CN106568967B - 一种针对赭曲霉毒素a的灵敏检测方法 - Google Patents

一种针对赭曲霉毒素a的灵敏检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，该方法利用包埋有量子点的荧光微球替代常规的酶载体与赭曲霉毒素A偶联，以偶联产物作为竞争抗原执行直接竞争ELISA。在技术路线中，本发明首先依据发光特性选择了适宜的量子点，进一步设计了基于荧光微球技术的量子点包埋方法，在此基础上，将量子点荧光微球经BSA包被后与赭曲霉毒素A偶联，从而得到了性能更好的竞争性抗原。该技术方案中，荧光微球通过高聚物载体包埋了大量的量子点，因而具有更高的发光强度，可有效地提高检测的灵敏度；而且，由于荧光微球具有较大的粒径，因此可在一定程度上降低竞争抗原与包被抗体之间过高的亲和力，从而提升检测的灵敏度。

Description

一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法
技术领域
本发明涉及抗原检测技术领域，进一步涉及基于荧光免疫学分析的抗原检测技术，具体涉及一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法。
背景技术
赭曲霉毒素是一个被世界广为关注的毒素，它是由曲霉属和青霉属的霉菌产生的一组毒性代谢产物，包括A、B、C等7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A的毒性最大。一般容易受到赭曲霉毒素污染的食品包括：大豆、绿豆、咖啡豆、酒、葡萄汁、调味品、草本植物、猪肾等。国际癌症研究机构将其定位2B类致癌物。赭曲霉毒素A具有很强的肾毒性，对动物的肾脏和肝脏危害最大。除特异性肾毒性以外，赭曲霉毒素A还具有致畸、致突变、致癌作用和免疫毒性，也可造成肠炎、淋巴坏疽、肝肿大等疾病。动物试验表面，赭曲霉毒素A可以累计在家畜禽体内，通过食物链对人类健康造成威胁，通过赭曲霉毒素A喂养大白鼠可引起肝癌和肾癌，此外，母亲经膳食摄入的赭曲霉毒素A可分泌至乳汁中从而影响下一代因此建立超灵敏的检测方式检测赭曲霉毒素A对人类健康有着非常重要的意义。
基于免疫学的快速筛查方法因具有通量高、检测快速、成本低等优势，近年来得到广泛的推广和应用。其中竞争酶联免疫吸附法在小分子抗原的检测中扮演了重要角色，常规竞争酶联免疫吸附法采用辣根过氧化物酶催化四甲基联苯胺显色作为信号源，这种简单的催化底物显色作为信号导致了常规竞争酶联免疫吸附法检测范围在μg/mL到ng/mL之间，远远满足不了食品污染检测pg/mL的检测要求。目前，用于提高直接竞争免疫学分析方法检测灵敏度的策略主要有两个方面：一是提高检测信号的灵敏度，如等离子共振免疫吸附法、化学发光免疫吸附法、拉曼散射免疫吸附法及荧光免疫吸附法等；二是降低竞争抗原与抗体的亲和力，如化学合成结构类似物及生物合成模拟表位等。
在传统直接竞争酶联免疫吸附法中，竞争抗原的制备是通过将小分子半抗原与载体蛋白(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)偶联。由于载体蛋白的尺寸较小，导致竞争抗原与相应抗体的亲和力较高，无法被目标物所竞争。相对于载体蛋白，纳米颗粒具有更大的尺寸和重量，在相同的温度下，其布朗运动更慢。使用纳米颗粒作为小分子半抗原的载体可以合成出亲和力更低的竞争抗原，从而更容易被目标分析物竞争，进而获得更高的检测灵敏度。此外，使用纳米材料替代蛋白作为竞争抗原的载体，有效地规避了传统化学合成或生物合成抗原类似物的局限性，如操作复杂繁琐、费时费力以及偶然性大等。基于上述技术优势，纳米颗粒的抗原载体受到了广泛的关注，然而在载体的选择方面，既应当考虑分子层面的偶联效果，同时还应当具有良好的发光特性。近年来，量子点以其宽激发、窄发射、斯托克斯位移大和耐光漂白等优良的光学特性在免疫学分析中得到了广泛应用，有研究者尝试利用量子点代替常规载体HRP、ALP，然而实际研究中发现量子点与抗原的结合效果不理想，相应的发光性能难以保证，同时由于量子点本身性质不稳定，因此易受环境影响而发生荧光淬灭，此外，由于量子点的粒径仍相对较小，因此一方面存在分离纯化不方便的问题，另一方面仍会导致竞争抗原和抗体之间亲和力过高的现象。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，以解决现有技术中针对赭曲霉毒素A的检测方法灵敏性较低的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中针对赭曲霉毒素A的直接竞争ELISA法因显色底物发光性能不佳而导致检测灵敏度较低。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术中针对赭曲霉毒素A的直接竞争ELISA法因竞争性抗原与抗体的亲和力过高而导致检测灵敏度较低。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测赭曲霉毒素A含量的方法中，量子点的发光性能难以得到保证。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测赭曲霉毒素A含量的方法中，量子点的化学稳定性较低。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点微球替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测赭曲霉毒素A含量的方法中，量子点微球与赭曲霉毒素A的偶联效果不佳。
本发明要解决的又一技术问题是以期通过量子点微球替代酶载体来执行直接竞争ELISA、以检测赭曲霉毒素A含量的方法中，量子点微球与赭曲霉毒素A偶联后导致赭曲霉毒素A的抗原抗体结合性能下降。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，该方法属于直接竞争ELISA法，其中与赭曲霉毒素A偶联的载体是标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
作为优选，包括以下步骤：
1)在酶标板上包被抗体；
2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3)将步骤2)所得产物与赭曲霉毒素A偶联，即得到竞争抗原；
4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
作为优选，步骤2)所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为15～25mg/mL、PMMA浓度为25～35mg/mL、PMAO浓度为15～25mg/mL的混合溶液，保持25～35min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为3～4mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。在此基础上进一步优选的：所述混合均匀可以是在超声震荡条件下实现的；所述固液分离可以是通过离心实现的；固液分离取固相后可以用超纯水洗涤，洗涤次数可以是三次，洗涤后的产物可以在超纯水中于4℃保存。
作为优选，所述量子点是CdSe/ZnS量子点。
作为优选，所述量子点的激发波长为450nm、发射波长为620nm。
作为优选，所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长620nm。
作为优选，氯仿的去除是利用旋蒸实现的。
作为优选，步骤3)具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与赭曲霉毒素A偶联，即得到竞争抗原。
作为优选，所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.8％～1.2％，于35～39℃反应25～35min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺3～5次，每次补加后于35～39℃反应25～35min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。在以上的优选技术方案中，为了获得高的重复性，牛血清白蛋白采用了饱和标记。在此基础上进一步优选的：补加的次数可以是4次；所述磷酸盐缓冲液的初始浓度可以是0.04～0.06mol/L，其pH可以是5.8～6.2；每次重复补加的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的量可以相等；取固相后可以用超纯水洗涤，洗涤次数可以是三次(该洗涤步骤用于去除多余的BSA)；所述碳酸氢钠溶液的pH可以是8.2～8.6；溶解于碳酸氢钠溶液中以后可以于4℃保存。
作为优选，步骤3)中的固液分离是以12000～15000rpm的转速离心8～12min。
作为优选，标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与赭曲霉毒素A之间的偶联是利用活泼酯法实现的。
作为优选，经BSA包被的标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与赭曲霉毒素A之间的偶联是利用活泼酯法实现的。
作为优选，所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、赭曲霉毒素A混合活化；收集活化后的赭曲霉毒素A，按照活化后的赭曲霉毒素A与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:8～1:12将赭曲霉毒素A与所述包被产物混合，在pH为8.4～8.8、室温条件下反应10～14h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
在以上技术方案中，为获得不同亲和力的竞争性抗原，可以通过控制赭曲霉毒素A与牛血清白蛋白包被的量子点微球上的牛血清白蛋白的摩尔比来实现，具体用量及操作条件可依据活泼酯法的一般技术常识进行适应性选择；当然，赭曲霉毒素A与牛血清白蛋白包被的量子点微球上的牛血清白蛋白之间具体标记摩尔可以比分别为5:1、1:1、1:5、1:10、1:20，优选为1:10。
作为优选，所述抗原抗体反应的条件是在35～39℃反应25～35min。
作为优选，步骤4)中竞争性抗原及待测样品的加入量均为40～60μL/孔；更优的是50μL/孔。
作为优选，经抗原抗体反应后，先用含0.05％吐温20的0.01M磷酸盐缓冲液洗涤酶标板三次，再用0.01M的磷酸盐缓冲液洗涤酶标板1次，再检测荧光强度。
在以上技术方案中，检测得到的荧光强度即用于反应待测样品中赭曲霉毒素A的含量，实际操作中可利用已知浓度且呈梯度分布的赭曲霉毒素A标准溶液，通过以上方法绘制百分荧光率(百分荧光率(％)＝F/F0×100％，其中F0为第一个标准(0标准)的荧光强度值，F为标准品或样本的荧光强度值的平均值)——赭曲霉毒素A浓度的标准曲线，再利用待测样品的荧光强度计算出相应的百分荧光率，然后从标准曲线中计算待测样品的赭曲霉毒素A含量。具体操作方法可依据本技术领域的一般技术常识进行适应性选择。上述梯度分布的赭曲霉毒素A的标准液，可以分别选择50.0pg/mL、25.0pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.13pg/mL、1.56pg/mL、0.78pg/mL、0.39pg/mL、0.19pg/mL、0.097pg/mL、0.048pg/mL、0.024pg/mL、0.012pg/mL、0pg/mL。
在以上技术方案中，各试剂在使用前可以先于室温平衡30min以上再使用。所述PMAO是马来酸酐/1-十八碳烯交替共聚物，所述PMMA是聚甲基丙烯酸甲酯，二者均可自市面购得。所述油酸基团修饰的量子点可以依据本领域的常规技术制备获得。
本方法适用于赭曲霉毒素A的定量检测，特别是适合于痕量赭曲霉毒素A的检测。样品处理可以按照本技术领域相关国标方法执行。
采用本发明技术方案具有如下有益效果：
1、本发明通过微乳液法将单个的荧光量子点包埋至聚合物微球中，制备出了发光强度更高的荧光量子点微球，其发光强度较相应的量子点提高了2800倍；此外，由于量子点包裹在微球的内部，受外界环境(溶剂、热、电、磁等)影响小，在壳结构的保护下性质更稳定，在一定程度上避免了荧光的淬灭以及微球的聚沉。同时，量子点微球的粒径约为几十到几百纳米，分离纯化较量子点简便，低转速(<10000rpm)离心就能实现常规溶液中的微球分离。
2、本发明方法通过使用油溶性量子点制备高发光的量子点荧光微球用于代替量子点直接用于常规免疫学荧光标记，大大地提高了荧光信号输出的强度，有利于提高检测灵敏度。
3、本发明方法通过使用粒径更大的量子点微球替代小的蛋白粒子作为赭曲霉毒素A的偶联载体，可以获得不同亲和力的竞争抗原，且亲和力变化范围更宽，有助于提高直接竞争免疫学分析的检测灵敏度。
4、本发明技术通过利用高发光的量子点微球替代传统酶催化的化学显色信号，减少了酶催化的步骤，因此操作更简单，检测时间更短。
本发明提供了一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，该方法利用包埋有量子点的荧光微球(Quantum dot beads,QBs)替代常规的酶载体与赭曲霉毒素A偶联，以偶联产物作为竞争抗原执行直接竞争ELISA。在技术路线中，本发明首先依据发光特性选择了适宜的量子点，进一步设计了基于荧光微球技术的量子点包埋方法，在此基础上，将量子点荧光微球经BSA包被后与赭曲霉毒素A偶联，从而得到了性能更好的竞争性抗原。
该技术方案中，荧光微球通过高聚物载体包埋了大量的量子点，因而具有更高的发光强度，可有效地提高检测的灵敏度。此外，由于量子点包裹在微球的内部，受外界环境(溶剂、热、电、磁等)影响小，在壳结构的保护下性质更稳定，在一定程度上避免了荧光的淬灭以及微球的聚沉。同时，量子点微球的粒径约为几十到几百纳米，分离纯化较量子点简便，低转速(<10000rpm)离心就能实现常规溶液中的微球分离；而且，由于荧光微球具有较大的粒径，因此可在一定程度上降低竞争抗原与包被抗体之间过高的亲和力，从而提升检测的灵敏度。
附图说明
图1是本发明方法原理示意图；
图2是本发明实施例1中赭曲霉毒素A直接酶联免疫吸附法的标准曲线；
图3是本发明实施例1中玉米样本中赭曲霉毒素A直接竞争荧光免疫学分析的标准曲线；
图4是本发明实施例1中小麦样本中赭曲霉毒素A直接竞争荧光免疫学分析的标准曲线；
图5是本发明实施例1中大米样本中赭曲霉毒素A直接竞争荧光免疫学分析的标准曲线。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
在以下试验中，磷酸盐缓冲液(PBS，0.05M，pH 7.4)的配置方法如下：NaCl 40g，Na2HPO4 13.5g，KH2PO4 1.0g，KCl 1.0g溶于1L超纯水中。用0.1M NaOH调pH值至8.0～9.0。
实施例中所涉及的鼠源性IgG类单克隆抗体：抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，由无锡中德伯尔生物技术有限公司提供，本实验所涉及的赭曲霉毒素A购买自Sigma公司。
实施例1
1、羧基修饰的量子点荧光微球
10mg油酸基团修饰后的量子点(该量子点的激发波长为450nm，发射波长为620nm)溶解在0.5mL的氯仿中，再加入15mg的聚甲基丙烯酸甲酯和10mg的1-马来酸酐聚合物，半小时后该混合液重新溶解在2.5mL的十二烷基磺酸钠水溶液中最终浓度约3.3mg/mL，该混合液在超声条件下混匀，混匀后用旋蒸的方法除去氯仿这个非极性有机溶剂后得到水溶性羧基修饰的量子点荧光微球通过离心的方式将量子点荧光微球分离下来，分离后的量子点荧光微球用超纯水洗涤三次。洗涤后的量子点荧光微球重新溶解在超纯水中4℃保存。
2、牛血清白蛋白包被的量子点微球的制备
将水溶性羧基修饰的量子点荧光微球溶解于pH 6.0，0.05mol/L磷酸盐缓冲液中，加入适量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺后，加入质量体积分数为1％的牛血清白蛋白，37℃反应半小时，半小时后继续加入等量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，重复补加四次，该牛血清白蛋白饱和包被的量子点荧光微球在14000rpm下离心10min，去掉上清后用超纯水洗涤三次去除多余的血清白蛋白，离心后的量子点荧光微球复溶在pH8.4的碳酸氢钠溶液中，4℃保存。
3、以辣根过氧化物酶为标记酶、以TMB作为显色底物的赭曲霉毒素A直接竞争酶联免疫吸附法
传统酶联免疫吸附法试剂盒用于检测玉米和玉米产品中的赭曲霉毒素A残留量时，通过以下步骤实施：样品前处理、用传统试剂盒进行检测、分析结果。
(1)样品前处理
样品前处理按国标进行。
(2)用传统酶联免疫吸附法试剂盒进行检测上述样品中赭曲霉毒素A残留量
取包被有抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；加入辣根过氧化物酶标记赭曲霉毒素A工作液，50μL/孔，用盖板膜盖板后置室温37℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；加入TMB显色液，100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应15min；加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处检测，测定每孔吸光度值(请在5min内读完数据)；对比待测样品与标准品的吸光度值大小，定量分析待测样品中的赭曲霉毒素A的残留量。
(3)分析结果
用传统酶联免疫吸附法试剂盒中的13标准品浓度10.0ng/mL、5.0ng/mL、2.5ng/mL、1.0ng/mL、0.75ng/mL、0.50ng/mL、0.25ng/mL、0.10ng/mL、0.075ng/mL、0.050ng/mL、0.025ng/mL、0.010ng/mL、0.0ng/mL。在450nm处测量吸光度值。
百分荧光率的计算，标准品或样本的百分荧光率等于标准品或样本的百分荧光值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的荧光值，再乘以100％，即百分荧光值(％)＝B/B0×100％其中B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，F0为0ng/mL标准溶液的平均荧光值。
以标准品百分荧光率为纵坐标，以赭曲霉毒素A标准品浓度(pg/mL)的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。标准曲线为y＝-31.76ln(x)+4.8387，R2＝0.9981，见附图2。该方法的IC50被定义为百分吸光度率为50％时所对应的赭曲霉毒素A的浓度。通过该标准曲线计算得IC50为0.24ng/mL。当进行实际样本检测时，将样本的百分吸光度率(B/B0×100％)值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中赭曲霉毒素A的实际浓度。
4、本发明在检测玉米、小麦及大米等样品中赭曲霉毒素A的含量的应用
直接竞争荧光免疫吸附法用于检测玉米、小麦及大米等样品中的赭曲霉毒素A残留量时，通过以下步骤实施：样品前处理、用直接竞争荧光免疫吸附法进行检测、分析结果。
(1)样品前处理
样品前处理按国标进行。
(2)用直接竞争荧光免疫吸附法进行检测上述样品中赭曲霉毒素A残留量
(3)分析结果
用直接竞争荧光免疫吸附法中的14标准品浓度50.0pg/mL、25.0pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.13pg/mL、1.56pg/mL、0.78pg/mL、0.39pg/mL、0.19pg/mL、0.097pg/mL、0.048pg/mL、0.024pg/mL、0.012pg/mL、0pg/mL在450激发620发射处测量荧光强度值。
百分荧光率的计算，标准品或样本的百分荧光率等于标准品或样本的百分荧光值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的荧光值，再乘以100％，即百分荧光值(％)＝F/F0×100％其中F为标准溶液或样本溶液的平均荧光值，F0为0pg/mL标准溶液的平均荧光值。
以标准品百分荧光率为纵坐标，以赭曲霉毒素A标准品浓度(pg/mL)的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。该方法的IC50被定义为百分荧光率为50％时所对应的赭曲霉毒素A的浓度。当进行实际样本检测时，将样本的百分荧光率(F/F0×100％)值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中赭曲霉毒素A的实际浓度。
4.1玉米样本中赭曲霉毒素A的检测
取黑色酶标板每孔加入200μL浓度为25μg/mL的蛋白G，用盖板盖盖好放入4℃冰箱中过夜(8小时)，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干，取赭曲霉毒素A单克隆抗体稀释至0.5μg/mL，加入到洗涤后的包被有蛋白G的黑色酶标板中每孔100μL，用盖板盖盖好后放入37℃反应一小时，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，洗净后的酶标板加入量子点荧光微球制备的竞争抗原，以及待检测的样品溶液各50μL/孔，在37℃孵育40分钟后用洗板工作液洗板3次，设定多功能酶标仪激发为450nm，发射为620nm处检测，测定每孔荧光强度值，对比待测样品与标准品的荧光强度值大小，定量分析待测样品中的赭曲霉毒素A的残留量。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝-24.99ln(x)+1.3156，R2＝0.9971，见附图3。通过标准曲线计算得该方法的半数抑制浓度IC50(即F/F0×100％＝50％)为0.14pg/mL。
4.2小麦样本中赭曲霉毒素A的检测
取黑色酶标板每孔加入200μL浓度为25μg/mL的蛋白G，用盖板盖盖好放入4℃冰箱中过夜(8小时)，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干，取赭曲霉毒素A单克隆抗体稀释至0.3μg/mL，加入到洗涤后的包被有蛋白G的黑色酶标板中每孔100μL，用盖板盖盖好后放入37℃反应一小时，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，洗净后的酶标板加入量子点荧光微球制备的竞争抗原，以及待检测的样品溶液各50μL/孔，在37℃孵育40分钟后用洗板工作液洗板3次，设定多功能酶标仪激发为450nm，发射为620nm处检测，测定每孔荧光强度值，对比待测样品与标准品的荧光强度值大小，定量分析待测样品中的赭曲霉毒素A的残留量。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝-18.73ln(x)+38.511，R2＝0.999，见附图4。通过标准曲线计算得该方法的半数抑制浓度IC50(即F/F0×100％＝50％)为0.47pg/mL。
4.3大米样本中赭曲霉毒素A的检测
取黑色酶标板每孔加入200μL浓度为25μg/mL的蛋白G，用盖板盖盖好放入4℃冰箱中过夜(8小时)，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干，取赭曲霉毒素A单克隆抗体稀释至0.3μg/mL，加入到洗涤后的包被有蛋白G的黑色酶标板中每孔100μL，用盖板盖盖好后放入37℃反应一小时，用洗涤工作液340μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，洗净后的酶标板加入量子点荧光微球制备的竞争抗原，以及待检测的样品溶液各50μL/孔，在37℃孵育40分钟后用洗板工作液洗板3次，设定多功能酶标仪激发为450nm，发射为620nm处检测，测定每孔荧光强度值，对比待测样品与标准品的荧光强度值大小，定量分析待测样品中的赭曲霉毒素A的残留量。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝-24.13ln(x)+22.25，R2＝0.9995，见附图5。通过标准曲线计算得该方法的半数抑制浓度IC50(即F/F0×100％＝50％)为0.5pg/mL。
结论：结合以上第3节和第4节可以发现本发明中所提到的新方法对赭曲霉毒素A残留量的检测灵敏度(IC50＝(0.14+0.47+0.5)/3pg/mL＝0.37pg/mL)比常规直接竞争酶联免疫法(IC50＝0.24ng/mL)提高了约648((0.24ng/mL)/(0.37pg/mL)＝648)倍，并且本发明方法在酶联免疫吸附试验过程中步骤简便，耗时较短，体现出用于检测的便捷性，更适合用于快速检测。
实施例2
一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，该方法包括以下步骤：
1)在酶标板上包被抗体；
2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3)将步骤2)所得产物与赭曲霉毒素A偶联，即得到竞争抗原；
4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤2)所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为15mg/mL、PMMA浓度为25mg/mL、PMAO浓度为15mg/mL的混合溶液，保持25min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为3mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
所述量子点是CdSe/ZnS量子点。
所述量子点的激发波长为450nm、发射波长为620nm。
所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长620nm。
氯仿的去除是利用旋蒸实现的。
步骤3)具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与赭曲霉毒素A偶联，即得到竞争抗原。
所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.8％，于35℃反应25min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺3次，每次补加后于35℃反应25min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。
所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、赭曲霉毒素A混合活化；收集活化后的赭曲霉毒素A，按照活化后的赭曲霉毒素A与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:8将赭曲霉毒素A与所述包被产物混合，在pH为8.4、室温条件下反应10h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
实施例3
一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，该方法包括以下步骤：
1)在酶标板上包被抗体；
2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3)将步骤2)所得产物与赭曲霉毒素A偶联，即得到竞争抗原；
4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤2)所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球是通过以下方法制备的：以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为25mg/mL、PMMA浓度为35mg/mL、PMAO浓度为25mg/mL的混合溶液，保持35min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为4mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
步骤3)具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与赭曲霉毒素A偶联，即得到竞争抗原。
所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为1.2％，于39℃反应35min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺5次，每次补加后于39℃反应35min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中。
所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、赭曲霉毒素A混合活化；收集活化后的赭曲霉毒素A，按照活化后的赭曲霉毒素A与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:12将赭曲霉毒素A与所述包被产物混合，在pH为8.8、室温条件下反应14h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
实施例4
一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，该方法包括以下步骤：
1)在酶标板上包被抗体；
2)制备标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3)将步骤2)所得产物与赭曲霉毒素A偶联，即得到竞争抗原；
4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述量子点是CdSe/ZnS量子点。
所述量子点的激发波长为450nm、发射波长为620nm。
所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长620nm。
步骤3)具体包括以下操作：利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与赭曲霉毒素A偶联，即得到竞争抗原。
所述抗原抗体反应的条件是在39℃反应35min。
实施例5
一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，该方法属于直接竞争ELISA法，其中与赭曲霉毒素A偶联的载体是标记有羧基修饰的量子点的荧光微球。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在酶标板上包被抗体；
2)以氯仿为溶剂，配制油酸基团修饰的量子点浓度为15～25mg/mL、PMMA浓度为25～35mg/mL、PMAO浓度为15～25mg/mL的混合溶液，保持25～35min，而后将取十二烷基磺酸钠水溶液与所述混合溶液混合至其中油酸基团修饰的量子点浓度为3～4mg/mL，混合均匀后去除氯仿，固液分离取固相，即得到标记有羧基修饰的量子点的荧光微球；
3)利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，将包被产物与赭曲霉毒素A偶联，即得到竞争抗原；
4)将待测溶液与所述竞争抗原加入至步骤1)包被有抗体的酶标板中，抗原抗体结合反应，而后检测酶标板的荧光强度；
步骤3)中，所述利用牛血清白蛋白包被标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，包括以下步骤：在磷酸盐缓冲液中将标记有羧基修饰的量子点的荧光微球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白混合，至溶液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.8％～1.2％，于35～39℃反应25～35min，而后补加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺3～5次，每次补加后于35～39℃反应25～35min，补加全部完成后固液分离取固相，洗涤后溶解于碳酸氢钠溶液中；
步骤3)中，所述偶联包括以下步骤：在无水四氢呋喃环境下，取二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、赭曲霉毒素A混合活化；收集活化后的赭曲霉毒素A，按照活化后的赭曲霉毒素A与所述包被产物上牛血清白蛋白二者摩尔比为1:8～1:12将赭曲霉毒素A与所述包被产物混合，在pH为8.4～8.8、室温条件下反应10～14h，收集产物，洗涤后溶解于水中。
2.根据权利要求1所述的一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，其特征在于所述量子点是CdSe/ZnS量子点。
3.根据权利要求1所述的一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，其特征在于所述量子点的激发波长为450nm、发射波长为620nm。
4.根据权利要求1所述的一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，其特征在于所述标记有羧基修饰的量子点的荧光微球，其粒径为250nm，其最大荧光发射波长620nm。
5.根据权利要求1所述的一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，其特征在于氯仿的去除是利用旋蒸实现的。
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