CN105510595A

CN105510595A - 基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒及其使用方法

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Publication number: CN105510595A
Application number: CN201510860835.9A
Authority: CN
Inventors: 邹检平
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2016-04-20

Abstract

本发明基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒及其使用方法，涉及一种利用生物特有的结合方法的测定试剂盒及其使用方法，特别是涉及一种用于检测人血清中VEGF浓度的利用生物特有的结合方法的测定试剂盒及其使用方法。其目的是为了提供一种操作简单、灵敏度高、特异性强的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒包括VEGF单抗、生物素标记的VEGF抗体和链霉亲和素标记的量子点CdTe；本发明的制备方法包括：单抗包被；加样；加生物素标记的抗体；加链霉亲和素标记的量子点；检测。本发明的试剂盒检测使用方便、灵敏度高、特异性强。本发明用于体外免疫检测领域。

Description

基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种利用生物特有的结合方法的测定试剂盒及其使用方法，特别是涉及一种用于检测人血清中VEGF浓度的利用生物特有的结合方法的测定试剂盒及其使用方法。

背景技术

恶性肿瘤是威胁全球包括我国人民健康生活的一大主要疾病。卫生部资料显示，2008年癌症首次成为我国城镇和乡村死亡原因的首位。早发现、早诊断、早治疗是我国肿瘤的防治方针，为更好的贯彻该方针，科学界一直在努力寻找新的肿瘤标志物，包括广谱肿瘤标志物和组织器官特异性肿瘤标志物。其中，VEGF就是近年来肿瘤学界较为公认的最具应用前景的肿瘤筛查、辅助诊断、预后和疗效评价的标志物。

肿瘤的生长和转移依赖于新血管的生成，而肿瘤新血管的生成是在肿瘤血管生成刺激因子和抑制因子的共同调控下进行的。血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是肿瘤血管新生中最重要的刺激因子。1971年由Folkman首次提出，快速生长的肿瘤组织如果没有新血管生成(Angiogenesis)以供应营养和养分，其直径不会超过1-3(mm)3。后来由其本人总结了Folkman理论，它揭示了肿瘤的生长和转移依赖与血管生成(Angiogenesis)的原理：一方面,肿瘤在原位生长时必须依赖血管生成；另一方面,肿瘤的转移同样需要血管生成来提供足够的氧气和营养成分(FolkmanJ.NatlCancerInst.1990；82:4-6)。1994年，Kondo等人首次报道了癌症病人血清VEGF水平高于正常对照组，并提出VEGF可能是肿瘤的一种广谱血液学标志物(KondoSetal.BiochimBiophysActa，1994,1221(2)：211-214)，目前已得到科学界的认同。

血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一个分子量为45kDa的高度糖基化的碱性蛋白，是由两条相同的肽链组成的同型二聚体，等电点为8.5，具有很强的促进血管内皮细胞(Vascularendothelialcells)分裂繁殖以及增强毛细血管通透性的能力，可由肾脏细胞、肌肉细胞等正常组织细胞产生和分泌，也可由多种肿瘤细胞产生。它最早是在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中纯化出来的，由于能够有效地刺激内皮细胞有丝分裂和极强地诱导血管生成而得名(FerraraN.EuropeanJournalofCancer,1996,32(14):2413-2422)。

人类VEGF基因定位于人类基因组6p21.3位，全长14Kb，由8个外显子和7个内含子构成，通过基因转录的mRNA不同剪接方式(Alternativesplicing)，编码4种主要异构体，它们为VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206。VEGF121、VEGF145和VEGF165为分泌型血管内皮生长因子，而VEGF183、VEGF189和VEGF206为基质结合型蛋白。血液中检测到的主要是VEGF165和VEGF121，而VEGF206、VEGF189的含量很低。VEGF165是最主要的异构体，也是生理活性最强的VEGF异构体(HouckKAetal.MolEndocrinol.1991；5:1806-1814)。

VEGF是癌症生长、转移所必需的一种因子。大量的研究表明，在人类各种恶性肿瘤疾病中，VEGF的分泌增加有着普遍性和广泛性，即当人体内有恶性肿瘤生长时，VEGF分泌就会大大增加，并释放进入血液循环；而正常人血清中VEGF水平维持在较低水平，明显低于肿瘤病人。因此，检测人血清中VEGF含量，能够用于癌症病人的早期筛查和诊断。另一方面，VEGF在人体血液中的浓度随肿瘤的消长情况而变化。肿块大、生长快时，VEGF在人体血液的浓度就高；化疗手术治愈后，VEGF血液浓度会显著降低。故VEGF的检测可作为疗效观察和预后的指标。另外，VEGF血液浓度升高亦见于糖尿病、血管炎性疾病和妊娠等。

目前，ELISA是VEGF血液检测最常用的一种方法。Houck等人(JBiol.Chem.1992，267(36):26031-26037)报道了以比色法为基础的检测VEGF的ELISA方法，但其检测灵敏度仅为ng/mL。

生物素－亲合素系统(Biotin-Avidin—System，BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。BAS在实际应用中所具有的巨大优越性，主要表现在以下几个方面。1.灵敏度：生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。2.特异性：亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。3.稳定性：亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。4.普适性：生物素-结合素系统的多功能性还能提供一套统一的研究方法。例如对于某待测分子，已经得到了对于该分子的生物素标记抗原，那么配合结合亲和素的胶体金可以在电镜下观测，配合结合荧光标记的亲和素可以使用流式细胞仪筛选，配合连接到酶的亲和素可以进行ELISA等免疫组化实验。

纳米量子点(quantumdot，QD)是一种由II-VI族或III-V族元素组成的稳定的、溶于水的、尺寸在2-20nm之间的纳米晶粒。目前研究较为多的是CdS、CdSe、CdTe、ZnS等。近年来，半导体量子点由于其独特的性质越来越受到人们的重视，其研究内容涉及物理、化学、材料、生物等多学科，已成为一门新兴的交叉学科。

量子点由于粒径很小，电子和空穴被量子点限域，连续能带变为具有分子结构的分立能级结构。因此光学行为与一些大分子很相似，可以发射荧光。与传统的荧光染料相比，量子点有很多优点：1)光稳定性好，无机微晶能够承受多次的激发和光发射，而有机分子却会分解，持久的稳定性可以让研究人员有更长的观察时间。2)激发光谱范围宽、发射光谱范围窄而对称，从紫外线到红光，量子点具有广泛的激发光谱范围，可以同时使用不同光谱特性的量子点，而发射光谱不出现重叠。3)量子点具有丰富的颜色。4)stokes位移大，背景噪声小。因此，纳米量子点作为一种新型的荧光标记材料，在生物领域中的应用越来越受到了广泛的关注，特别是在临床诊断方法取得了长足的进展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、灵敏度高、特异性强的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒及其使用方法。

本发明基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒包括：VEGF单抗、生物素标记的VEGF抗体和链霉亲和素标记的量子点CdTe；

所述生物素标记的VEGF抗体为单抗或者多抗。

进一步，本发明基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，所述生物素标记的VEGF抗体按以下步骤制备：

一、将待标记抗体用0.1mol/L、pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L、pH8.6的硼酸缓冲液稀释到1mg/mL；

二、使用步骤一中选择的缓冲液作为透析液对步骤一制得的抗体溶液充分透析；每隔3小时更换一次透析液；

三、用1mLDMSO溶解1mgNHSB；向1mL步骤二透析后的抗体溶液(即含抗体1mg)中加入120uLNHSB溶液(即含NHSB120ug)；在室温下搅拌2-4h；

四、加入4.8uL1mol/LNH₄Cl(每25ugNHSB加1uL)，在室温下搅拌10分钟；

五、在4℃，用PBS充分透析，以除去游离的生物素；

六、将样品上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集洗脱液1mL/管，抗体在1-3mL之间洗下；

七、向样品中加入叠氮钠及BSA，即制得生物素标记的VEGF抗体；将所得产物置4℃，避光保存，亦可加入50％重蒸甘油，置-20℃保存；

所述步骤七中加入叠氮钠的量为终浓度0.5g/L，加入BSA的量为终浓度1.0g/L。

进一步，本发明基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，所述链霉亲和素标记的量子点CdTe按以下步骤制备：

一、量子点的制备：用1molLNaOH溶液将100mL含巯基丙酸的CdCl₂溶液的pH值调节为11.2，，用高纯N₂将溶液在密闭体系中脱氧、保护；边搅拌边向溶液中加入新制备的无氧NaHTe溶液(通过Te粉和硼氢化钠反应制备)，将反应液加热到96℃，回流2小时，即可得到尺度较为均一的CdTe纳米粒子溶液，无需进行尺度分离；

二、链霉亲和素(SA)标记：在含PBS的磷酸缓冲液中，将步骤一制得的量子点溶液0.6mg(即水溶性的表面包覆巯基乙酸的CdTe纳米粒子的溶液)0.6mg和250uLEDC溶液混合，然后加入0.12mg的链霉亲和素(SA)，室温下搅拌反应3h后，上SephadexG100层析柱，用PBS洗脱，分离纯化得到量子点标记的链霉亲和素(QDs-SA)；

其中，所述步骤一中CdCl₂溶液中CdCl₂·2.5H₂O含量为10mmol；CdCl₂溶液中巯基丙酸的量为：添加巯基丙酸至溶液呈乳白色；

所述步骤二中的磷酸缓冲液中PBS的浓度为0.1mol/L，pH为8.5；

所述EDC溶液的浓度为8.7g/L；

所述用于洗脱的PBS的浓度为0.1mol/L，pH为7.4。

进一步，本发明基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，还包括标准品、封闭保护液、洗涤液、样品稀释液、终止液和酶联反应板。

本发明基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

一、单抗包被：以酶联反应板为固体支持物，将VEGF单抗包被于酶联反应板上，并用封闭液进行封闭；

二、加样：将生物标本中的VEGF与酶联反应板上的VEGF抗体进行充分接触和结合后，洗板，除去未结合的生物标本；

三、加生物素标记的抗体：加入生物素标记的VEGF单抗或者多抗于上述酶联反应板中，37℃保温一段时间，使抗原抗体充分结合；洗板，除去未结合的VEGF单抗或者多抗；

四、加链霉亲和素标记的量子点：向上述酶联反应板中加入链霉亲和素标记的量子点CdTe，37℃保温一段时间，使生物素和亲和素充分结合；洗板，除去未结合的亲和素标记的量子点；

五、检测：利用荧光酶标仪检测量子点荧光强度。

进一步，本发明基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，所述单抗包被的操作步骤如下：根据预实验确定的单抗包被浓度，将单抗用包被液稀释至合适浓度(2ug/mL)；按200uL/孔加入到反应孔中，4℃放置保存20h；用PBST洗板一次，200uL/孔加入封闭保护液进行封闭，避光室温放置3h；风干后即可用于样品检测。

进一步，本发明基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，所述加样的操作步骤如下：以VEGF冻干品为标准品，用样品稀释液进行梯度稀释为：800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL；以样品稀释液为阴性对照；将待检样品、标准品稀释液及样品稀释液均按200uL/孔加入到反应孔中，37℃温育1h，VEGF与包被单抗结合形成抗体-抗原复合物；用PBST洗板五次。

进一步，本发明基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，所述加生物素标记的抗体的操作步骤如下：根据预实验确定的标记抗体的稀释度进行稀释(不同批次抗体不同厂家酶联反应板需要棋盘滴定法确定最终浓度)；按200uL/孔加入反应孔内，37℃温育30min，标记抗体与VEGF结合，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物；用PBST洗板五次。

进一步，本发明基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，所述加链霉亲和素标记的量子点中，加入链霉亲和素标记的量子点CdTe溶液的量为100ul/孔；保温时间为30min；洗板为使用PBST洗板五次。

进一步，本发明基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，所述检测中激发波长为430nm；发射波长为545nm。

本发明的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒及其使用方法与现有技术不同之处在于：本发明的基于荧光量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，是以荧光量子点CdTe作为标记物，根据双抗体夹心免疫吸附测定原理和生物素与亲和素之间的结合作用，定量检测人血清中vegf的试剂盒。本发明准确迅速，简单，灵敏度高，不需要特殊设备，易于推广。

附图说明

图1为本发明的试剂盒中抗体生物素化标记的原理图；

图2为实施例3中VEGF的标准曲线。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒及其使用方法作进一步的说明。

实施例1

本实施例基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒按以下步骤制备：

一、VEGF单抗的制备与纯化

所需材料：成年BALB/c小鼠、液体石蜡、处于对数生长期的杂交瘤细胞。

方法：

1)腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5mL。

2)7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/0.2mL。

3)间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10mL腹水；

4)将腹水离心(2000r/min5分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-70℃冻存备用，或冻干保存。

5)在单抗使用前，将小鼠腹水利用辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化，主要步骤如下：取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/LPH5.0醋酸缓冲液，用1mol/LHCl调PH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125um)，加入1/10体积的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH调PH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS(含137mmol/LNaCl，2.6mol/LKCl，0.2mmol/LEDTA)中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。

二、VEGF多克隆抗体的制备和纯化

用家兔作为免疫动物，先用5-10mg卡介苗注射刺激动物。一周后，将VEGF蛋白制成福氏安全佐剂，采用皮下注射进行第一次免疫。2周后，进行第二次免疫。2周后，抽血测效价，若效价偏低，则进行加强免疫。采集家兔全血，离心取血清。利用正辛酸—硫酸铵沉淀法和DEAE离子交换纯化，所得抗体溶液达98％以上。

三、VEGF多抗的生物素标记(其原理如图1所示，其中，1为N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)，2为解离的N-羟基琥珀酰亚胺，3为具有伯胺的分子，4为被标记生物素的分子)

1)将待生物素化的蛋白质用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH8.6)稀释到1mg/mL。

2)交互用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH8.6)，对抗体溶液充分透析；

3)用1mLDMSO溶解NHSB1mg；向1mL抗体溶液(即含抗体1mg)加入120ulNHSB溶液(即含NHSB120ug)；在室温下持续搅拌，保温2-4小时；

4)加入9.6ul1mol/LNH₄Cl(每25ugNHSB加1uL)，在室温下搅拌10分钟；

5)在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素；

6)将样品上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管，抗体在1-3mL之间洗下；

7)最后，样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/LBSA。将结合产物置4℃，避光保存，亦可加入50％重蒸甘油，置-20℃保存。

四、量子点的链霉亲和素标记

1)量子点的制备：用1mol/LNaOH溶液将含有巯基丙酸(为稳定剂)的CdCl₂溶液的pH值调节为11.2，用高纯N₂将溶液在密闭体系中脱氧、保护。在适当的搅拌速度下，向溶液中加入新制备的无氧NaHTe溶液(通过Te粉和硼氢化钠反应制备)，将反应液加热到96℃，回流2小时，即可得到尺度较为均一的CdTe纳米粒子溶液，无需进行尺度分离((试验中比例为Cd：Te：巯基丙酸＝1:0.5:2.4))。CdCl₂溶液中CdCl₂·2.5H₂O含量为10mmol；加入巯基丙酸的量为：添加巯基丙酸至溶液呈乳白色。

2)链霉亲和素(SA)标记：在磷酸缓冲液(PBS0.1mol/L,pH＝8.5)中,将水溶性的表面包覆巯基乙酸的CdTe纳米粒子0.6mg和250uL8.7g/LEDC混合，并向其加入0.12mg的链霉亲和素(SA)，室温下搅拌反应3h后，上SephadexG100层析柱，用PBS(0.1mol/L,pH＝7.4)洗脱，分离纯化得到量子点标记的链霉亲和素(QDs-SA)。

3)活性检测：利用绘制SA和包被于磁性粒子上的SA对B-HRP的竞争抑制曲线方法。具体步骤如下：

a制备不同浓度的标准SA溶液,其浓度梯度为12.0、6.0、3.0、1.0、0.5和0.25mg/L；

b将50L不同浓度的标准SA溶液和30L包被SA的磁性粒子混合,加入50LB-HRP,在摇床上25℃反应30min，SA和磁性粒子上的SA竞争结合B-HRP,用PBS洗涤液洗3次；

c加入100LTMB和100LH2O2(0.03％)，室温下显色反应10min，再加入100L1mol/LH₂SO₄终止反应；

d外加磁场分离，用紫外分光光度计测定上清液450nm处的吸光值，并绘制吸光A450对标准SA液的质量浓度曲线，即为SA和包被于磁性粒子上的SA对BHRP的竞争抑制标准曲线；

e将上述制备的QDs-SA标记溶液用PBS倍比稀释，分别取50ul用上述同样的方法测定OD值，并根据测得的吸光值(A450)从上面得到的竞争抑制标准曲线上，计算量子点上连接SA的量。

实施例2

本实施例的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法包括以下步骤：

一、VEGF单抗的包被：根据预实验确定的单抗包被浓度，将单抗用包被液稀释至合适浓度；200ul/孔加入到反应孔中，4℃放置保存20h。用PBST洗板一次，200ul/孔加入封闭保护液进行封闭，避光室温放置3h。风干后用于样品检测。

二、加样：以VEGF冻干品为标准品，用样品稀释液进行梯度稀释为：800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL；以样品稀释液为阴性对照；将待检样品、标准品稀释液及样品稀释液200ul/孔加入到反应孔中，37℃温育1h，VEGF与包被单抗结合形成抗体-抗原复合物；用PBST洗板五次。

三、加生物素标记的VEGF抗体：根据预实验确定的标记抗体的稀释度进行稀释；200ul/孔加入到洗好的反应孔内，37℃温育30min，标记抗体与VEGF结合，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物；用PBST洗板五次。

四、显色：200ul/孔向反应孔中加入链霉亲和素标记的量子点CdTe溶液，37℃温育30min，用PBST洗板五次。

五、检测：利用荧光酶标仪检测量子点荧光强度，激发波长：430nm；发射波长：545nm，通过与标准品对比计算得到样品中VEGF浓度。

六、分析性能和稳定性实验：

1、外观：微孔板完整、清洁，无异物污染，液体组分应澄清，无沉淀或絮状物。

2、最低检出限：VEGF标准品的最低检出限≤6.25pg/mL。

3、精密性：批内精密性CV(％)不高于10％(n≥20)，批间精密性CV(％)不高于10％(n≥10)。

4、准确性：回收率大于90％～110％之间。

5、线性范围：在(6.25～800)pg/ml线性范围内，依据校准品各测量荧光值与浓度拟合双对数直线回归方程，r≥0.9900。

6、稳定性：2～8℃储存，有效期为12个月。

7、特异性：加入20ug/mL的人成纤维细胞生长因子2(FGF2)和30ng/mL表皮生长因子(EGF)，测定结果≤50pg/ml。

实验例3

本实验采用双抗体夹心量子点(QDs)法实验原理，在微孔包被板中预包被血管内皮生长因子单克隆抗体，加入标记抗体(生物素标记的VEGF抗体和链霉亲)和量子点溶液(链霉亲和素标记的量子点CdTe溶液)，利用荧光酶标仪检测荧光强度，从而确定血管内皮生长因子(VEGF)的浓度。

1、选择637例临床实验样本，其中肾癌56例、胰腺癌56例、子宫内膜癌51例、膀胱癌64例、白血病40例、脑部肿瘤38例、结直肠癌52例、前列腺癌32例、宫颈癌27例、甲状腺癌17例、卵巢癌21例、胆管癌3例、胆囊癌2例、食管癌10例、恶性滋养细胞瘤5例、淋巴瘤3例、多发性骨髓瘤8例、骨癌3例、脊柱癌2例、喉癌2例、绒毛膜上皮癌3例、葡萄胎3例、牙龈癌2例、胸腺癌2例、嗜铬细胞瘤1例、输尿管癌1例、肝血管内皮瘤1例、鼻腔、鼻窦恶性肿瘤1例；正常人125例，排除女性月经期、溶血、黄疸、血脂高、类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、银屑病、创伤、心肌梗死及其它心脏疾病、血管炎、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、结节病、慢性肾炎、肾血管疾病等，共计637例。

2、VEGF标准线性方程为y＝0.73392+3.0487，标准曲线见图2。

3、VEGF标准曲线线性关系良好，相关系数r＝0.9998；该实验的重复性好，批内和批间CV分别为3.4％和7.8％(如图2所示)。

4、肿瘤组VEGF检测浓度明显高于正常对照组。两组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)，如表1所示。

表1两组血清VEGF检测值统计表

5、VEGF在不同种类肿瘤患者血清中的表达分析肾癌、脑癌、膀胱癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、白血病VEGF检测含量的阳性率见表2。(VEGF的诊断标准为6.25～142.2pg/ml为阴性，≥142.2pg/ml为阳性。)

表2各肿瘤中VEGF含量的阳性率

在非常见肿瘤中VEGF在骨髓瘤(6/8)，卵巢癌(14/21)，恶性滋养细胞肿瘤(1/5)，宫颈癌(14/27)，食管癌(5/10)，绒毛膜上皮癌(2/3)，胸腺癌(2/2)，喉癌(1/2),鼻窦癌(1/1)等中均有不同程度表达。但因其临床发病率较低，试验期间样本量较少而无统计学意义。

6、VEGF临床性能指标统计学分析结果

根据637例不同肿瘤样本及正常人对照样本的检测结果构建四格表，统计肿瘤组和正常人对照组的灵敏度、特异性等临床评价指标见表3。通过统计结果看VEGF区分肿瘤人群和正常人群的能力不低于其他广谱肿瘤标记物，具有一定筛查意义。

表3VEGF的临床指标统计表

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，其特征在于：包括VEGF单抗、生物素标记的VEGF抗体和链霉亲和素标记的量子点CdTe；

所述生物素标记的VEGF抗体为单抗或者多抗。

2.根据权利要求1所述的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的VEGF抗体按以下步骤制备：

二、使用步骤一中选择的缓冲液作为透析液对步骤一制得的抗体溶液充分透析；

三、用1mLDMSO溶解1mgNHSB制得NHSB溶液；向1mL步骤二透析后的抗体溶液中加入120uLNHSB溶液；在室温下搅拌2-4h；

四、加入1mol/L的NH₄Cl，在室温下搅拌10分钟；

五、在4℃用PBS充分透析，以除去游离的生物素；

六、将样品上分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集洗脱液；

七、向样品中加入叠氮钠及BSA，即制得生物素标记的VEGF抗体；

所述步骤四中加入NH₄Cl的量为每25ugNHSB加1uLNH₄Cl；

3.根据权利要求1所述的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，其特征在于：所述链霉亲和素标记的量子点CdTe按以下步骤制备：

一、量子点的制备：用0.1mol/LNaOH溶液将100mL含巯基丙酸的CdCl₂溶液的pH值调节为11.2，用高纯N₂将溶液在密闭体系中脱氧、保护；边搅拌边向溶液中加入新制备的无氧NaHTe溶液，将反应液加热至96℃，回流2小时，即可得到CdTe纳米粒子溶液；

二、链霉亲和素(SA)标记：在含PBS的磷酸缓冲液中，将步骤一制得的量子点溶液0.6mg和250uLEDC溶液混合，然后加入0.12mg的链霉亲和素，室温下搅拌反应3h后，上SephadexG100层析柱，用PBS洗脱，分离纯化得到量子点标记的链霉亲和素；

其中，所述步骤一中CdCl₂溶液中CdCl₂·2.5H₂O含量为10mmol；

所述步骤二中的磷酸缓冲液中PBS的浓度为0.1mol/L，pH值为8.5；

所述EDC溶液的浓度为8.7g/L；

所述用于洗脱的PBS的浓度为0.1mol/L，pH为7.4。

4.根据权利要求1所述的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，其特征在于：还包括标准品、封闭保护液、洗涤液、样品稀释液、终止液和酶联反应板。

5.一种基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

三、加生物素标记的抗体：加入生物素标记的VEGF单抗或者多抗于上述酶联反应板中，使抗原抗体充分结合；洗板，除去未结合的生物素标记的VEGF单抗或者多抗；

四、加链霉亲和素标记的量子点：向上述酶联反应板中加入链霉亲和素标记的量子点CdTe，温育，使生物素和亲和素充分结合；洗板，除去未结合的亲和素标记的量子点；

五、检测：利用荧光酶标仪检测量子点荧光强度。

6.根据权利要求5所述的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述单抗包被的操作步骤如下：将单抗按照200uL/孔加入到反应孔中，4℃放置20h；用PBST洗板，按200uL/孔加入封闭保护液进行封闭，避光室温放置3h。

7.根据权利要求5所述的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述加样的操作步骤如下：以VEGF冻干品为标准品，用样品稀释液进行梯度稀释为：800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL；以样品稀释液为阴性对照；将待检样品、标准品稀释液及样品稀释液均按200uL/孔分别加入到反应孔中，37℃温育1h；用PBST洗板五次。

8.根据权利要求5所述的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述加生物素标记的抗体的操作步骤如下：将抗体按200uL/孔加入反应孔内，37℃温育30min；用PBST洗板五次。

9.根据权利要求5所述的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述加链霉亲和素标记的量子点中，加入链霉亲和素标记的量子点CdTe溶液的量为100ul/孔；温育为37℃保温30min；洗板为使用PBST洗板五次。

10.根据权利要求5所述的基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述检测中量子点的激发波长为430nm；发射波长为545nm。