CN103616508A - 基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA快速检测方法和试剂盒 - Google Patents
基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA快速检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA（sandwich fluorescence-linked immunosorbent assay）快速检测方法和检测试剂盒；方法包括下列步骤：首先用2.5μg/mL的抗OTA多克隆抗体100μL包被酶标板（黑色底透）；用1×PBST200μL洗涤后，用1×BSA PBS封闭酶标板；用1×PBST200μL洗涤后，加入被检测抗原样品溶液100μL；用1×PBST200μL洗涤后，加入生物素标记的抗OTA单克隆抗体100μL；用1×PBST200μL洗涤后，加入100μL1:100稀释的量子点标记的链霉亲和素；用1×PBST200μL洗涤甩干后，用荧光分光光度计（390nm激发波长，605nm发射波长），测定相对荧光强度（RFU），根据样品的RFU代入标准曲线，得出样品的OTA含量。本发明所建立基于量子点的赭曲霉毒素AsFLISA快速检测方法，具有准确、快速、荧光稳定性好、灵敏、特异性高的特点。
Description
技术领域：
本发明属于食品安全检测技术领域的方法，涉及基于量子点标记技术的赭曲霉毒素A的sFLISA检测方法。
背景技术：
赭曲霉毒素（OA）是曲霉属和青霉属的某些菌种产生的次级代谢有毒产物，属烈性的肝脏和肾脏毒素，并具有致癌、致畸和致突变性。OA广泛存在于各种食物中，花生、谷物及其副产品是OA 的主要来源；此外，在可可、咖啡、肉类、乳汁、干果、调味品、酒类中也存在OA。这类毒素包括7种结构类似的化合物，其中毒性最大、分布最广泛、对农作物污染最严重、与人类健康关系最为密切的是赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA），OTA被证实有致癌、致畸、致突变的作用，还具有免疫抑制性，国际癌症研究机构LARC将OTA定位为2B类致癌物（即可能引起人类癌症的物质）。
OTA的产毒菌株广泛地存在于自然界中，且能经食物链进入人体，在谷类和人血清等样品中都检出过OTA残留，严重危害人类的健康。由于OTA的危害性，各国都立法对食品中OTA的残留进行限定。至今已有多个国家制定了食品（1～50μg/kg）和动物饲料（100～1000μg/kg）的OA限量标准。因此，研究灵敏度高、检测限低的快速检测方法显得尤为重要。
目前对赭曲霉毒素A的检测方法有免疫亲和柱-高效液相色谱法（IAC-HPLC）、时间分辨荧光免疫法（TRFIA）、酶联免疫法（ELISA）、免疫亲和柱-荧光光度法等。传统的检测方法存在样品前处理过程中使用多种有毒、异味有机溶剂，毒害操作人员和污染环境；试剂昂贵，成本高；检测结果重现性差，存在交叉反应而易造成假阳性等缺点。
量子点(QDs)，又称无机半导体纳米晶体，是一类由II－VI 族( 如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe 等) 或III－V 族( 如InP、InAs 等) 元素组成的纳米颗粒，是近年发展起来的一种新型荧光纳米材料。与传统有机荧光染料相比，具有很多优良的荧光性能，吸收光谱宽、发射光谱窄而对称，斯托克斯位移( Stoke’s shift) 大及较高的荧光稳定性和较长的衰减寿命。现在，量子点作为一种新型的荧光标记材料和重要的纳米材料之一，经常被用作生物标记及成像过程中的光学探针，在生物领域中的应用越来越受到关泛关注，特别是在临床诊断方法取得了长足的进展。
本发明利用多克隆抗体的强富集能力，通过量子点标记的链霉亲和素与生物素标记的OTA检测抗体相互作用的级联放大效应（亲和素与生物素互作效应），巧妙设计了一种灵敏度高、特异性强的赭曲霉毒素A三明治夹心荧光免疫检测（sandwich fluorescence-linked immunosorbent assay，sFLISA）方法，为赭曲霉毒素A在食品安全等应用领域提供技术基础和参考依据。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种赭曲霉毒素A的基于量子点标记技术的sFLISA定量检测方法，即通过量子点荧光标记的链霉亲和素-生物素之间的级联放大效应，能灵敏特异地进行赭曲霉毒素A的定量检测，以克服现有检测技术的不足。
为解决上述技术问题，本发明利用量子点多波长激发、高强度荧光发射、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好的荧光特性，提供了一种基于量子点标记的赭曲霉毒素A的检测方法，对被测物进行定量检测；主要原理是利用多克隆抗体的强富集能力，通过量子点标记的链霉亲和素与生物素标记的OTA检测抗体相互作用的级联放大效应（亲和素与生物素互作效应），设计了一种灵敏度高、特异性强的赭曲霉毒素A的sFLISA定量检测方法。
一种基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法，具体包括下列步骤：
具体包括下列步骤：
（一）兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的包被
用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为2.5μg/mL包被酶标板，每孔100μL。42℃孵育0.5 h，倒去包被液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（二）封闭
用1X BSA-PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200μL，37℃孵育2 h，倒去封闭液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（三）加待检样品
各孔加倍比稀释的标准品或待测样品各100μL，阴性对照孔加100μL的1X BSA-PBS，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（四）加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体
除试剂空白孔外，其余各孔加生物素化抗体100μL ，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（五）加量子点标记的链霉亲和素
所有各孔加100μL用TBS缓冲液稀释的适合稀释倍数的量子点标记的链霉亲和素，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（六）相对荧光强度检测
在多功能荧光酶标仪上以390nm为激发波长，605nm为发射波长，选择底读模式，测量相对荧光强度（RFU，relative fluorescence units），减去试剂空白孔的相对荧光强度，得到相对荧光强度值。
（七）建立标准曲线
根据赭曲霉毒素A浓度和相应的相对荧光强度建立了标准曲线，在0.39 μg/L～125 μg/L之间，赭曲霉毒素A浓度与相对荧光强度呈线性关系，线性回归方程为y=0.0207x+0.196（线性相关系数R2=0.9938，y为相对荧光强度，x为赭曲霉毒素A的浓度（μg/L））；根据标准曲线回归方程可计算出样品的赭曲霉毒素A的浓度。
本发明所建立基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法，能够快速地对赭曲霉毒素A进行定量检测，加标回收试验结果表明，加标回收率范围在90.1%～110%之间，变异系数均小于10%。具有较高的特异性；该方法具有快速、稳定性好、灵敏、特异高的特点，具有很好的推广应用价值。
本发明还提供了一种基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA检测试剂盒，包括：
（1）酶标板1块：包括12条，每条含有8个小孔，每个孔中均包被有兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体；
（2）稀释板1块：没有包被的12条8孔板；
（3）6瓶赭曲霉毒素A标准品浓度分别为：0、0.39、0.79、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、125 μg/L，每瓶1.5 mL；
（4）生物素标记的赭曲霉毒素A抗体：10 mL；
（5）量子点标记的链霉亲和素：10 mL。
发明所建立的基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法，具有准确、快速、荧光稳定性好、灵敏、特异性高的特点。
附图或附表说明：
图1为本发明实施例1，基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法建立的标准曲线，图中，横坐标为赭曲霉毒素A的浓度（μg/L），纵坐标为相对荧光强度（RFU）。
图2为实施例4中样品应用HPLC的检测图谱。
具体实施方式：
下面通过具体实施例并结合附图或附表进一步阐述本发明。
实施例1：基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法建立的标准曲线
（一）兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的包被
用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为2.5μg/mL包被酶标板，每孔100μL。42℃孵育0.5 h，倒去包被液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（二）封闭
用1X BSA-PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200μL，37℃孵育2 h，倒去封闭液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（三）加待检样品
各孔分别加一定稀释倍数的标准品：0.39、0.79、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、125、250、500μg/L 100μL，阴性对照孔加100μL的1X BSA-PBS，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（四）加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体
除试剂空白孔外，其余各孔加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体100μL ，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（五）加量子点标记的链霉亲和素
所有各孔加100μL用TBS缓冲液稀释的适合稀释倍数的量子点标记的链霉亲和素，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（六）相对荧光强度检测
在多功能荧光酶标仪上以390nm为激发波长，605nm为发射波长，选择底读模式，测量相对荧光强度（RFU，relative fluorescence units），减去试剂空白孔的相对荧光强度，得到相对荧光强度值。
（七）建立标准曲线
在0.39 μg/L～125 μg/L之间，赭曲霉毒素A浓度与相对荧光强度呈线性关系，推导出线性回归方程为y=0.0207x+0.196（线性相关系数R2=0.9938，y为相对荧光强度，x为赭曲霉毒素A的浓度（μg/L））。在此浓度范围内，赭曲霉毒素A浓度可进行定量分析。
实施例2：基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法的重现性试验
（一）兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的包被
用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为2.5μg/mL包被酶标板，每孔100μL。42℃孵育0.5 h，倒去包被液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（二）封闭
用1X BSA-PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200μL，37℃孵育2 h，倒去封闭液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（三）加待检样品
各孔分别加一定稀释倍数的标准品：6.25、25、50μg/L 100μL，平行重复3次，阴性对照孔加100μL的1X BSA-PBS，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（四）加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体
除试剂空白孔外，其余各孔加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体100μL ，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（五）加量子点标记的链霉亲和素
所有各孔加100μL用TBS缓冲液稀释的适合稀释倍数的量子点标记的链霉亲和素，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（六）相对荧光强度检测
在多功能荧光酶标仪上以390nm为激发波长，605nm为发射波长，选择底读模式，测量相对荧光强度（RFU，relative fluorescence units），减去试剂空白孔的相对荧光强度，得到相对荧光强度值。
（七）根据标准曲线计算赭曲霉毒素A含量
选择3个OTA浓度(6.25、25和50μg/L)，每个浓度反复测定4次。计算相对标准差分别为5.63%、2.77%、5.65%，平均相对标准差为4.68%；回收率分别为109.5%、100.6%、95.9%，平均回收率为102.0%，具有良好的重现性，具体结果见表1。
表1 方法重现性试验结果
| 浓度（μg/L） | 测定值（μg/L） | 相对标准差（%） | 回收率（%） |
| 50 | 54.73±3.09 | 5.65 | 109.5 |
| 25 | 25.14±0.70 | 2.77 | 100.6 |
| 6.25 | 5.99±0.34 | 5.63 | 95.9 |
实施例3：基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA快速检测方法的加标回收试验
（一）标样添加和OTA提取
不含OTA的1g花生粉中加入不同量的OA标准品(6.25μg/L、25μg/L、50μg/L)，密封，室温过夜。次日按每管1800μL加入甲醇(含0.01%乙酸)溶液萃取1h，10000g离心10 min后取上清液，加入等体积的PBS稀释，取100μL进行sFLISA测定，根据建立的标准曲线，推导出浓度值，计算添加回收率。
添加回收率（%）= 实测OTA含量/添加OTA含量×100%
（二）兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的包被
用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为2.5μg/mL包被酶标板，每孔100μL。42℃孵育0.5 h，倒去包被液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（三）封闭
用1X BSA-PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200μL，37℃孵育2 h，倒去封闭液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（四）加待检样品
各孔分别加待检样品 100μL，平行重复3次，阴性对照孔加100μL的1X BSA-PBS，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（五）加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体
除试剂空白孔外，其余各孔加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体100μL ，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（六）加量子点标记的链霉亲和素
所有各孔加100μL用TBS缓冲液稀释的适合稀释倍数的量子点标记的链霉亲和素，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干。
（七）相对荧光强度检测
在多功能荧光酶标仪上以390nm为激发波长，605nm为发射波长，选择底读模式，测量相对荧光强度（RFU，relative fluorescence units），减去试剂空白孔的相对荧光强度，得到相对荧光强度值。
（七）根据标准曲线计算赭曲霉毒素A含量
通过加标回收的结果，见表2，建立的sFLISA 能够对3个不同浓度的赭曲霉毒素A进行准确的测定，回收率范围在90.1%～110%之间，变异系数均小于10%。表明该方法可用于赭曲霉毒素A的定量检测。
表2 样品添加回收试验结果
| 添加量（μg/kg） | 检测结果（μg/kg） | 回收率（%） | 变异系数（%） |
| 6.25 | 5.63±0.43 | 90.1 | 7.63 |
| 25 | 24.56±0.56 | 98.2 | 2.29 |
| 50 | 54.94±1.30 | 110 | 2.36 |
实施例4：基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA检测方法和检测试剂盒对花生样品检测
（一）样品OTA提取
花生样品买自青岛市团岛市场。
10g花生粉，次日按每管18 mL加入甲醇（含0.01%乙酸）溶液萃取1h，10000g离心10 min后取上清液，加入等体积的PBS稀释，分别取100μL进行sFLISA和HPLC测定，重复3次，比较结果的显著性差异。
利用本发明的检测方法和试剂盒进行sFLISA检测。
利用HPLC进行色谱检测，色谱条件：色谱柱：Hypersil C18 ( 150 mm×4.6 mm，3 μm)；柱温：室温；流动相：乙腈/水/乙酸( 99/99/2，体积比)；流速：0.4 mL/min；进样量：20 μL；激发波长：333 nm；发射波长：477 nm。
（二）结果分析
根据图2和表3，实测花生样品结果表明，应用本发明获得的OTA检测结果为6.98±0.12 μg/kg，HPLC检测结果为7.10±0.13 μg/kg，无显著性差异,。
表3 花生试验结果
| 检测方法 | 检测结果（μg/kg） | 变异系数（%） |
| 本发明 | 6.98±0.12 | 1.7 |
| HPLC | 7.10±0.13 | 1.8 |
Claims (2)
1.一种基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA快速检测方法，其特征在于：兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体作为捕获抗体，生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体作为检测抗体，量子点标记的链霉亲和素作为荧光探针，通过亲和素-生物素之间的级联放大效应，能灵敏特异地进行赭曲霉毒素A的定量检测，与黄曲霉毒素B1等无交叉反应；
具体包括下列步骤：
（一）兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的包被
用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为2.5μg/mL包被酶标板，每孔100μL，42℃孵育0.5 h，倒去包被液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干；
（二）封闭
用1× BSA-PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200μL，37℃孵育2 h，倒去封闭液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干；
（三）加待检样品
相应孔加一定稀释倍数的标准品或待测样品100μL，阴性对照孔加100μL的1× BSA-PBS，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干；
（四）加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体
除试剂空白孔外，其余各孔加生物素化抗体100 μL ，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3 min/次，甩干；
（五）加量子点标记的链霉亲和素
所有相应孔加100 μL用TBS缓冲液1:100稀释的量子点标记的链霉亲和素，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干；
（六）相对荧光强度检测
在多功能荧光酶标仪上以390nm为激发波长，605nm为发射波长，选择底读模式，测量相对荧光强度（RFU，relative fluorescence units），减去试剂空白孔的相对荧光强度，得到相对荧光强度值；
（七）建立标准曲线并计算待测样品中的赭曲霉毒素A的浓度
根据赭曲霉毒素A浓度和相应的相对荧光强度建立了标准曲线，在0.39 μg/L～125 μg/L之间，赭曲霉毒素A浓度与相对荧光强度呈线性关系，线性回归方程为y=0.0207x+0.196（线性相关系数R2=0.9938，y为相对荧光强度，x为赭曲霉毒素A的浓度（μg/L））；根据标准曲线回归方程可计算出样品的赭曲霉毒素A的浓度。
2.一种基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA检测试剂盒，包括：
（1）酶标板1块：包括12条，每条含有8个小孔，每个孔中均包被有兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体；
（2）稀释板1块：没有包被的12条8孔板；
（3）6瓶赭曲霉毒素A标准品浓度分别为：0、0.39、0.79、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、125 μg/L，每瓶1.5 mL；
（4）生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体：10 mL；
（5）量子点标记的链霉亲和素：10 mL。
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