CN112433048A - 一种用于化学发光免疫法的试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种用于化学发光免疫法的试剂盒及其制备方法和应用。该试剂盒包括包被有待测物的抗原或抗体的免疫磁珠复合物，以及偶联有聚合物分子的二抗或第二抗体，所述聚合物分子上标记有多个光源基团。由于采用信号放大技术，将多个发光基团共价偶联到聚合物分子上，再将聚合物分子共价偶联到二抗或第二抗体上，使发光基团成倍增加，从而使发光强度成倍增强，可用于检测含量极低的生物指标。

Description

一种用于化学发光免疫法的试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种用于化学发光免疫法的试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
化学发光免疫分析包含免疫分析和化学发光分析两部分，其中免疫分析是将化学发光物质或酶作为标记物，直接标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体反应形成抗原-抗体免疫复合物，而化学发光分析是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。根据化学发光标记物与发光强度的关系，可利用标准曲线计算出被测物的含量。根据标记物的不同可将化学发光免疫分析技术分为三大类：即直接化学发光标记物免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。
化学发光免疫分析技术在检验医学中有多方面的应用，包括各类疾病标志物的诊断以及治疗药物浓度监测等，其具有灵敏度高、特异性好、线性范围宽和检测时间短等优点。然而该技术对样本量有一定要求，其对于某些超低含量的疾病标志物或药物浓度而言，无法做到精确检测。目前部分化学发光检测法如化学发光酶免疫分析法应用到信号放大技术，可对其发光酶信号进行放大，然而其也存在着缺陷，如需要反复退火和加酶等，并且，对于直接化学发光标记物免疫分析法而言，其也不适用通过对发光酶信号进行放大来增强检测效果，因此，直接化学发光标记物免疫法无法应用在待测物含量极低的生物检测中。
目前常用的化学发光体系为以吖啶酯或鲁米诺类发光基团标记的直接化学发光，但是此类方法灵敏度常常达不到临床要求，使得该方法的推广受到限制。
发明内容
本发明提供一种用于化学发光免疫法的试剂盒及其制备方法和应用，采用信号放大技术对化学发光免疫法中的信号进行增强。
在第一方面，本申请提供一种用于化学发光免疫法的试剂盒，所述试剂盒包括包被有待测物的抗原或抗体的免疫磁珠复合物，以及偶联有聚合物分子的二抗或第二抗体，所述聚合物分子上标记有多个光源基团。
即在本申请第一方面中的试剂盒，可以应用在化学发光免疫检测法中，通过竞争法或者夹心法对待测样品中的待测物进行检测。
适用于本发明的磁珠也称为磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。优选的是，本发明使用的磁球经过活性基团进行修饰，使得磁珠可以与待测物的抗原或抗体进行特异性结合。同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以实现定向移动与富集，从而达到分离纯化目的。在本申请的一种实现方式中，免疫磁珠复合物中的磁珠经过活性基团修饰，所述活性基团包括羧基、氨基、醛基、亲和素中的至少一种。
聚合物分子上应具有多个结合位点，以用于同时标记多个光源基团，位于同个聚合物分子上的光源基团越多，其信号放大效果越好。因此可以通过控制两者的浓度配比，以将更多的光源基团标记到同一个聚合物分子上。
光源基团中的化学发光基团是利用化学反应原理，当采用化学发光基团作为光源基团时，所述试剂盒中还包括化学发光引发剂，用于诱导化学发光基团产生光信号。而荧光基团是利用物理反应原理，其可直接发出光信号，采用其作为光源基团时无需添加化学发光引发剂。在本申请的一种实现方式中，聚合物分子包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、生物大分子以及聚氨基酸中的至少一种。优选地，所述生物大分子包括BSA(指牛血清白蛋白)、KLH(指血蓝蛋白)中的至少一种，所述聚氨基酸包括聚赖氨基酸。在本申请的一种实现方式中，所述光源基团包括化学发光基团和荧光基团；优选地，所述化学发光基团包括吖啶酯、鲁米诺类衍生物中的至少一种；所述荧光基团包括异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、藻红蛋白、7-氨基-4甲基香豆素、Eu3+螯合物中的至少一种。
在本实施例中，该用于化学发光免疫法的试剂盒还可以包括校准品，校准品可以组合到本申请的试剂盒中，也可以市售购买。校准品由若干个含已知浓度的样品组成，例如可以配置成6个、8个或9个等。其浓度范围根据待测物在人体内的浓度范围所决定。例如，对于TXB2而言，其在人体内的浓度单位为pg/mL，因此制备用于检测TXB2的试剂盒，其标准品的浓度范围为0-1000pg/mL。对于sST2而言，其在人体内的浓度单位为ng/mL，因此制备用于检测sST2的试剂盒，其标准品的浓度范围为0-1000ng/mL。对于PD-1单抗而言，其在人体内的浓度单位为μg/mL，因此制备用于检测PD-1单抗的试剂盒，其标准品的浓度范围为0-1000μg/mL。
由于采用同时标记多个光源基团的聚合物分子进行偶联，使得本申请所制备出的试剂盒灵敏度相较于未采用信号放大技术的试剂盒而言，灵敏度能提高数十倍。尤其地，本申请所制备的用于检测TXB2的试剂盒，其最低检测限度为0.05pg/mL，特别适用于对含量极低(0.05-0.1pg/mL)的待测物进行检测。
在第二方面，本申请提供一种第一方面所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
将含有待测物的抗原或抗体的包被液加入经过活性基团修饰的磁珠中，将待测物的抗原或抗体偶联固定于磁珠上，得到包含有待测物的抗原或抗体的免疫磁珠复合物；
对聚合物分子进行保护和活化，并将光源基团偶联到活化的聚合物分子上，再与二抗或第二抗体偶联，得到同时标记多个光源基团的标记二抗或第二抗体；
即在本申请第二方面中，提供应用于竞争法或夹心法的试剂盒的制备方法，二者的制备方法上除了所添加的成分有所区别外，其它步骤均相同。
一种实施例中，所述制备免疫磁珠复合物的具体步骤包括：
对经过活性基团修饰的磁珠原液进行涡旋混匀后，静置磁性分离、去除上清液；加入偶联液并反应，磁性分离、去除上清液；加入含待测物的抗原或抗体的包被液重悬，涡旋混匀后磁性分离、去除上清液；用洗涤液洗涤磁珠，磁性分离、去除上清液；加入封闭液，涡旋混匀反应0-72h，磁性分离、去除上清液；加入洗涤液洗涤磁珠，磁性分离、去除上清液；再加入缓冲液，涡旋混匀既得免疫磁珠复合物。步骤中所采用的缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液或HEPES缓冲液等；偶联液可以是EDC溶液和NHS溶液的混合液，洗涤液为可以是常规的在PBS缓冲液中添加0.05％的吐温20形成的PBST洗涤液。
一种实施例中，所述制备标记二抗或标记第二抗体的具体步骤包括：
(1)保护与活化步骤：包括将聚合物分子置于缓冲液中，在搅拌下加入保护试剂，并在0℃-37℃下反应1-72h；反应完毕后超声、离心、去除上清液，并用洗涤液进行清洗；将所得聚合物分子置于缓冲液中，在搅拌下加入活化试剂，并在0℃-37℃下反应1-72h；反应完毕后超声、离心、去除上清液，并用洗涤液进行清洗，得到活化的聚合物分子；
(2)信号放大标记物制备步骤：包括将活化的聚合物分子置于缓冲液中，在搅拌下加入光源基团，并在0℃-37℃下反应1-72h；反应完毕后超声、离心、去除上清液，并用洗涤液进行清洗；将所得活化的聚合物分子置于脱保护试剂中，在0℃-37℃下反应1-72h；反应完毕后超声、离心、去除上清液，并用洗涤液进行清洗，得到信号放大标记物；
(3)标记二抗或标记第二抗体步骤：包括将二抗或第二抗体置于缓冲液中，在搅拌下加入信号放大标记物，并在0℃-37℃下反应1-72h；反应完毕后超声、离心、去除上清液，并用洗涤液进行清洗，对二抗或第二抗体进行纯化，得到同时标记多个光源基团(偶联有带光源基团的聚合物分子)的标记二抗或标记第二抗体。
需要说明的是，本申请中的偶联液，主要应用在将待测物的抗原或抗体偶联到磁珠上，以及将标记有多个光源基团的聚合物分子偶联到二抗或第二抗体上。本申请的一种实现方式中，在偶联优选采用EDC溶液(中文：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液)和NHS溶液(中文：N-羟基琥珀酰亚胺溶液)的混合溶液，以提高偶联效率。
包被液的作用在于包被待测物的抗原或抗体，在本申请的一种实现方式中，所述包被液包括Na2CO3溶液和/或NaHCO3溶液，其为待测抗原或抗体提供碱性环境。
缓冲液是为试剂盒的制备或化学发光免疫分析法反应提供缓冲环境，包括Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液(即磷酸缓冲盐溶液)和HEPES缓冲液等。在本申请的一种实现方式中，优选采用磷酸缓冲盐溶液作为缓冲液，并将其pH值调节在7左右，为反应提供中性或弱碱性缓冲条件。
保护试剂目的在于保护聚合物分子氨基，避免在活化步骤中，聚合物分子与活化的羧基与氨基直接反应；活化试剂目的在于活化羧基，使羧基与化学发光或荧光基团反应；脱保护试剂目的在于解离出聚合分子中被保护的氨基，使氨基可以与二抗或第二抗体活化的羧基偶联。在本申请中，保护试剂优选包括二碳酸二叔丁酯、对甲苯磺酰氯、乙酸酐和二苯甲酮中的至少一种；脱保护试剂优选包括乙酸、盐酸中的至少一种。
在第三方面，本申请还提供一种采用第一方面所制备的试剂盒或第二方面制备方法所制备出的试剂盒对待测样品进行检测的方法，包括：将所述免疫磁珠复合物与待测样品混合，进行免疫反应；免疫反应完成后，通过磁性分离获得免疫复合物；向免疫复合物中加入标记有多个光源基团的二抗或第二抗体，使二抗或第二抗体与所述免疫复合物结合，形成新的免疫复合物；磁性分离所述新的免疫复合物，根据所标记的光源基团，在化学反应或激发波长下，检测所述新的免疫复合物产生的光信号，通过光信号的强度检测待测样品中抗原或抗体的含量。
在第四方面，本申请还提供一种采用第一方面所制备的试剂盒在检测TXB2、PD-1单抗或sST2中的应用。PD-1单抗作为药物，检测其血药浓度是为了协助临床用药方案调整，降低药物不良反应；sST2，TXB2作为生物标志物，检测其血液(或尿液)含量是为了诊断疾病的进展情况。
其中，TXB2作为有机小分子使用的是竞争法，PD-1单抗、sST2作为蛋白质大分子使用的是抗体夹心法。由于PD-1单抗、sST2以及TXB2在人体中的浓度数量级不同，因此可根据实际需求选择相应的制备条件和浓度。在本申请中，所制备出的试剂盒最低检测限度为TXB2化学发光免疫检测试剂盒的检测限度，其为0.05pg/mL，而市面上如上海钰博生物有限公司生产的TXB2的ELISA检测试剂盒，其最低检测限度为2.3pg/mL，远高于本申请的检测限度。实验证明，使用本申请所应用得信号放大技术，可使灵敏度相较于现有技术而言提高数十倍。
有益效果：本申请通过结合信号放大技术，制备出在二抗或第二抗体上标记有多个光源基团的试剂盒，应用于化学发光免疫法中，可以准确定量检测出超低含量(如0.05-0.10pg/mL)的疾病标志物或药物浓度检测中，极大地提高检测的灵敏度。
附图说明
图1为本申请所述试剂盒的制备过程中标记抗体的结合示意图；
图2为实施例一中PD-1单抗待测物的浓度回归曲线图；
图3为实施例二中sST2待测物的浓度回归曲线图；
图4为实施例三中TXB2待测物的浓度回归曲线图。
具体实施方式
目前直接化学发光标记物免疫法技术中，每个二抗或第二抗体只结合一个光源基团，其发光信号强弱取决于待测物内分子数量，当待测物内分子数量过低时，所产生的光信号也较弱，无法更精准灵敏地检测出待测物中分子的含量。而在本申请中，采用信号放大技术对进行检测时的光信号进行倍数型放大，该信号放大技术是将多个光源基团通过脱水缩合的方式偶联到聚合物分子上，即所得的每个聚合物分子上均偶联多个光源基团，然后再将二抗或第二抗体与该聚合物分子以直接或间接的方式共价偶联，使得发光的量子产率成倍增加，从而大大提高了检测灵敏度，且标记前后被标记物的免疫活性不会受到影响。所述的共价偶联方法包括但不限于碳二亚胺法、戊二醛法、过碘酸钠法、N-羟基琥珀酰亚胺酯法、马来酰亚胺法等。
该试剂盒采用信号放大技术(夹心法)的原理为：将待测物相应的抗原(或抗体)偶联在磁珠表面上，待测物与抗原(或抗体)发生免疫反应后，在磁场作用下，免疫复合物被分离出来；然后加入标记有多个光源基团的第二抗体，待免疫复合物与第二抗体发生免疫反应后，在磁场作用下，新的免疫复合物被分离出来；然后产生光信号，光信号的发光强度与待测抗体的结合量成正比，通过检测光信号的发光强度可以实现对待测样品中待测物的定量检测。标记多个光源基团可实现对信号的倍数型放大，因此可适用于对含量极低的待测物的精准定量测量。
该试剂盒采用信号放大技术(竞争法)的原理为：将待测抗原偶联在磁珠表面上，偶联有磁珠的待测抗原与样本中待测抗原与一抗竞争反应，在磁场作用下，偶联有磁珠的抗原抗体免疫复合物被分离出来；然后加入标记有多个光源基团的二抗，待免疫复合物与二抗发生免疫反应后，在磁场作用下，新的免疫复合物被分离出来；然后产生光信号，光信号的发光强度与样本中待测抗原的结合量成反比，通过检测光信号的发光强度可以实现对待测样品中待测物的定量检测。标记多个光源基团可实现对信号的倍数型放大，因此可适用于对含量极低的待测物的精准定量测量。
下面将通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。应当理解，实施例仅是示例性的，并不构成对本发明保护范围的限制。下述实施例中的实验操作，如无特殊说明，均为常规操作方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。任何与下文记载的方法和材料相似或等同的方法及材料，都可应用于本发明中。
如无特殊标明，下文中的1％均指的是质量浓度为1％，0.05％指的是质量浓度为0.05％。
实施例一
1.PD-1抗体检测试剂盒的制备，其具体配比如下所示：
包被PD-1抗原的免疫磁珠复合物配方
Figure BDA0002782797900000061
免疫磁珠复合物的制备步骤：取10mL含有羧基磁珠的原液用涡旋混匀器混匀，置于磁分离器上静置磁性分离2min，去除上清液；加入100mL偶联液，置于旋转混匀仪上室温反应30min，磁性分离2min，去除上清液；加入100mL包被液重悬，置于旋转反应仪上反应2h，静置磁性分离2min，去除上清液；用10mL洗涤液洗涤磁珠，静置磁性分离2min，去除上清液；加入封闭液，涡旋混匀后置于恒温培养振荡箱中反应2h，静置磁性分离2min，去除上清液；加入10mL洗涤液洗涤磁珠，静置磁性分离2min，去除上清液；加入100mL缓冲液，涡旋混匀既得免疫磁珠复合物。
化学发光基团标记的配方
Figure BDA0002782797900000062
Figure BDA0002782797900000071
标记第二抗体的制备步骤：将聚合物分子用缓冲液稀释至1.0％(w/w)，搅拌下加入保护试剂，室温下反应2h，超声、离心、去除上清液；将上一步所得聚合物分子稀释至1.0％(w/w)，搅拌下加入活化试剂，室温下反应2h，超声、离心、去除上清液，得活化的聚合物分子；将活化的聚合物分子稀释至1.0％(w/w)，搅拌下加入含光源基团的分子进行标记，室温下反应2h；超声、离心、去除上清液；并置于脱保护试剂中，室温下反应2h；超声、离心、去除上清液，得信号放大标记聚合物分子；将第二抗体置于缓冲液中，稀释至1.0％(w/w)，搅拌下加入信号放大标记聚合物分子，室温下反应2h；对第二抗体进行纯化：将上一步得到的第二抗体反应液转移至透析袋中，并将透析袋浸泡于缓冲液中2～8℃静置2h得所需纯化的标记第二抗体。
基于磁微粒的化学发光免疫分析检测PD-1抗体血药浓度：取上述所得的包被有PD-1抗原的免疫磁珠30μL加入至2mL离心管中，在相应的离心管中依次加入50μL校准品/质控品/待测样品，然后加入发光基团-聚合物标记的第二抗体50μL，室温反应20min后，缓冲液洗涤3次；置于恒温摇床中，转速为180rpm，并室温反应20min；缓冲液洗涤5次，然后加入发光引发剂H2O2 5μL，轻微振荡混匀后反应5min，对发光信号进行检测，记录最大的发光强度值。
2.方法学验证
2.1标准曲线
将上述PD-1单抗校准品溶于人空白血清中，配制成1.5625μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL、200.0μg/mL 8个浓度梯度，并按照上述检测方法进行检测。其测定结果如表1.1所示，利用三次曲线拟合得到回归曲线如图2所示。
表1.1校准品发光强度测定结果
Figure BDA0002782797900000072
2.2最低检测限
平行测定20次零浓度校准品的相对发光强度，计算相对发光强度的平均值(M)和标准差(SD)，根据零浓度校准品(0μg/mL)与临近浓度(1.5625μg/mL)校准品之间的浓度-发光强度结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的发光强度代入上述方程，求得的浓度即为最低检测限。可得本发明提供的试剂盒最低检测限为0.0028μg/mL。
2.3批内精密度
用上述制备的PD-1单抗检测试剂盒分别对质控品L(3.125μg/mL)和质控品H(200.0μg/mL)进行批内精密度测试。取实施例1制备的同一批试剂盒，平行测定质控品L和质控品H20次，计算所有结果的变异系数。结果如下：
表1.2批内精密度测定结果
质控品L(μg/mL) 质控品H(μg/mL)
均值 3.143 201.322
标准偏差 0.04 2.10
变异系数％ 1.21 1.04
结果表明本发明的试剂盒质控品L和质控品H的批内精密度变异系数在分别为1.21％和1.04％，性能良好。
2.4批间精密度
用上述制备的PD-1单抗检测试剂盒分别对质控品L和质控品H进行批间精密度测试。取实施例1制备的两批试剂盒，每批试剂盒平行测定质控品L和质控品H 20次，计算所有结果的变异系数。结果如下：
表1.3批间精密度测定结果
质控品L(μg/mL) 质控品H(μg/mL)
均值 3.1420 200.9437
标准偏差 0.04 2.07
变异系数％ 1.20 1.03
结果表明本发明的试剂盒质控品L和质控品H的批间精密度变异系数在分别为1.20％和1.03％，性能良好。
2.5样品稳定性
将上述制备的试剂盒放在室温下，于第0、3、5、7天对质控品L和质控品H进行测试，计算第7天与第0天的相对偏差。
表1.4试剂盒加速稳定性结果
Figure BDA0002782797900000081
质控品L第7天与第0天的相对偏差为0.14％，质控品H第7天与第0天的相对偏差为0.05％，样本稳定性良好。
实施例二
1.sST2定量检测试剂盒的制备
包被有sST2抗体的免疫磁珠复合物配方
Figure BDA0002782797900000091
免疫磁珠复合物的制备步骤请参见实施例1。
化学发光基团标记的第二抗体配方
Figure BDA0002782797900000092
标记第二抗体的制备步骤请参见实施例1。
基于磁微粒的化学发光免疫分析检测sST2含量：取上述所得的包被有sST2抗体的免疫磁珠30μL加入至离心管中，在相应的离心管中依次加入50μL校准品/质控品/待测样品，然后加入上述制备的光源基团标记的第二抗体50μL，室温反应20min后，缓冲液清洗3次，置于恒温摇床中，转速为180rpm，室温反应20min。洗涤缓冲液5次，然后加入发光引发剂5μL轻微振荡混匀后反应5min，对发光信号进行检测，记录最大的发光强度值。
2.方法学验证
2.1标准曲线
将上述sST2校准品溶于人空白血清中，配制成0.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL、80.0ng/mL、160.0ng/mL、320.0ng/mL 9个浓度梯度。按照上述检测方法进行检测，测定结果如表1所示。利用三次曲线拟合得到回归曲线如图3所示。
表2.1校准品发光强度测定结果
Figure BDA0002782797900000093
Figure BDA0002782797900000101
2.2最低检测限
平行测定20次零浓度校准品的相对发光强度，计算相对发光强度的平均值(M)和标准差(SD),根据零浓度校准品与临近浓度(2ng/mL)校准品之间的浓度-发光强度结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的发光强度代入上述方程，求得的浓度即为最低检测限。本发明提供的试剂盒最低检测限为0.0036ng/mL。
2.3批内精密度
用上述制备的sST2定量检测试剂盒分别对质控品L和质控品H进行批内精密度测试。取实施例1制备的同一批试剂盒，平行测定质控品L(10.0ng/mL)和质控品H(160.0ng/mL)20次，计算所有结果的变异系数。结果如下：
表2.2批内精密度测定结果
质控品L(ng/mL) 质控品H(ng/mL)
均值 9.99 161.67
标准偏差 0.19 1.18
变异系数％ 1.89 0.73
结果表明本发明的试剂盒质控品L和质控品H的批内精密度变异系数在分别为1.89％和0.73％，性能良好。
2.4批间精密度
用上述制备的sST2定量检测试剂盒分别对质控品L(10.0ng/mL)和质控品H(160.0ng/mL)进行批间精密度测试。取实施例2制备的两批试剂盒，每批试剂盒平行测定质控品L和质控品H 20次，计算所有结果的变异系数。结果如下：
表2.3批间精密度测定结果
质控品L(ng/mL) 质控品H(ng/mL)
均值 9.98 161.67
标准偏差 0.18 1.29
变异系数％ 1.78 0.80
结果表明本发明的试剂盒质控品L和质控品H的批间精密度变异系数在分别为1.78％和0.80％，性能良好。
2.5样品稳定性
将上述制备的试剂盒放在室温下，于第0、3、5、7天对质控品L和质控品H进行测试，计算第7天与第0天的相对偏差。
表2.4试剂盒加速稳定性结果
Figure BDA0002782797900000111
质控品L第7天与第0天的相对偏差为-0.62％，质控品H第7天与第0天的相对偏差为0.11％,试剂的37℃加速破坏能稳定7天，相当于2-8℃稳定一年。
实施例三
1.TXB2定量检测试剂盒的制备，其具体配比如下所示：
包被有TXB2抗体的免疫磁珠复合物配方
TXB<sub>2</sub>抗体 1μg/mL
羧基磁珠原液 1.5mg/mL
包被液 Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 1.59g，NaHCO<sub>3</sub> 2.93g，加双蒸水定容1L，调节pH为9.6
封闭液 含5％脱脂奶粉的PBS缓冲液
缓冲液 为PBS缓冲液
洗涤液 为PBST洗涤液：在PBS缓冲液中加入0.05％的吐温20
偶联液 10mg/mL EDC溶液，75mg/mL NHS溶液
免疫磁珠复合物的制备步骤请参见实施例1。
化学发光基团标记的二抗配方
Figure BDA0002782797900000112
标记二抗的制备步骤请参见实施例1中标记第二抗体的制备步骤(将其中的第二抗体替换成本申请中的二抗)。
基于磁微粒的化学发光免疫分析检测TXB2含量：取上述所得的包被有TXB2抗原的免疫磁珠30μL加入至2mL离心管中，在相应的离心管中依次加入50μL校准品/质控品/待测样品及等体积的TXB2抗体，室温孵育1h后，磁性分离2min，去除上清液；洗涤液清洗磁珠，去除上清液，加入上述制备的光源基团标记的二抗50μL，置于恒温摇床中转动，转速为180rpm，室温反应20min；缓冲液洗涤5次，然后加入发光引发剂5μL轻微振荡混匀后反应5min，对发光信号进行检测，记录最大的发光强度值。
2.方法学验证
2.1标准曲线
将上述TXB2校准品溶于人空白血清中，配制成0.0pg/mL、5.0pg/mL、10.0pg/mL、20.0pg/mL、40.0pg/mL、80.0pg/mL、160.0pg/mL、320.0pg/mL、640.0ng/mL 9个浓度梯度。按照上述检测方法进行检测，测定结果如表1所示。利用三次曲线拟合得到回归曲线如图4所示。
表3.1校准品发光强度测定结果
校准品浓度(pg/mL) RLU 拟合浓度(pg/mL) 拟合偏差(％)
0.0 42597103 -0.52 -
5.0 42344238 5.75 -
10.0 42151373 10.51 5.1
20.0 41735643 20.7 3.5
40.0 40994183 38.66 -3.35
80.0 39291263 78.96 -1.3
160.0 35685423 161.23 0.76
320.0 28523743 319.68 -0.10
640.0 15350383 640.03 0.0047
2.2最低检测限
平行测定20次零浓度校准品的相对发光强度，计算相对发光强度的平均值(M)和标准差(SD)，根据零浓度校准品(0.0pg/mL)与临近浓度(5.0pg/mL)校准品之间的浓度-发光强度结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的发光强度代入上述方程，求得的浓度即为最低检测限。本发明提供的试剂盒最低检测限为0.05pg/mL。
2.3批内精密度
用上述制备的TXB2定量检测试剂盒分别对质控品L(5.0pg/mL)和质控品H(320.0pg/mL)进行批内精密度测试。取同一批试剂盒，平行测定质控品L和质控品H20次，计算所有结果的变异系数。结果如下：
表3.2批内精密度测定结果
质控品L(pg/mL) 质控品H(pg/mL)
均值 4.99 321.67
标准偏差 0.09 1.18
变异系数％ 1.81 0.37
结果表明本发明的试剂盒质控品L和质控品H的批内精密度变异系数在分别为1.81％和0.37％，性能良好。
2.4批间精密度
用上述制备的TXB2定量检测试剂盒分别对质控品L和质控品H进行批间精密度测试。取实施例3制备的两批试剂盒，每批试剂盒平行测定质控品L和质控品H 20次，计算所有结果的变异系数。结果如下：
表3.3批间精密度测定结果
质控品L(pg/mL) 质控品H(pg/mL)
均值 4.99 321.67
标准偏差 0.09 1.29
变异系数％ 1.89 0.40
结果表明本发明的试剂盒质控品L和质控品H的批间精密度变异系数在分别为1.89％和0.40％，性能良好。
2.5样品稳定性
将上述制备的试剂盒放在室温下，于第0、3、5、7天对质控品L和H进行测试，计算第7天与第0天的相对偏差。
表3.4试剂盒加速稳定性结果
Figure BDA0002782797900000131
质控品L第7天与第0天的相对偏差为-1.22％，质控品H第7天与第0天的相对偏差为0.16％，试剂的37℃加速破坏能稳定7天，相当于2-8℃稳定一年。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种用于化学发光免疫法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有待测物的抗原或抗体的免疫磁珠复合物，以及偶联聚合物分子的标记二抗或标记第二抗体，所述聚合物分子上标记有多个光源基团。
2.如权利要求1所述用于化学发光免疫法的试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠复合物中的磁珠表面经过活性基团修饰，所述活性基团包括羧基、氨基、醛基、亲和素中的至少一种；
优选地，所述聚合物分子包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨基酸和生物大分子中的至少一种；
优选地，所述聚氨基酸为赖氨酸；
优选地，所述生物大分子为牛血清白蛋白或血蓝蛋白；
优选地，所述光源基团包括化学发光基团和荧光基团中的至少一种；
优选地，所述化学发光基团包括吖啶酯、鲁米诺类衍生物中的至少一种；
优选地，所述荧光基团包括异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、藻红蛋白、7-氨基-4甲基香豆素、Eu3+螯合物中的至少一种。
3.如权利要求2所述用于化学发光免疫法的试剂盒，其特征在于，当采用化学发光基团作为光源基团时，所述试剂盒中还包括化学发光引发剂；
优选地，所述化学发光引发剂包括H2O2。
4.一种如权利要求1-3任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
免疫磁珠复合物的制备：包括将含有待测物的抗原或抗体的包被液加入经过活性基团修饰的磁珠中，将待测物的抗原或抗体偶联固定于磁珠上，得到包被有待测物的抗原或抗体的免疫磁珠复合物；
标记二抗或标记第二抗体的制备：对聚合物分子进行保护和活化，并将光源基团标记到活化的聚合物分子上，再与二抗或第二抗体偶联，得到标记二抗或标记第二抗体。
5.如权利要求4所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述免疫磁珠复合物的制备，具体步骤包括：
将经过活性基团修饰的磁珠加入偶联液并反应后，加入含待测物的抗原或抗体的包被液重悬，涡旋混匀反应，磁性分离、去除上清液；用洗涤液洗涤磁珠，磁性分离、去除上清液；加入封闭液，涡旋混匀反应，磁性分离、去除上清液；加入洗涤液洗涤磁珠，磁性分离、去除上清液；再加入缓冲液，涡旋混匀，既得包被有待测物的抗原或抗体的免疫磁珠复合物。
6.如权利要求5所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述标记二抗或标记第二抗体的制备，具体步骤包括：
(1)保护与活化步骤：包括将聚合物分子置于缓冲液中，在搅拌下加入保护试剂，并在0℃-37℃下反应1-72h；反应完毕后超声、离心、去除上清液，并用洗涤液进行清洗；将所得聚合物分子置于缓冲液中，在搅拌下加入活化试剂，并在0℃-37℃下反应1-72h；反应完毕后超声、离心、去除上清液，并用洗涤液进行清洗，得到活化的聚合物分子；
(2)信号放大标记物制备步骤：包括将活化的聚合物分子置于缓冲液中，在搅拌下加入光源基团，并在0℃-37℃下反应1-72h；反应完毕后超声、离心、去除上清液，并用洗涤液进行清洗；将所得活化的聚合物分子置于脱保护试剂中，在0℃-37℃下反应1-72h；反应完毕后超声、离心、去除上清液，并用洗涤液进行清洗，得到光源基团标记的聚合物分子，即信号放大标记物；
(3)获得标记二抗或标记第二抗体步骤：包括将二抗或第二抗体置于缓冲液中，在搅拌下加入信号放大标记物，并在0℃-37℃下反应1-72h；反应完毕后超声、离心、去除上清液，并用洗涤液进行清洗，对二抗或第二抗体进行纯化，得到标记有多个光源基团的标记二抗或标记第二抗体。
7.如权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述免疫磁珠复合物的制备中，待测物的抗原或抗体与磁珠偶联时所采用的偶联液包括EDC溶液和NHS溶液；
优选地，所述包被液包括Na2CO3溶液、NaHCO3溶液中的至少一种；
优选地，所述标记二抗或第二抗体的制备中，所述保护试剂包括二碳酸二叔丁酯、对甲苯磺酰氯、乙酸酐、二苯甲酮中的至少一种；
优选地，所述脱保护试剂包括乙酸、盐酸中的至少一种；
优选地，所述活化试剂包括N,N'-二环己基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N,N'-二异丙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种。
8.如权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述免疫磁珠复合物的制备和所述标记二抗或第二抗体的制备中，所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种。
9.一种采用如权利要求1-3任一项所述试剂盒或者如权利要求4-8任一项所述制备方法制备的试剂盒对待测样品进行检测的方法，其特征在于，包括将所述免疫磁珠复合物与待测样品混合，进行免疫反应；免疫反应完成后，通过磁性分离获得免疫复合物；向免疫复合物中加入标记有多个光源基团的二抗或第二抗体，使二抗或第二抗体与所述免疫复合物结合，形成新的免疫复合物；磁性分离所述新的免疫复合物，根据所标记的光源基团，在化学反应或激发波长下，检测所述新的免疫复合物产生的光信号，通过光信号的强度检测待测样品中抗原或抗体的含量。
10.一种如权利要求1-3任一项所述试剂盒或者如权利要求4-8任一项所述制备方法制备的试剂盒在检测TXB2、sST2或PD-1单抗中的应用。
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