测卡在制备COVID-19抗原检测试剂盒的应用，其特征在于，所述COVID-19抗原检测试剂盒还包括抗原提取液R1，其组成成分为1％曲拉通X-100，150mM氯化钠，1％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，pH7.4的Tris-Hcl。
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